专利名称：砀山酥梨果实单果重主效qtl的分子标记及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于分子遗传育种领域，提供了 ‘砀山酥梨’果实单果重主效QTL的分子标 记及其应用，可用于梨果实单果重性状的早期分子辅助选择，以提高育种效率。
背景技术：
梨(Pyrus L.)原产我国，是我国第三大果树树种。梨因其果实营养价值高，香甜 多汁，而深受消费者喜爱。梨果个大小即通常所说的单果重，是梨果实外观品质和商品性状 的重要指标之一，也是构成梨品种产量和经济效益的重要因素，因此，梨果实单果重的大小 对梨品种至关重要。培育具有理想单果重的品种已经成为梨育种的重要目标之一。由于梨为多年生木本果树作物，与果实品质相关的性状大都是由多基因控制、易 受环境影响的数量性状，在分离后代表现为广泛的表型变异，其基因型与表现型间的对应 关系难以确定。而以往的传统育种是基于经典数量遗传学理论，把控制某一性状的多个基 因作为整体进行研究和选择，在现有基础上改良目标性状难度越来较大。近年来，随着分子 标记技术的迅速发展、高密度的分子遗传图谱的出现，以及数量性状作图方法的不断完善， 使得数量性状基因座(Quantitative trait loci, QTL)定位变成了现实，也为提高目标数 量性状优良基因型选择的可能性、准确性及预见性奠定了基础。利用分子标记定位数量性 状QTL，其实质就是分析分子标记与目标性状QTL之间的连锁关系，即利用已知座位的分子 标记来定位未知座位的QTL，通过计算分子标记与QTL之间的交换率，来确定QTL的具体位 置。基于获得的标记基因型分离与数量性状的量之间的关系，可直接把握数量性状基因，并 开发可应用于分子标记辅助选择(Molecular-assisted selection,MAS)育种的技术，这已 在许多重要农作物上取得了成功应用。目前有关梨数量性状的QTL定位研究仍属起步阶段，已有的研究主要是针对一些 病害或生长性状，对重要性状梨单果重的QTL定位及分子标记的研究尚没有开展。因此，开 展梨果实单果重主效基因的QTL定位，筛选紧密连锁的分子标记，建立杂交后代早期辅助 选择技术体系，对于提高梨果单果重品质改良效率，缩短育种进程，节约生产成本显得尤为重要。
发明内容
本发明的目的在于提供一种‘砀山酥梨’果实单果重主效QTL的分子标记。本发明的另一目的在于提供一种‘砀山酥梨’果实单果重主效QTL的分子标记引 物。本发明的另一目的在于提供一种‘砀山酥梨’果实单果重主效QTL的分子标记方法。本发明的又一目的在于提供一种‘砀山酥梨’果实单果重主效QTL的分子标记在 梨分子育种中的应用。本发明定位梨果实单果重主效QTL，并提供与QTL位点紧密连锁的分 子标记，通过检测这些分子标记可以预测梨果实单果重，为实现对该性状的早期鉴定和筛选提供分子辅助选择技术支持。本发明的目的通过以下技术方案实现一种‘砀山酥梨’果实单果重主效QTL的分子标记，是通过下列步骤获得a)利用梨品种‘八月红’梨和‘砀山酥梨’杂交获得F1后代单株；b)用SSR、SRAP和AFLP三种分子标记方法分析两个亲本及其F1群体，统计分析在 亲本间具有多态性的位点在后代群体中的遗传类型。获得多态性标记位点，然后对其进行 连锁分析，构建‘砀山酥梨’的遗传连锁图谱。可采用Joinmap3.0作图软件对所获得的多 态性标记位点进行连锁分析。c)对‘八月红’和‘砀山酥梨’杂交后代的F1群体单株的果实单果重进行测定， 利用区间作图法(可利用MapQTL5.0作图软件)，将？工群体每个单株的果实单果重与‘砀 山酥梨’遗传连锁图谱中的分子标记进行连锁和QTL分析，以LOD值> 2. 5为标准，大于 2. 5说明存在一个QTL位点，在母本‘砀山酥梨’的第7连锁群上检测到单果重的QTL位 点Pfw-I，其LOD值为4. 24，是主效QTL，距离最近的一个SRAP分子标记为fe;3em4-242p*， 大小为M2bp JgPfV-I的距离为OcM，该标记可以作为梨果实单果重的标记，所筛选的 分子标记 fe!3em4-M2p* 的 SRAP 引物为 fe3 5 ' -GTGCTTTACTGTTTGCTCC-3 ‘和 em4 5' -GACTGCGTACGAATTTGA-3‘。上述的‘砀山酥梨’果实单果重主效QTL的分子标记，其所述QTL位点PfV-I位于 ‘砀山酥梨’第13连锁群上，其解释48. 8%的单果重特征。一种‘砀山酥梨’果实单果重主效QTL的SRAP分子标记引物，其特征在于该引物 序列为fe3:5' -GTGCTTTACTGTTTGCTCC-3‘禾Π em4 :5' -GACTGCGTACGAATTTGA-3‘。一种‘砀山酥梨’果实单果重主效QTL的分子标记方法，用梨基因组DNA，采用SRAP 引物 fe3:5' -GTGCTTTACTGTTTGCTCC-3 ‘禾Pem4:5' -GACTGCGTACGAATTTGA-3 ‘扩增，扩 增产物在8%非变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离，如果获得一个分子标记大小为M2bp，则 表明与梨果实单果重的主效QTL位点相连锁的分子标记存在，该QTL位点PfV-I位于‘砀 山酥梨’第13连锁群上，其解释48. 8%的单果重特征。其PCR扩增体系为总体积20ul 其 中包含 0. 2mmol · L—dNTP，0. 3 μ mol · Γ1 上下游引物，2. Ommol · I^MgCl2,1 个单位的 daq 酶，DNA 模板 50ng, IXBuffer ；PCR 反应程序为94°C 3min ；35 个循环94°C 40s, 55°C 50s, 72°C Imin ；72°C IOmin, 10°C IOmin0上述‘砀山酥梨’果实单果重主效QTL的分子标记在梨分子育种中的应用。上述应用，其应用方法为用梨基因组DNA，采用SRAP引物fe3 5' -GTGCTTTACTGTTTGCTCC-3 ’禾Pem4:5' -GACTGCGTACGAATTTGA-3 ‘扩增，扩增产物在 8%非变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离后，如果获得一个分子标记大小为M2bp，则表明与 梨果实单果重的主效QTL位点相连锁的分子标记存在，可预测该梨品种果实具有较低的单 果重。PCR扩增体系为总体积20ul 其中包含0. 2謹ol · L^dNTPjO-Sumol · L-1上下游引 物，2. Ommol · L4MgCl2,1 个单位的 rTaq 酶，DNA 模板 50ng，1 XBuffer ；PCR 反应程序为 940C 3min ；35 个循环94°C 40s, 55°C 50s, 72°C Imin ；72°C IOmin, 10°C IOmin0本发明的有益效果(1)本发明首次对决定‘砀山酥梨’果实单果重的数量性状位点进行了 QTL定位， 这为实现基于分子育种的多基因控制性状改良奠定了重要的基础和必要的前提。
(2)本发明中确定了 ‘砀山酥梨’果实单果重的主效QTL位点，对该数量性状决定 的贡献率较高，位点的贡献率为48. 8 %。因此，基于此位点筛选连锁分子标记对目标性状判 断的准确性大大提高。(3)目前普遍认为可应用于分子辅助选择的连锁标记与目标性状的距离需 彡5cM，本发明中与QTL位点连锁的标记距离为OcM，与目标位点表现为紧密连锁，这对于提 高分子标记辅助选择的准确性和效率具有重要意义。因此，以上标记具有良好的应用价值， 可加快对梨果实单果重性状改良的进度。
图1为‘砀山酥梨’单果重QTL位点Pfw-I在Β 113上的位置。BYH代表的是‘砀山酥梨’连锁群，BYH后的数字代表连锁群数。连锁群上左侧的数字是标记之间的遗传距离，单位为cM，右侧则表示的是分子标 记的名称。共有4种分子标记，“E-M-”为AFLP标记，E和M分别指限制性内切酶Eco I和 Mse I酶切，其后的数字是该标记多态性条带的编号；其它为SRAP、SSR标记和一个自交不 亲和S位点。连锁群右侧的实心长方形指示QTL作图区间Pfw-I。图2为SRAP引物组合fe;3em4对‘八月红’梨和‘砀山酥梨’ Fl后代PCR扩增结果 在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测图。箭头所指的条带即fe;3em4-M2p*，M 为 pBR322DNA/Msp I ladder。
具体实施例方式实施例1 a)利用我国的两个梨品种‘八月红’梨和‘砀山酥梨’杂交组合，获得其97株F1群 体。b)用 SSR(Simple sequence repeat)、 SRAP(Sequence related amplified polymorphism)禾口AFLP(Amplified fragment length polymorphism)三禾中分子标记方法分 析两个亲本及其F1群体，统计分析在亲本间具有多态性的位点在后代群体中的遗传类型。 最终获得了 23个SSRs、S基因位点、2 个SRAPs和482个AFLPs等共732个多态性标记 位点，然后利用Jionmap3. 0作图软件对其进行连锁分析，构建了一张共包含240个多态性 标记的‘砀山酥梨’的遗传连锁图谱。利用SSR、SRAP, AFLP分子标记方法，对‘八月红’梨和‘砀山酥梨’及后代进行分 析，并统计分析在亲本间具有多态性的位点在后代群体中的遗传类型。SSR标记的实验操作程序参考 Yomamoto T.等(Euphytica，2002，124 :129-137)的 方法；SRAP标记的实验操作程序参考Li等(Theor Appl Genet, 2001,103 =455-461)的方 法；AFLP标记分别使用Eco I和Mes I两种内切酶，具体实验操作程序参考Vos等(Nucleic Acids Res，1995，23 :4407-4414)的方法。所用引物由上海英骏生物技术有限公司合成。S SR和SRAP标记用8%非变性聚丙烯酰胺凝胶强碱银染法检测，AFLP标记用6%变性聚丙烯 酰胺凝胶银染检测。将SSR、SRAP、AFLP电泳图谱上清晰出现的多态性条带记为“ 1 ”，无带记为“0”，不清楚的带或缺失记为“_”，根据已知分子量的Marker (IOObp DNA Ladder)计算各多态性条 带的分子量。将分离条带按亲本来源归类，确定其来源及遗传类型。利用χ 2测验分析各 标记分离是否符合3 1或1 1的孟德尔分离比例，偏分离的在标记末尾用“*”标注。c)用Joinmap3. 0分析软件构建‘砀山酥梨’的分子遗传连锁图谱。将第b)步骤中得到的多态性标记位点按Joinmap3. 0分析软件中适于cp群体构 图的格式导入Joinmap3. 0，排除缺失数据过多的位点和显著偏分离的位点，以LOD = 4. 0 7. 0，重组率=0. 4，选择Kosambi作图函数构建遗传连锁图(Van Ooi jen, 2001)。d)对该F1群体单株的果实单果重进行了测定。将单果重的表型值和‘砀山酥梨’ 连锁图谱的相关文件导入MapQTL5. 0作图软件，选择区间作图法，以LOD值彡2. 5为标准， 对梨的单果重在‘砀山酥梨’的连锁图谱上进行QTL分析和定位。结果表明，在‘砀山酥梨’的第7连锁群上检测到单果重的QTL位点Pfw-I (图1)， LOD值为4. 24，为主效QTL位点，与最近的SRAP分子标记fe;3em4-242p*的连锁距离为lcM， 对该性状的贡献率为48.8%。该QTL位点与其最近标记的距离远小于可应用于分子辅助选 择的连锁标记与目标性状的所要求的最大距离。其中SRAP分子标记方法为，以梨DNA为模板，采用SRAP引物fe3 5' -GTGCTTTACTGTTTGCTCC-3‘
em4 5' -GACTGCGTACGAATTTGA-3‘扩增条件SRAP分析的PCR扩增体系为总体积20ul 其中包含0. 2mmol ·ΓΜΝΤΡ, 0. 3 μ mol · L—1 上下游引物，2. (toimol · L^1MgCl2,1 个单位的 rTaq 酶，DNA 模板 50ng， IX Buffer。PCR 反应程序为94 "C 3min ；35 个循环94 "C 40s, 55 "C 50s, 72 "C Imin ； 72°C IOmin,10°C IOmin ；扩增产物在8%非变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离后，能扩增出14条多态性条 带，其中M2bp大小的一条就是目标条带fe;3em4-242p*，则表明与QTL位点Pfw-I (图1)相 连锁的分子标记存在，该QTL位点与SRAP分子标记fe;3em4-242p*的连锁距离为OcM，对该 性状的贡献率为48.8%。实施例2利用筛选到的与‘砀山酥梨’果实单果重主效QTL相连锁的分子标记对‘八月红’ 梨与‘砀山酥梨’的97株F1杂交后代进行初步检测，以检测该方法在梨果实单果重分子标 记辅助选择中的实用价值。用该97株后代的基因组DNA及SRAP引物fe3和em4进行PCR 反应，SRAP分析的PCR扩增体系为总体积20ul 其中包含0. 2mmol · ΓΜΝΤΡ, 0. 3 μ mol · Γ1 上下游引物，2. Ommol · L^1MgCl2,1 个单位的 rTaq 酶，DNA 模板 50ng, 1 XBuffer。PCR 反应 程序为94°C 3min ；；35 个循环94°C 40s, 55°C 50s, 72°C Imin ；72°C IOmin, 10°C lOmin。PCR 扩增结果在8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(结果如图2~)，电泳后根据fe:3em4-242p*条带 的有无来确定是否存在相应的标记，如果存在标记，说明该植株的果实单果重低，不存在则 说明高，同时用实际测得的果实单果重结果与分子标记检测结果进行验证。结果显示，在‘八月红，梨与‘砀山酥梨，的97株F1杂交后代中，共有80株的DNA 扩增结果出现fe:3em4-242p*条带，这80株当中有35株的果实单果重小于160g，所有这80 株的果实单果重平均值为176. 46g ；共有12株后代的DNA扩增结果不出现fe;3em4-242p*条 带，其中10株的单果重大于160g，所有这12株的果实单果重的平均值为184. 06g ;5个单株条带缺失。用fe:3em4-242p*预测单果重有较好的预测效果。
权利要求
1.一种‘砀山酥梨’果实单果重主效QTL的分子标记，其特征在于是通过下列步骤获得a)利用梨品种‘八月红’梨和‘砀山酥梨’杂交获得F1后代单株；b)用SSR、SRAP和AFLP三种分子标记方法分析两个亲本及其F1群体，统计分析在亲本 间具有多态性的位点在后代群体中的遗传类型。获得多态性标记位点，然后对其进行连锁 分析，构建‘砀山酥梨’的遗传连锁图谱。c)对‘八月红’梨和‘砀山酥梨’杂交后代的F1群体单株的果实单果重进行测定，利用 区间作图法，将&群体每个单株的果实单果重与‘砀山酥梨’遗传连锁图谱中的分子标记进 行连锁和QTL分析，以LOD值> 2. 5为标准，大于2. 5说明存在一个QTL位点，在母本‘砀 山酥梨’的第7连锁群上检测到单果重的QTL位点Pfw-Ι，其LOD值为4. 24，是主效QTL， 距离最近的一个SRAP分子标记为fe;3em4-242p*，大小为M^pJg Pfw-I的距离为OcM，该 标记可以作为梨果实单果重的标记，所筛选的分子标记fe:3em4-242p*的SRAP引物为fe3 5' -GTGCTTTACTGTTTGCTCC-3’禾Π em4 :5' -GACTGCGTACGAATTTGA-3‘。
2.根据权利要求1所述的‘砀山酥梨’果实单果重主效QTL的分子标记，其特征在于 所述QTL位点PfV-I位于‘砀山酥梨’第13连锁群上，其解释48. 8%的单果重特征。
3.—种‘砀山酥梨’果实单果重主效QTL的SRAP分子标记引物，其特征在于该引物序 列为fe3:5' -GTGCTTTACTGTTTGCTCC-3‘禾Π em4 :5' -GACTGCGTACGAATTTGA-3‘。
4.一种‘砀山酥梨’果实单果重主效QTL的分子标记方法，其特征在于用 梨基因组 DNA，采用 SRAP 弓丨物 fe3 :5 ' -GTGCTTTACTGTTTGCTCC-3 ‘禾Π em4 5 ‘ -GACTGCGTACGAATTTGA-3 ‘扩增，扩增产物在8 %非变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离， 如果获得一个分子标记大小为M2bp，则表明与梨果实单果重的主效QTL位点PfV-I相连锁 的分子标记存在，Pfw-I位于‘砀山酥梨’第13连锁群上，其解释48. 8%的单果重特征。
5.根据权利要求4所述的‘砀山酥梨’果实单果重主效QTL的分子标记方法，其特征 在于PCR扩增体系为总体积20ul 其中包含0. 2mmol · Ι7ΜΝΤΡ，0. 3 μ mol · L-1上下游引 物，2. Ommol · L4MgCl2,1 个单位的 rTaq 酶，DNA 模板 50ng，1 XBuffer ；PCR 反应程序为 940C 3min ；35 个循环94°C 40s, 55°C 50s, 72°C Imin ；72°C IOmin, 10°C IOmin0
6.权利要求1或2中任意一项所述‘砀山酥梨’果实单果重主效QTL的分子标记在梨 分子育种中的应用。
7.根据权利要求6所述应用，其特征在于用梨基因组DNA，采用SRAP引物fe3 5' -GTGCTTTACTGTTTGCTCC-3 ’禾Π em4 :5 ‘ -GACTGCGTACGAATTTGA-3 ‘扩增，扩增产物在 8%非变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离后，如果获得一个分子标记大小为M2bp，则表明与 梨果实单果重的主效QTL位点相连锁的分子标记存在，可预测该梨品种果实具有较低的单果重。
8.根据权利要求7所述应用，其特征在于PCR扩增体系为总体积20ul其中包含 0. 2mmol .I^dNTP，0. 3 μ mol ·Γ1 上下游引物，2. Ommol .I^MgCl2,1 个单位的 daq 酶，DNA 模 板 50ng，IXBuffer ；PCR 反应程序为-MV 3min ；35 个循环94°C 40s, 55°C 50s, 72°C Imin ； 72°C IOmin,10°C IOmin0
全文摘要
本发明属于遗传育种领域，涉及‘砀山酥梨’果实单果重主效QTL的分子标记及其应用。利用SRAP、SSR、AFLP构建‘砀山酥梨’的遗传连锁图谱，结合对果实单果重的表型鉴定，采用区间作图法对此群体进行分析，在‘砀山酥梨’的第13连锁群上检测到主效QTL的存在，可解释48.8％的单果重特征。距离主效QTL位点Pfw-1距离最近的标记为fe3em4-242p*，其距离为0cM。所获得的单果重主效QTL分子标记对于加快梨品种的遗传改良进程，提高育种选择效率具有重要的理论和实践指导意义。
文档编号C12N15/10GK102140455SQ20111003184
公开日2011年8月3日 申请日期2011年1月29日 优先权日2011年1月29日
发明者吴俊 , 吴华清, 张瑞萍, 张绍铃, 陶书田, 齐开杰 申请人:南京农业大学