专利名称：一种鉴定miRNA靶基因的试剂盒及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程领域，尤其涉及一种鉴定miRNA靶基因的试剂盒及其应用。
背景技术：
在动植物基因组中广泛存在一类非编码蛋白的RNA基因，产生长度大约为18-25 个核苷酸的RNA，它们被命名为miRNA (microRNA)，它们可通过转录后水平或翻译水平调节基因表达。参与调节细胞的发育、神经分化、细胞增殖、凋亡和脂肪代谢等过程。miRNA的初级转录产物pri_miRNA可被RNase III加工成miRNA的前体 pre-miRNA,在胞核内形成的pre-miRNA可穿过核膜从胞核进入胞液，被RNaseIII类核酸酶切割形成21nt的单链miRNA，形成成熟的miRNA。成熟的miRNA进入RISC复合体，调控基因表达。可降解与其完全配对的靶RNA，或抑制不完全配对的mRNA的翻译。在对miRNA调控活性的研究中，靶基因mRNA3'非翻译区(Untranslated Regions,UTR)连接于荧光素酶 (Luciferase)下游。通过萤火虫荧光素酶的活性分析，可获得miRNA对潜在靶标基因调控作用的结果。表达克隆转录后形成萤火虫荧光素酶ORF与3’ UTR的嵌合体mRNA，如果有特异的miRNA可与3 ‘ -UTR某段序列互补结合，嵌合体中荧光素酶ORF所编码蛋白的活性也相应受到调控，因此通过检测荧光素酶的发光强度就可以定量地测定miRNA对应靶标的 mRNA调控的效果。另外构建miRNA的确定靶基因3 ‘UTR报告基因的载体还可以用于监测 miRNA表达水平，对miRNA表达调控进行评价。目前的验证靶基因的报告系统多为Ambion公司商业化的报告系统 pMIR-REPORT system,采用荧光报告的方法来验证靶基因，其内参照为pMIR-REPORT β-gal Control Plasmid0通过检测β-gal进行归一化。还有使用双荧光蛋白代替 luciferase。通过检测荧光强度和western-blotting检测EGFP表达来验证是否为目标 miRNA的靶基因。但是这些方法检测都较为繁琐。
发明内容
本发明的一个目的是提供如下所述报告载体在鉴定miRNA靶基因和/或检测 miRNA表达中的应用。本发明提供了如下所述报告载体在鉴定miRNA靶基因和/或检测miRNA表达中的应用。本发明的第二个目的是提供如下所述的试剂盒在鉴定miRNA靶基因和/或检测 miRNA表达中的应用。本发明提供了如下所述的试剂盒在鉴定miRNA靶基因和/或检测miRNA表达中的应用。本发明的第三个目的是提供如下所述的载体在鉴定miRNA靶基因和/或检测 miRNA表达中的应用。本发明提供了如下所述的载体在鉴定miRNA靶基因和/或检测miRNA表达中的应用。本发明的第四个目的是提供一种报告载体。本发明提供的报告载体，包括报告基因和分别位于所述报告基因上下游的启动子及多克隆位点；所述报告基因为萤火虫荧光素酶的编码基因。所述多克隆位点由以下酶的识别位点连接而成EcoRI，KpnI, SacI, NheI, SmaI, XhoLBglII ；所述启动子为启动目的基因转录的CMV启动子；所述萤火虫荧光素酶的氨基酸序列为序列表中序列6 ；所述萤火虫荧光素酶的编码基因的核苷酸序列为序列表中序列2。述报告载体为将含有多克隆位点的双链Linker区插入pCMV-luciferase载体的多克隆位点1得到的重组载体；所述pCMV-luciferase载体为将CMV启动子插入pGL3_Basic载体的多克隆位点 2得到的重组载体；所述含有多克隆位点的双链Linker区的核苷酸序列为序列表中序列1。所述多克隆位点1为^CbaI识别位点；所述多克隆位点2为KpnI和HindIII间的识别位点；所述pGL3-BasiC载体的多克隆位点2的下游为萤火虫荧光素酶的编码基因。本发明的第五个目的是提供一种用于鉴定miRNA靶基因的试剂盒。本发明提供的试剂盒，包括所述的报告载体和内参载体；所述内参载体为将所述的报告载体中的萤火虫荧光素酶的编码基因替换成海肾荧光素酶的编码基因得到的载体；所述海肾荧光素酶的氨基酸序列为序列表中的序列7 ；所述海肾荧光素酶编码基因的核苷酸序列为序列表中序列3。本发明的第六个目的是提供一种用于鉴定miRNA靶基因的载体。本发明提供的载体，为将CFH的3' -UTR插入上述的报告载体的EcoRI和SmaI酶切位点得到的载体；所述CFH的3 ‘ -UTR的核苷酸序列为序列表中序列4。本发明的实验证明，本研究设计了 miRNA靶基因鉴定的双报告基因载体系统， 利用该系统检测到miRNA146a真核表达可以使报告基因活性下降，验证了文献的CFH是 miRNA 146a靶基因的结论，该系统还可以通过构建miRNA确定的靶标来监测细胞内miRNA内源表达水平，分析调控miRNA表达的因素。该系统的特点是在现有载体基础上进行改建而成的双报告系统，具有简单、便捷、实用和结果可信度高等特点，其成功构建和功能鉴定将能被应用于miRNA研究中的调控靶基因快速鉴定和对miRNA表达调控进行评价。
图 1 为 pMIR-Luciferase 载体和 pMIR-control 载体构建结果
图2为pMIR-CFHUTR载体的构建图 3 为 pIRES2-EGFP_146a 的构建图 4 为 pIRES2-EGFP 和 pIRES2_EGFP_146a 表达检测图5为miR146a表达对CFH-UTR报告基因活性的影响
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1、报告基因载体系统的构建克隆载体pMD18-T为TAKARA公司产品，载体pGL3_Basic，内参载体pRL_TK载体以及双报告基因检测试剂均为!Iomega公司的产品；大肠杆菌感受态DH5 α为北京博迈德生物科技公司生产；细胞系IfepG2(购自协和医科大学基础医学细胞中心)由本实验室保存提供；miRNA提取试剂盒为QIAGEN公司的miRNAeasy mini kit,反转录使用TAKARA公司的 Reverse Transcriptase M-MLV(RNase Γ)，引物为上海生物工程有限公司合成。一、实验报告载体pMIR-Luciferase构建与鉴定l、pCMV_luciferase 载体的构建①设计CMV启动子引物见表1，以pcDNA3. 1+(购自hvitrogen公司编号 V790-20。)为模板，以CMV启动子上游引物和CMV启动子下游引物为引物进行PCR扩增，得到的600bp PCR产物，进行的琼脂糖电泳，结果如图IA所示，得到588bp的片段。回收PCR产物，与pMD18T载体(购自宝生物(大连)工程有限公司编号为DlOlA 连接，连接产物转入大肠杆菌中，得到转化子；②提取转化子的质粒，送去测序，该质粒为将CMV启动子(Genbank编号 EF550208. 1序列中5，端第232-819位核苷酸。)插入pMD18T载体得到的质粒，将该质粒命名为 pMD18T-CMV。用KpnI和HindIII酶切pMD18T_CMV得到的小片段与经同样酶切回收的 pGL3-BasiC载体大片段连接，连接产物转入大肠杆菌中，得到转化子；提取转化子的质粒， 进行KpnI和HindIII酶切鉴定，结果得到588bp片段(如图1B)，证明该质粒为阳性质粒， 结果为该质粒为将CMV启动子插入pGL3-BasiC载体的KpnI和HindIII酶切位点得到的载体，将该质粒命名为pCMV-luciferase，该载体由于在多克隆位点区域引入CMV启动子，破坏多克隆位点，CMV强启动子连接于报告基因Luciferase (序列表中的序列2)的上游。2、实验报告载体pMIR-luciferase构建1)用 XbaI 酶切由 1 得到的 pCMV-luciferase (XbaI 位于 pCMV-luciferase 的 Iuciferase下游位置)，CIAP去磷酸化，得到线性pCMV-luciferase ；2)合成寡核苷酸1 inker序列1 (序列1)和1 inker序列2 (linker序列2和Iunker 序列1为互补链，上海生物工程有限公司合成)，将两条寡核苷酸退火(反应体系水 21 μ 1, IOX DNA退火缓冲液(IOOmM Tris-HCL (pH = 7. 5), IOmM EDTA，IM NaCl) 3 μ 1, Linker 寡核苷酸1(100 μ Μ)3 μ 1，Linker寡核苷酸2(100 μ Μ)3 μ 1 ；反应条件:99°C 3分钟，每2. 5 秒下降0. 1°C，降至25°C (注1)约30分钟退火。)，回收退火产物(即为含有多克隆位点的双链 Linker 区(EcoRI，KpnI，SacI，NheI，SmaI，XhoI，BglII，合成的 Linker 序列退火后得到^CbaI的悬垂粘末端，所以无须)(bal酶切，退火后直接连接入线性pCMV-luciferase)。3)将1)线性pCMV-luciferase与2、的退火产物连接，连接产物转入大肠杆菌中，得到转化子；提取转化子的质粒，HindIII和EcoRI进行酶切验证(选择Iuciferase 上游的HindIII和下游Linker上有的EcoRI位点)鉴定，结果如图IC所示，得到1689bp片段(包含1653bp的Iuciferase片段和上游HindIII与起始密码之间的36bp片段。) 的为阳性质粒，将该阳性质粒送去测序，该阳性质粒为将序列表中的序列1正向插入正确 pCMV-luciferase的)(bal酶切位点得到的载体，将该质粒命名为pMIR-Luciferase，该载体的主要结构包括报告基因Luciferase、位于报告基因Luciferase上游的CMV启动子、位于报告基因Luciferase下游的多克隆位点(多克隆位点依次为EcoRI，KpnI, SacI, NheI, SmaI，XhoI，BglII)。
表1所用引物序列列表
引物名称
序列
CMV启动子上游引物 CMV启动子下游引物
linker 序歹U 1
linker 序列 2 CFH-3 ‘ UTR扩增上游引物
GGTACC CGTTGACATTGATTATTG AAGCTT GAGCTCTGCTTATATAGAC CTAGAGAATTCGGTACCGAGCTCTTACGCGTGCTAGCCC
GGGCTCGAGATCTGCGATCTAAGTT CTAGAACTTAGATCGCAGATCTCGAGCCCGGGCTAGCAC GCGTAAGAGCTCGGTACCGAATTCT GAATCAATCATAAAGTGCACACC
CFH-3 ‘ UTR扩增下游引物 Hsa-miRNA146a-pri 上游引物
Hsa-miRNA146a-pri 卜游引物
Hsa-miRNA146a 茎环结构引物
U6茎环结构引物
Hsa-miRNA 146a 正向定量引物 U6正向定量引物茎环结构通用反向引物
GTTTTCCAGGATTTAATATGGTGC AGATCTTCAAGCGATCCTCCCACCACAG
CTGCAGCATGTAAAGCACTTACAACAGTACCTG
GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGAT
ACGACAACCCATG GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGAT ACGACAAAAATATG
GCGGCGTGAGAACTGAATTC
CGCAAATTCGTGMGCGTTC GTGCAGGGTCCGAGGTATTC2、内参照载体pMIR-control构建设定内参照载体是为了对转染进行归一化而构建的，其中CMV启动子与实验报告载体一致是为了在miRNA表达调控研究中，避免转录因子对不同启动子调节作用不一致而造成结果分析的复杂性。
构建方法如下用)(bal和HindIII酶切上述构建的pMIR-luciferase载体切除萤火虫荧光素酶(fire fly luciferase，氨基酸序列为序列6)，得到的载体骨架片段与经过同样酶切 pRL-tk载体得到的海肾荧光素酶(renillia luciferase，氨基酸序列为序列7)片段连接， 得到连接产物，将连接产物转入大肠杆菌，得到克隆。挑取克隆提取质粒，用)CbaI和NheI 酶切鉴定，得到为947bp (包含renillia luciferase片段和上游距离NheI的9bp核酸和下游距离)CbaI的2bp核酸)的片段(图1D)，将该片段送去测序，该片段具有序列表中序列 3所示的核苷酸，为renillia luciferase的核苷酸序列。因此，含有约93!3bp的质粒为阳性质粒。将阳性质粒送去测序，结果为该质粒为将序列表中的序列3插入pMIR-luciferase 载体的)(bal和HindIII酶切位点得到的质粒，将该质粒命名为pMIR-control。实施例2、报告系统的功能验证1、pMIR-CFHUTR 载体的构建①依据表1合成引物；提取H印G2细胞的RNA，经oligo dT引物反转录得到mRNA 作为模板，以CFH-3' UTR扩增上游引物和CFH-3' UTR扩增下游引物作为引物，进行PCR扩增，得到的PCR产物送去测序，结果为该PCR产物具有序列表中序列4所示的核苷酸(era的 3' -UTR区域的核苷酸)。电泳检测如图2的左图所示，得到M7bp片段，将该PCR产物与 PMD18T载体连接，转化后得到转化子，提取转化子的质粒送去测序，结果为质粒为将序列表中序列4插入pMD18T载体中得到的质粒，该质粒命名为pMD18T-UTR。②用HindIII切开补平，EcoRI酶切pMD18T_UTR得到的小片段与经过EcoRI与 SmaI酶切得到的pMIR-luciferase载体片段连接，得到的连接产物转化，得到转化子，将转化子提取质粒，用EcoRI和B10I酶切鉴定，结果如图2的右图所示，得到M7bp (包含193bp 的UTR片段和连接入的PMD18T上游的35bp和下游的21bp核酸)的片段为阳性质粒，将该阳性质粒送去测序，结果为该质粒为将序列表中的序列4插入pMIR-luciferase载体的 EcoRI和SmaI酶切位点得到的载体，将该质粒命名为pMIR-CFHUTR。2、miR146a真核表达载体的构建①根据pri-miR146a的序列设计合成引物见表1，以!fepG2细胞提取的基因组为模板，Hsa-miRNA146a-pri 上游引物和 Hsa_miRNA146a-pri 上游引物作为引物，以 95°C，5min ； 950C lmin, 55°C 45Sec,72°C 45sec ；72°C 7min为扩增条件，30个循环的反应，扩增，检测 PCR产物，如图3左图所示，可以看出得到697bp片段，将该PCR产物送去测序，结果为该PCR 产物具有序列表中的序列5所示的核苷酸。将该PCR产物与pMD18T载体连接，得到的连接产物转化，得到转化子，将转化子提取质粒，送去测序，该质粒为将序列表中的序列5插入 PMD18T得到的载体，该载体命名为pMD18T-146a。②将pMD18T_146a用BglII和I^stI酶切，回收小片段，将该小片段与经同样酶切的pIRES2-EGFP(cl0ntech公司，产品目录号是6029-1)载体大片段连接，得到连接产物，将连接产物转化，得到转化子，提取转化子的质粒，用BglII和I^stI酶切，结果如图3的右图所示，得到697bp的为阳性质粒。将该阳性质粒送去测序，结果为该质粒为将序列5插入pIRES2-EGFP载体的BglII和I^stI酶切位点间得到的载体，将该载体命名为 pIRES2-EGFP-146a,即为 miR146a 真核表达载体 pIRES2_EGFP_146a。3、细胞培养与转染
在DMEM培养基中培养H印G2细胞，DMEM培养基(购自GIBICO公司，产品目录号为C12430)中添加10%胎牛血清，2mM谷氨酰胺，100U/ml青霉素，和100 μ g/ml链霉素，5% CO2 37°C恒 温孵箱培养。转染用Lipofectamine 2000按说明书进行。4、miR146a真核表达载体细胞转染与检测培养!fepG2细胞接种于六孔板，将构建正确的pIRES2-EGFP_146a载体和 PIRES2-EGFP空载体分别使用Invitrogen公司的lipofectamine 2000转染入!fepG2细胞中，每个样品重复3次，72h荧光显微镜下观察绿色荧光表达情况(检测载体中的EGFP表达)。结果如图4所示，图4A为转染两种载体后72h后荧光检测结果，其中1_3为 PIRES2-EGFP空载体，4-6为pIRES2_EGFP_146a，可以看出，结果两种载体均能在H印G2细胞中表达。5、miR146a相对定量检测收集!fepG2细胞，使用 QIAGEN 公司的miRNAeasy mini kit 提取含miRNA 的总 RNA。 设计miR146a和内参照u6 SnRNA的茎环结构弓丨物见表1。使用TAKARA公司的M-MLV进行逆转录反应，分别使用miRNA146a的各组引物(Hsa_miRNA 146a正向定量引物和茎环结构通用反向引物、内参照u6 SnRNA正向定量引物和与茎环结构通用反向引物)对上述逆转录产物进行Realtime-PCR检测。采用2_Δ Δα法，用TO内参对照对转染细胞miR 146a实时定量PCR结果进行校正处理，计算上述两种转染细胞的miR-146a相对表达量。实验重复三次， 结果取平均值士标准差。结果如图4B 所示，pIRES2-EGFP-146a 和 pIRES2_EGFP 的转染细胞后 miR 146a 的相对表达量分别为 1. 0221368士 (3X0. 104933121)和 3. 424479333士 (3X0. 411374704)。 可以看出，pIRES2-EGFP-146a转染的细胞miRNA 146a的表达量大于空载体转染的细胞的表达量，P = O. 0033 < 0. 01说明miR146a真核表达载体在H印G2细胞中可以表达。6、miR146a表达对CFH UTR报告基因活性的影响将上述构建的pMIR-CFHUTR载体、pIRES2_EGFP_146a以及内参照载体 pMIR-control载体共转染入H印G2细胞中，pIRES2_EGFP空载体为对照。转染48h后收集细胞。使用双荧光素酶报告基因检测试剂盒(promega)对细胞进行裂解，与底物混合，使用 GloMax 2020发光检测仪(Promega公司目录号E5311)分别检测双报告基因的活性。每组实验重复三次。通过t检验进行数据的统计学分析。结果如图5所示，从图中看出，PIRES2-EGFP的萤火虫荧光素酶与内参海肾荧光素酶的比值为2. 976719683士(2X0. 926826805)，pIRES2_EGFP_146a的萤火虫荧光素酶与内参海肾荧光素酶的比值为1. 293969873士(2X0. 223621714)(萤火虫荧光素酶与内参海肾荧光素酶的比值为荧光素酶的相对活性，用海肾荧光素酶作为内参进行归一化处理)，说明 miR146a的表达可以促进pMIR-CFHUTR报告基因的活性降低，P值为0. 0378 < 0. 05。验证了 miR146a的靶基因为CFH的3，_UTR，且miR146a结合于CFH的3，_UTR促进其mRNA降解的理论。
权利要求
1.如下权利要求4-8中所述报告载体在鉴定miRNA靶基因和/或检测miRNA表达中的应用。
2.如下权利要求9所述的试剂盒在鉴定miRNA靶基因和/或检测miRNA表达中的应用。
3.如下权利要求10所述的载体在鉴定miRNA靶基因和/或检测miRNA表达中的应用。
4.一种报告载体，包括报告基因和分别位于所述报告基因上下游的启动子及多克隆位点；所述报告基因为萤火虫荧光素酶的编码基因。
5.根据权利要求4所述的报告载体，其特征在于所述多克隆位点由以下酶的识别位点连接而成EcoRI、Kpnl、SacI、NheI、SmaI、XhoI、BglII、HindIII ；所述启动子为启动目的基因转录的CMV启动子；所述萤火虫荧光素酶的氨基酸序列为序列表中序列6。
6.根据权利要求4或5所述的报告载体，其特征在于所述萤火虫荧光素酶的编码基因核苷酸序列为序列表中序列2。
7.根据权利要求4-6任一所述的报告载体，其特征在于所述报告载体为将含有多克隆位点的双链Linker区插入pCMV-luciferase载体的多克隆位点1得到的重组载体；所述pCMV-luc if erase载体为将CMV启动子插入pGL3_Basic载体的多克隆位点2得到的重组载体；所述含有多克隆位点的双链Linker区的核苷酸序列为序列表中序列1。
8.根据权利要求4-7任一所述的报告载体，其特征在于所述多克隆位点1为^CbaI识别位点；所述多克隆位点2为KpnI和HindIII间的识别位点；所述pGL3-BasiC载体的多克隆位点2的下游为萤火虫荧光素酶的编码基因。
9.一种用于鉴定miRNA靶基因的试剂盒，包括权利要求4-8中任一所述的报告载体和内参载体；所述内参载体为将权利要求4-8中任一所述的报告载体中的萤火虫荧光素酶的编码基因替换成海肾荧光素酶的编码基因得到的载体；所述海肾荧光素酶的氨基酸序列为序列表中的序列7 ； 所述海肾荧光素酶编码基因的核苷酸序列具体为序列表中序列3。
10.一种用于鉴定miRNA靶基因的载体，为将CFH的3' -UTR插入权利要求4_8中任一所述的报告载体的EcoRI和SmaI酶切位点得到的载体；所述CFH的3' -UTR的核苷酸序列为序列表中序列4。
全文摘要
本发明公开了一种鉴定miRNA靶基因的试剂盒及其应用。本发明报告载体在鉴定miRNA靶基因和/或检测miRNA表达中的应用；试剂盒在鉴定miRNA靶基因和/或检测miRNA表达中的应用；载体在鉴定miRNA靶基因和/或检测miRNA表达中的应用；所述报告载体，包括报告基因和分别位于所述报告基因上下游的启动子及多克隆位点；所述报告基因为萤火虫荧光素酶的编码基因。本发明的实验证明，本研究设计了miRNA靶基因鉴定的双报告基因载体系统，用于miRNA研究中的调控靶基因快速鉴定和对miRNA表达调控进行评价。
文档编号C12Q1/66GK102168133SQ201110031828
公开日2011年8月31日 申请日期2011年1月28日 优先权日2011年1月28日
发明者于虹, 周育森, 李军锋, 郭彦, 鲍春旸 申请人:中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所