专利名称：胞二磷胆碱的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种胞二磷胆碱的制备方法，属于生物技术领域。
背景技术：
胞二磷胆碱，又名胞苷二磷酸胆碱，中国药典2005年版定名为胞磷胆碱，英文名 Citichaline，它的化学名称胆碱胞嘧啶核苷_5’ - 二磷酸酯。它是卵磷脂生物合成的前体，当大脑功能下降时，脑组织内的卵磷脂含量显著减少。补充外源性胞二磷胆碱即能激活卵磷脂的生物合成，刺激脑干网状结构的兴奋，提高苏醒阈值，恢复神经组织机能，改善脑代谢和神经传导，提高患者的意识水平。上世纪50年代由kermedy博士等人发现并确定分子结构，稍后Rossiter等阐明其功能。70年代初，日本武田制药株式会社研发并用于治疗脑外伤，脑手术伴随的意识障碍的临床获得成功，其商品名Aichdin，中译名尼柯灵。我国自70年代中期，华东师范大学生化教研室和天厨味精厂等单位协作，首先采用啤酒酵母作酶促生物发酵，稍后又进行了化学合成的探索，并在上海华山医院、上海市第一人民医院、新华医院等脑外科和神经内科进行约二年期的临床应用。目前，胞二磷胆碱已作为脑外科、神经内科以及不同类型的老年痴呆症用药。因此，对它的需求量很大，目前国内市场已达60吨上下，且出口量也与日俱
+曰O胞二磷胆碱的合成方法主要有化学合成法、酶法和微生物转化法等方法，但是， 前两种方法由于成本太高，现在已经不再采用。目前常用的方法是微生物转化法，利用微生物的细胞酶系合成。由于细胞具有维持其生命活动的完整的多酶系统，各种酶又保持着原有生活细胞所处的状态和特定位置，因此能够迅速有效地完成多步酶催化反应。然而，现行的胞二磷胆碱的生产方法大多需要由多种微生物参与，使得生产的工艺条件较为苛刻，工艺步骤也较为繁琐；且现行的胞二磷胆碱的生产方法所使用的底物的价格大多较为昂贵， 使得生产胞二磷胆碱的成本大为提高。
发明内容
鉴于上述现有技术存在的缺陷，本发明的目的是提出一种经济、高效，且工艺简单的胞二磷胆碱的制备方法。本发明的目的将通过以下技术方案得以实现胞二磷胆碱的制备方法，使用单一的基因工程菌的培养物或者其处理物作为酶源，催化包括氯化铵、乳清酸和磷酸胆碱的底物进行反应，使得反应液中生成和积蓄胞二磷胆碱，从所述反应液中提取所述胞二磷胆碱。进一步地，所述基因工程菌具有可诱导表达磷酸胆碱转胞苷酰酶、乳清苷酸焦磷酸化酶、乳清苷酸脱羧酶、尿甘酸激酶、核苷二磷酸激酶和胞苷三磷酸连接酶的基因。更进一步地，可诱导表达所述磷酸胆碱转胞苷酰酶和胞苷三磷酸连接酶的基因位于所述基因工程菌的质粒上。
更进一步地，可诱导表达所述乳清苷酸焦磷酸化酶、乳清苷酸脱羧酶、尿甘酸激酶和核苷二磷酸激酶的基因位于所述基因工程菌的染色体上。更进一步地，可诱导表达所述磷酸胆碱转胞苷酰酶的基因核苷酸片段来源于酿酒酵母。更进一步地，可诱导表达所述胞苷三磷酸连接酶、乳清苷酸焦磷酸化酶、乳清苷酸脱羧酶、尿甘酸激酶和核苷二磷酸激酶的基因片段来源于大肠杆菌。更进一步地，所述基因工程菌的制备方法包括如下步骤a)将来源于酿酒酵母的可诱导表达所述磷酸胆碱转胞苷酰酶的基因核苷酸片段和来源于大肠杆菌的可诱导表达胞苷三磷酸连接酶的基因核苷酸片段经酶切后与质粒载体连接形成重组质粒；b)通过同源重组将来源于大肠杆菌的可诱导表达所述乳清苷酸焦磷酸化酶、乳清苷酸脱羧酶、尿甘酸激酶和核苷二磷酸激酶的基因片段插入到宿主细胞的染色体上；c)将所述重组质粒转入到所述宿主细胞内。更进一步地，所述质粒载体为质粒pUC18。更进一步地，所述宿主细胞为原核细胞。更进一步地，所述宿主细胞为大肠杆菌细胞。与现有技术相比，本发明的有益效果为(1)采用单一的微生物催化反应，反应条件易于控制；( 底物成本较低，从而使得胞二磷胆碱的生产成本较低；C3)反应迅速、且转
化率较高。以下便结合实施例附图，对本发明的具体实施方式
作进一步的详述，以使本发明技术方案更易于理解、掌握。
图1是实施例中的基因工程菌的部分基因构建的流程图。
具体实施例方式本发明胞二磷胆碱的制备方法是使用单一的基因工程菌的培养物或者其处理物作为酶源，催化包括氯化铵、乳清酸和磷酸胆碱的底物进行反应，使得反应液中生成和积蓄胞二磷胆碱，从所述反应液中提取所述胞二磷胆碱。实施例本实施例中所使用的基因工程菌为单一菌株，能够同时诱导表达酵母的磷酸胆碱转胞苷酰酶(CCT)及大肠杆菌嘧啶代谢途径中的乳清苷酸焦磷酸化酶(pyrE)、乳清苷酸脱羧酶(pyrF)、尿甘酸激酶(pyrH)、核苷二磷酸激酶(NDK)和胞苷三磷酸连接酶(pyrG)。根据已知酿酒酵母的cct基因序列(genebank登录号为M36827)设计引物，以酵母染色体为模板扩增出cct基因全长。pyrE基因、pyrF基因、pyrH基因、pyrG基因和ndk 基因是根据大肠杆菌全基因组序列(genebank登录号ECK363》设计引物，以大肠杆菌DNA 为模板扩增出这些基因全长。所述基因工程菌的制备方法具体包括如下步骤1、cct基因和pyrG基因表达载体构建
根据已知大肠杆菌K12 MG1655的pyrG基因核酸序列和酿酒酵母的cct基因核酸序列，分别以大肠杆菌和酿酒酵母的染色体作为模板，扩增出全长cct基因和pyrG基因。采用常规细菌和酵母菌DNA提取方法分别提取了购自德国的原始大肠杆菌菌株 DH5a 和酿酒酵母菌株 ATCC 26786/26787 (DSM 4266/4267)的基因组 DNA。扩增使用的是保真性较好的pfu酶，加A尾后连接于pUC19-T vector，挑取阳性克隆送交测序公司。(1)质粒pUCG的构建将连接于pUC19-T vector上的pyrG基因从载体上酶切下来，使用的限制性内切酶为Sma I和BamH I，同时载体pUC18使用限制性内切酶Nru I和BamH I进行酶切，将载体酶切产物回收后，与回收的pyrG基因片段进行酶连反应，通过Sma I和BamH I等限制性酶消化，进行分析，确认片段已经连接成功。最终获得质粒PUCG，pyrG基因此时是由IacZ 启动子诱导表达的。(2)质粒 pUC-CCT 的构建将连接于pUC19-T vector上的cct基因从载体上酶切下来，使用的平末端限制性内切酶为Dra I，同样，pUC18使用的为平末端酶Sma I，将载体酶切回收后，与cct基因进行酶连反应，先PCR扩增验证，再通过Sma I等限制性酶消化，进行分析，确认片段已经连接成功。(3)质粒 pUCG-CCT 的构建通过PCR扩增，先将带有启动子的cct基因连接于pUC19-T vector上，测序确认序列，用Nde I酶切下目的片段，进行琼脂糖电泳，按照回收试剂盒操作说明回收DNA，溶解在20yL TE中，于离心管内-20°C保存。与脱磷载体pUCG/Nde I的连接，取一个0. 2mL PCR 管，加入 7. 5μ L 外源 DNA片段，IyLpUCG 脱磷酸化载体，IyL 10ΧΤ4 Ligation Buffer, 0.5yL T4连接酶，混勻后放置于16°C水浴过夜。将酶联产物转化至大肠杆菌菌株DH5 α 中，在含有100mg/L的Amp的平板上挑取阳性克隆。酶切并PCR扩增以验证阳性克隆的正确性。2、大肠杆菌染色体上pyrE、pyrF、pyrH、ndk操纵元的构建从大肠杆菌K12 MG1655染色体上分别扩增出pyrE、pyrF、pyrH、ndk基因，测序后，通过EcoRI、SacI酶切位点将pyrE片段连接于质粒pUC18上，得到质粒pUCpyrE ；再通过Mel、SmaI位点将pyrF片段连接到质粒pUCpyrE上，得到质粒pUC-pyrEF ；接着将pyrH 片段经由SmaI和XbaI位点连接到pUC-pyrEF上，得到质粒pUCpyrEFH ；最后通过XbaI和 HindIII位点将ndk片段连接到pUCpyrE^上，获得在Iac启动子后可诱导表达pyrE、pyrF、 pyrH、ndk基因的操纵元的质粒pUCpyrEFHk，具体构建流程如图1所示。3、带有KRT-Km-FRT元件的pyrE、pyrF、pyrH、ndk操纵元质粒的构建ndk基因引物上设计有BioI位点，将pUCpyrEFHk用BioI和kal酶切，与同样带有B10I和kal酶切位点的以质粒pKD13为模板扩增出的带有FRT位点的Kan基因片段相连，构建成质粒pUCpyrEFHkKmFRT，如图1所示。4、Red同源重组方法重组pyrE、pyrF、pyrH、ndk基因(1)线性双链DNA打靶分子的制备与处理用于基因敲除的外源DNA的PCR扩增引物，它们分别由5’端38bps的阿拉伯糖操纵元同源区和3'端20bps的模板质粒pKD13的卡那霉素抗性基因同源区或质粒 pUCpyrEFHkKmFRT 上 20bp 同源区组成。建立如下的扩增反应体系
权利要求
1.胞二磷胆碱的制备方法，其特征在于使用单一的基因工程菌的培养物或者其处理物作为酶源，催化包括氯化铵、乳清酸和磷酸胆碱的底物进行反应，使得反应液中生成和积蓄胞二磷胆碱，从所述反应液中提取所述胞二磷胆碱。
2.根据权利要求1所述的胞二磷胆碱的制备方法，其特征在于所述基因工程菌具有可诱导表达磷酸胆碱转胞苷酰酶、乳清苷酸焦磷酸化酶、乳清苷酸脱羧酶、尿甘酸激酶、核苷二磷酸激酶和胞苷三磷酸连接酶的基因。
3.根据权利要求2所述的胞二磷胆碱的制备方法，其特征在于可诱导表达所述磷酸胆碱转胞苷酰酶和胞苷三磷酸连接酶的基因位于所述基因工程菌的质粒上。
4.根据权利要求3所述的胞二磷胆碱的制备方法，其特征在于可诱导表达所述乳清苷酸焦磷酸化酶、乳清苷酸脱羧酶、尿甘酸激酶和核苷二磷酸激酶的基因位于所述基因工程菌的染色体上。
5.根据权利要求4所述的胞二磷胆碱的制备方法，其特征在于可诱导表达所述磷酸胆碱转胞苷酰酶的基因核苷酸片段来源于酿酒酵母。
6.根据权利要求5所述的胞二磷胆碱的制备方法，其特征在于可诱导表达所述胞苷三磷酸连接酶、乳清苷酸焦磷酸化酶、乳清苷酸脱羧酶、尿甘酸激酶和核苷二磷酸激酶的基因片段来源于大肠杆菌。
7.根据权利要求1-6中任意一项所述的胞二磷胆碱的制备方法，其特征在于所述基因工程菌的制备方法包括如下步骤a)将来源于酿酒酵母的可诱导表达所述磷酸胆碱转胞苷酰酶的基因核苷酸片段和来源于大肠杆菌的可诱导表达胞苷三磷酸连接酶的基因核苷酸片段经酶切后与质粒载体连接形成重组质粒；b)通过同源重组将来源于大肠杆菌的可诱导表达所述乳清苷酸焦磷酸化酶、乳清苷酸脱羧酶、尿甘酸激酶和核苷二磷酸激酶的基因片段插入到宿主细胞的染色体上；c)将所述重组质粒转入到所述宿主细胞内。
8.根据权利要求7所述的胞二磷胆碱的制备方法，其特征在于所述质粒载体为质粒 pUC18。
9.根据权利要求8所述的胞二磷胆碱的制备方法，其特征在于所述宿主细胞为原核细胞。
10.根据权利要求9所述的胞二磷胆碱的制备方法，其特征在于所述宿主细胞为大肠杆菌细胞。
全文摘要
本发明揭示了一种胞二磷胆碱的制备方法，使用单一的基因工程菌的培养物或者其处理物作为酶源，催化包括氯化铵、乳清酸和磷酸胆碱的底物进行反应，使得反应液中生成和积蓄胞二磷胆碱，从所述反应液中提取所述胞二磷胆碱。本发明的有益效果为(1)采用单一的微生物催化反应，反应条件易于控制；(2)底物成本较低，从而使得胞二磷胆碱的生产成本较低；(3)反应迅速、且转化率较高。本发明能广泛地应用于胞二磷胆碱的制备中。
文档编号C12N15/70GK102199643SQ20111005260
公开日2011年9月28日 申请日期2011年3月4日 优先权日2011年3月4日
发明者夏冰, 李晓丹, 汪仁, 王进全, 谢建新 申请人:苏州天马医药集团天吉生物制药有限公司