专利名称：表达人有机阳离子转运体1的细胞模型构建及应用的制作方法
技术领域：
本发明属生物技术领域，涉及稳定表达野生型及突变体人有机阳离子转运体1 (hOCTl)的马丁达比狗肾上皮细胞(MDCK)模型的构建及应用。
背景技术：
膜转运体是一类广泛分布于细胞膜上，通过主动或被动机制专门介导外源性和内源性化学物质进出的蛋白质，它们一般有饱和性和底物专属性。膜转运体为人们进行药物研究，尤其是在药效学、药动学、新药研发、药物靶向设计方面提供了一个新的、前景广阔的方向。有机阳离子/阴离子/两性离子转运家族(SLC22)在很多内源性胺类化合物及外源性物质包括很多临床应用的药物的转运和清除中发挥着重要作用。该家族中的多专属性有机阳离子转运体OCTl (SLC22A1)，是一个包含5M个氨基酸的糖蛋白，包括12个跨膜区，N端和C端均位于细胞膜内侧，在第一个和第二个跨膜结构之间存在着一个较大的糖基化胞外环，在第六个和第七个跨膜结构之间有一个磷酸化位点的胞外环[1]，它的三维结构尚不明确。它在人体内主要分布于肝脏肝血窦一侧的肝细胞的基底外侧膜上，可以介导大量有机阳离子的吸收，对药物在肝脏中的处置起着重要作用。OCTl转运的经典底物有TEA (tetraethylammonium)、NMN(N-methylnicotinamide)、MPP+(l-methyl-4-phenylpyridini um)及一些药物如阿昔洛韦、金刚烷胺、地昔帕明、更昔洛韦、二甲双胍，甚至一些内源性物质如5-羟色胺，某些前列腺素。OCTl的编码基因为SLC22A1，SLC22A1具有显著的遗传多态性，目前已在多个种族中发现了多个基因突变，其中相当一部分已被证实具有显著的临床意义。目前由转运体介导的药物转运已被认为是药物的第三相代谢，药物在转运体水平的相互作用也被认为是引起代谢性药物相互作用的主要原因之一。因此药物在研发阶段就需要了解其和转运体的关系。由于从动物实验得到的结果不能简单地外推到人，因此稳定表达人源性转运体的细胞模型是研究药物与转运体关系的高通量和有效的体外模型。本研究通过建立体外稳定表达hOCTl野生型及两个重要突变体的细胞模型，为体外研究hOCTl 基因多态性对药物转运功能的影响，体外筛选hOCTl的底物及抑制剂的模型提供了理想的细胞模型。
发明内容
本发明的目的是提供一种稳定表达野生型及突变体人有机阳离子转运体1 (hOCTl)的马丁达比狗肾上皮细胞(MDCK)模型(MDCK / hOCTl模型)的构建方法，通过以下步骤实现
先从冰冻人肝组织中提取总RNA，经RT-PCR获得人的cDNA文库，以该cDNA为模板，通过设计含有BamH I ,Xho I两个酶切位点的特定引物(引物序列如SEQ ID No:4和5所示)， 获得人的野生型OCTl基因片段NM_003057，其核苷酸序列如SEQ ID No:l所示，将该基因片段添A后与pMD19-T连接得pMD19-T/h0CTl质粒，再将其转入大肠杆菌DH5 α进行质粒扩增，测序。测序正确，得到野生型基因后，以pMD19-T/h0CTl质粒为模板，通过定点突变(引物序列如SEQ ID No: 6-9所示)，获得含hOCTl的两个突变体基因hOCTlP34a (其核苷酸序列如SEQ ID No:2所示)，hOCTlM42(ldel (其核苷酸序列如SEQ ID No 3所示)的质粒pMD19_T/ h0CTlP341L，pMD19-T/h0CTlM42(ldel，将质粒转入大肠杆菌DH5 α进行质粒扩增，测序。测序正确后，将以上三种质粒通过大肠杆菌DH5ci扩增，抽提质粒后，用BamH I , Xho I两个酶进行双酶切得到hOCTl，hOCTIp34il，hOCTlM42Qdel5个基因片段。将载体质粒pcDNA3. 1 (+)也用同样的两个酶双酶切，得到含有与上述三个目的基因片段相同酶切位点的载体片段，通过 T4连接酶分别将三个目的基因片段与载体片段连接，构建pcDNA3. 1(+)- hOCTl,hOCTlP341L, hOCTlM420del三种质粒。再将质粒分别转染MDCK细胞，经过氨基糖苷类抗生素G418抗性筛选，得到稳定表达hOCTl野生型及两个常见突变体的MDCK细胞，分别为MDCK/ hOCTl, MDCK/ hOCTIp34il, /hOCTlM420del后，提取单克隆细胞株的总RNA，RT-PCR后通过前述hOCTl的特定引物4. 5进行PCR，mRNA水平验证基因的表达，通过经典底物，4-二甲氨基苯乙烯基)-N-甲基吡啶及N-甲基-4-苯基吡啶，并以四乙胺为hOCTl抑制剂进行细胞的摄取及抑制实验验证细胞功能。本发明的另一个目的是提供该MDCK/ hOCTl模型在有机阳离子转运体1 WhOCTl 底物及抑制剂筛选中的应用。通过以下步骤实现以4-二甲氨基苯乙烯基-N-甲基吡啶作为经典hOCTl荧光底物，与待测药物同时孵育，通过荧光强度判断待测药物对该转运体的抑制能力，抑制率超过50%，可以初步认为待测药物为hOCTl的抑制剂。本发明的积极效果是(1)随着临床上很多活性胺类药物的应用，有机阳离子转运体将会在研究药物的转运方面发挥更重要的作用。本研究建立的细胞模型可作为hOCTl 的底物或抑制剂的筛选模型，预测药物在人体内的转运；(2)由于临床合用药物的增多，转运体介导的药物相互作用已经引起人们的重视，利用该细胞模型可以预测由OCTl介导的药物间的相互作用；(3)利用本研究构建的野生型及突变体hOCTl细胞模型可以预测该转运体的基因多态性对药物转运功能产生的影响，为临床合理用药、个性化用药提供依据。
图IA是cDNA文库PCR产物电泳鉴定，条带1为Marker III，条带2、3为PCR产物电泳图。图IB是PCR产物连T载体后转化入DH5 α后菌液PCR电泳鉴定。图IC是菌液抽提质粒的电泳鉴定。图ID是鉴定正确的质粒双酶切后电泳鉴定。图2Α是pMD19-T/h0CTl质粒为模板定点突变的PCR产物电泳鉴定，Ml为pMD19-T/ hOCTIp34iu M2 为 pMD19-T/h0CTlM42。del。图2B是定点突变PCR产物胶回收后转化得到的菌液，PCR产物电泳鉴定。图2C 是 pMD19-T/h0CTlP341L，pMD19-T/hOCTlM420del 两种质粒的电泳鉴定。图2D 是 pMD19-T/h0CTlP341L，pMD19-T/hOCTlM420del 两种质粒的双酶切产物电泳鉴定。图3是pcDNA3. 1⑴连hOCTl转化后的质粒㈧及酶切鉴定⑶电泳图。条带1 为DL15000 Marker，条带2，3，4为三个质粒样品。图4是pcDNA3. 1⑴连h0CTlP341L转化后的质粒㈧及酶切鉴定⑶电泳图。条带1为DL15000 Marker，条带2，3,4, 5为四个质粒样品。图5是pcDNA3. 1 (+)连/hOCTlM420del转化后的质粒(A)及酶切鉴定(B)电泳图条带1为DL15000 Marker，条带2，3，4，5为四个质粒样品。图6 是在有或无抑制剂 TEA+ (3mM/L)存在下，ASP+ (5Mmol/L)在 MDCK/hOCTl (A)、 MDCK/ hOCTIp34il (B)及 MDCK/hOCTlM420del (C)中的积聚。图7是未转染hOCTl的MDCK细胞和积聚ASP+显著提高的MDCK/hOCTl (*1_31)、 MDCK/ hOCTIp34il (*2-19)、MDCK/h0CTlM42Qdel (*3_5)单克隆细胞，在有或无抑制剂 TEA 存在下与ΙΟμπιοΙ/L ASP+孵育后的荧光显微图像。图8 是在有或无抑制剂 TEA (3mmol/L)存在下，MPP+ (15Mmol/L)在 MDCK/hOCTl
(A),MDCK/hOCTIp34il (B)及 MDCK/ hOCTlM420del (C)中的相对积聚量。图9 是单克隆细胞 cDNA PCR 产物电泳鉴定，MDCK/hOCTl (A)，MDCK/ hOCTIp34il
(B)，MDCK/hOCTlM420del(C)，其中 con 为未转染 hOCTl 的 MDCK 细胞，*1_8，16，23，31，35 为 MDCK/hOCTl 单克隆细胞；*2-8，19，27，30 为 MDCK/ hOCTIp34il 单克隆细胞；*3_5，6，10，11 MDCK/ hOCTlM420del 单克隆细胞。图10是药物对MDCK/hOCTl* 1-31细胞积聚ASP+的影响。
具体实施例方式本发明结合附图和实施例作进一步的说明。实施例1
1.目的基因的制备 1.1野生型目的基因的获得
(1)根据人OCTl的DNA序列设计两条PCR引物。上下游引物分别设计一个酶切位点， BamH I，Xho I (下划线标出)
SEQ ID No:4 上游引物ATGGGATCCATGCCCACCGTGGATGACAT SEQ ID No:5 下游引物ATGCTCGAGTCAGGTGCCCGAGGGTTCT
(2)TRIzol法从人肝组织中提取总RNA，RT-PCR获得cDNA，再以cDNA为模板获得目的基因片段。应体系如下条件如下ι
权利要求
1.一种表达hOCTl的MDCK细胞模型的构建方法，其特征在于，通过以下步骤实现先从冰冻人肝组织中提取总RNA，经RT-PCR获得人的cDNA文库，以该cDNA为模板，通过设计含有BamH I , Xho I两个酶切位点的特定引物SEQ ID No: 1和SEQ ID No: 2，获得人的野生型OCTl基因片段NM_003057，其核苷酸序列如SEQ ID No 1所示，将该基因片段添A后与pMD19-T连接得pMD19-T/h0CTl质粒，再将其转入大肠杆菌DH5 α进行质粒扩增， 测序，测序正确，得到野生型基因后，以pMD19-T/h0CTl质粒为模板，通过定点突变，获得含 hOCTl的核苷酸序列如SEQ ID No 2所示的hOCTlP34a和核苷酸序列如SEQ ID No: 3所示的 hOCTlM420del 两个突变体基因的质粒 pMD19-T/h0CTlP341L，pMD19_T/h0CTl_del，将质粒转入大肠杆菌DH5ci进行质粒扩增，测序，测序正确后，将以上三种质粒通过大肠杆菌DH5 α扩增， 抽提质粒后，用BamH I ,Xho I两个酶进行双酶切得到hOCTl，hOCTIp34il，hOCTlM42(ldel三个基因片段，将载体质粒pcDNA3. 1(+)也用同样的两个酶双酶切，得到含有与上述三个目的基因片段相同酶切位点的载体片段，通过T4连接酶分别将三个目的基因片段与载体片段连接，构建pcDNA3. 1(+)- hOCTl, hOCT 1P341L, hOCTlM42(ldel三种质粒，再将质粒分别转染MDCK 细胞，经过氨基糖苷类抗生素G418抗性筛选，得到稳定表达hOCTl野生型及两个常见突变体的MDCK细胞，分别为MDCK/ hOCTl，MDCK/ hOCT 1P341L, /hOCTlM42(ldel，然后提取单克隆细胞株的总RNA，RT-PCR后通过前述hOCTl的特定引物进行PCR，mRNA水平验证基因的表达，通过经典底物4- 二甲氨基苯乙烯基)-N-甲基吡啶及N-甲基-4-苯基吡啶，并以四乙胺为 hOCTl抑制剂进行细胞的摄取及抑制实验验证细胞功能。
2.根据权利要求1所述的一种表达hOCTl的MDCK细胞模型的构建方法，其特征在于， 所述定点突变所用引物序列如如SEQ ID No:6-9所示。
3.根据权利要求1所述方法构建的一种表达hOCTl的MDCK细胞模型在有机阳离子转运体1抑制剂筛选中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，通过以下步骤实现以4-二甲氨基苯乙烯基-N-甲基吡啶作为经典hOCTl荧光底物，与待测药物同时孵育，通过荧光强度判断待测药物对该转运体的抑制能力，抑制率超过50%，则认为待测药物为hOCTl的抑制剂。
全文摘要
本发明提供一种表达人有机阳离子转运体1的细胞模型构建方法及应用，从肝组织中获得hOCT1的野生型基因片段，定点突变获得P341L，M420del两个突变体基因片段，并与质粒载体连接，染入MDCK细胞，经G418抗性筛选，获得表达hOCT1野生型及两个突变体的细胞，再对细胞进行mRNA水平验证，并用hOCT1经典底物及抑制剂进行功能验证。本发明的细胞模型可用于hOCT1的底物及抑制剂的筛选，预测药物在人体内的转运及可能发生的药物-药物相互作用。利用本发明提供的细胞模型可以预测该转运体的基因多态性对药物转运功能产生的影响，为临床合理用药、个性化用药提供依据。本发明设计合理，重复性好。
文档编号C12N15/12GK102181449SQ20111005257
公开日2011年9月14日 申请日期2011年3月6日 优先权日2011年3月6日
发明者孙思源, 曾苏, 李丽萍, 涂美娟, 石爱琴, 蒋惠娣, 陈忠坚 申请人:浙江大学