重组人二价金属离子转运蛋白腺病毒、制备及应用的制作方法

专利名称：：重组人二价金属离子转运蛋白腺病毒、制备及应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及基因工程
技术领域：
，特别是涉及一种利用重组腺病毒载体携带人二价金属离子转运蛋白(Divalentmetaltransporter-1,DMTl)基因、从而在生物体内能够自主表达二价金属离子转运蛋白的重组人二价金属离子转运蛋白腺病毒、其制备方法及应用。
背景技术：
：DMTl在人体组织分布十分广泛。RNA印迹分析显示DMT1在近端小肠表达最高，在肾、胸腺和脑有中等度的表达，而在睾丸、肝、结肠、心脏、脾、骨骼肌、肺、骨髓的含量相对较低。在细胞水平，DMTl特异地表达于某些细胞.在小肠，DMTl仅表达于小肠绒毛的肠上皮细胞，尤其在隐窝和绒毛较低部位含量最高，并从近端到远端表达呈逐渐减低，这种表达方式与小肠铁吸收的解剖位置一致。在脑内，DMTl主要发现在神经元上.然而，大多数的神经元表达DMTl的水平相对较低。原位杂交确定DMTlmRNA在不同组织定位的研究显示，DMTlmRNA存在于神经元及脉络丛上皮细胞，而同区的胶质细胞和室管膜细胞却不表达。在密集排列的细胞群，如海马锥体和颗粒细胞、小脑颗粒细胞、视上核和梨状皮层的锥体细胞，DMTlmRNA的表达相对较显著。在黑质，DMTlmRNA表达中等，在嗅核前部腹侧区,则含有大量的DMTlmRNA。DMTl有高度的疏水性，其氨基端和羧基端都嵌入胞浆内。第四跨膜区是其重要的功能区,如发生突变，将会严重干扰DMTl的正常功能。人类DMTl的基因组成已比较清楚.它包括17个外显子，由36kb核苷酸组成。DMT1mRNA存在两种形式，即"+IRE"和"-IRE"型。"+IRE"型的3'非翻译区含有与运铁蛋白受体(transferrinreceptor,TfR)mRNA的3'非翻译区相似的铁调节元件(ironregulatoryelement，IRE)。"-IRE"型则不包含有IRE结构."+IRE"型和"-IRE"型DMTl编码分别为561个和568个氨基酸(一)DMT1在外周的功能DMTl是哺乳动物细胞摄取二价铁的主要蛋白。近端小肠(十二指肠和空肠)是铁吸收的主要部位。铁在小肠的吸收通过两个转运过程，即粘膜吸收过程(铁进入肠吸收上皮细胞)和粘膜转运过程(铁从肠上皮细胞的基底侧转运入血液循环)。其中粘膜吸收过程被认为是机体维持铁平衡的最关键一步，但其机制一直不明。DMT1在小肠上皮细胞上的发现，才使这一问题的研究有了重大突破。现在知道，肠腔内铁主要是以二价的形式经小肠上皮细胞膜上的DMT1介导，由肠腔进入上皮细胞内。然后，再经新近发现的Ferroportin1介导由细胞内进入血液循环。DMT1介导的二价铁离子的转运是H+依赖的主动转运过程。在患有严重缺铁性贫血(microcyticanemia，mk)的小鼠和Begrade大鼠都存在相同的DMT1基因G185R位点的突变。他们均表现为小肠铁吸收障碍导致的铁严重缺乏的小细胞、低色素性贫血.此外，实验显示，机体的铁状态与小肠DMT1的表达紧密相关.当铁缺乏时，十二指肠细胞上DMT1的表达增加，而在高铁状态鼠的小肠，DMT1表达则明显下降。这些结果均显示DMT1是介导小肠铁吸收的重要转运蛋白。(二)DMT1在中枢神经系统中的作用用位点克隆方法发现mk小鼠和Begmde大鼠都有DMT1的基因突变，原有甘氨酸(G185R)被精氨酸替代。因此DMT1的基因突变被认为是导致mk小鼠和Begrade大鼠的铁吸收障碍，以及Begrade大鼠细胞内铁释放利用障碍的原因。遗传性血色素沉积症(hereditaryhemochromatosis,HH)是盛行于北欧的一种常染色体隐性遗传病.它的特征是铁广泛沉积在体内多个组织,如肝脏、心脏等，导致这些组织的纤维变性、坏死，最终因器官的衰竭而死亡。现已清楚，这种疾病重要原因之一是由一种HFE(hemochromatosisgene)突变(C282Y)所引起。最近的研究显示HH病人的十二指肠DMTlmRNA表达明显增加.在HFE基因敲除的小鼠，DMT1表达显著高于对照。在不存在HFE基因突变的HH的散发病例中，DMT1的表达也有增加。因此认为在HH病人小肠DMT1的表达异常增加可导致铁过度吸收，造成铁在组织细胞发生沉积。大脑需要铁，脑铁缺乏可以导致脑发育不良和智力障碍。然而铁在脑内过多沉积则可引发一系列病理反应，进而损害神经细胞，最终导致各种脑疾病发生，如各种神经退行性疾病(NDs),包括帕金森氏综合症(PD),阿尔茨默综合症等等。新近研究显示脑铁异常增高的原因可能是由於某些脑内铁转运蛋白表达失控。DMTl表达失控引起的脑内铁代谢紊乱可能也与某些NDs发生发展有关。DMTl分布在脑内的许多区域。含铁丰富的黑质有较高的DMTl存在，需要大量铁供给生长的细胞中DMTl也有高密度表达。脑内也存在两种形式的DMTlmRNA。"+IRE"与"-IRE"型的比率高於除小肠以外的其他组织。Roth等用大鼠的PC12细胞研究了这两种形式在神经细胞的分布和功能。结果发现"+IRE"型DMTl主要分布在细胞表面,树突或轴突的运输小泡以及细胞内含Tf游离铁的内吞小体上。"-IRE"型则主要分布在细胞核。这一发现显示"+IRE"可能主要发挥细胞摄取铁和胞内转运铁的功能，而"-IRE"型可能起有俘获核内二价金属并转运二价金属进入细胞核以及传递信号到细胞核和保持核内金属离子稳态的作用。已有报道在PD病人脑内黑质神经元DMT1有过高表达。而以往的病理研究显示黑质是PD病人铁异常过度沉积区域。因此一些研究者推测DMTl表达失控可能是引发某些NDs脑内铁过多沉积的众多原因之一。
发明内容本发明的目的就是针对现有技术的上述问题，提供一种在生物体内能够自主表达二价金属离子转运蛋白、从而提升体内二价金属离子转运蛋白(Divalentmetaltransporter-1,DMT1+IRE或DMT1-IRE)水平的重组人二价金属离子转运蛋白腺病毒。本发明的另一目的在于提供上述重组人二价金属离子转运蛋白腺病毒的制备方法。本发明的再一目的在于提供上述重组人二价金属离子转运蛋白腺病毒在制备药物方面的应用。为实现上述目的，本发明采用了以下技术方案本发明公开了一种重组人二价金属离子转运蛋白腺病毒(Ad-DMT1(-IRE)和Ad-DMT1(+IRE))，其包含有人二价金属离子转运蛋白(Divalentmetaltransporter-1，DMTl)基因与腺病毒载体，所述人二价金属离子转运蛋白(DMT1)为异构体DMT1-IRE或异构体DMT1+IRE。所述人二价金属离子转运蛋白基因插入所述腺病毒基因组中。所述人二价金属离子转运蛋白基因为通道型人二价金属离子转运蛋白基因。所述人二价金属离子转运蛋白基因的表达读码框包含巨细胞病毒(CMV)启动子、通道型人二价金属离子转运蛋白(Divalentmetaltransporter-1,DMT1+IRE或DMT1-IRE)基因以及下游的polyA信号。所述人二价金属离子转运蛋白基因含有序列表中SeqIDNo.l或S叫IDNo.2所示的序列，其中SeqIDNo.l对应异构体DMT1+IRE的基因序列，SeqIDNo.2对应异构体DMT1-IRE的基因序列。所述腺病毒为缺陷型腺病毒。所述腺病毒为1型腺病毒。所述腺病毒为缺失了El区的缺陷型腺病毒。本发明还公开了上述重组人二价金属离子转运蛋白腺病毒的制备方法，所述方法包括a、将人二价金属离子转运蛋白(Divalentmetaltransporter-1，DMT1+IRE或DMT1-IRE)基因与所述腺病毒的Ad-track穿梭质粒连接构建Ad-track-DMT1(+IRE或-IRE)重组载体；b、使所述Ad-track-DMT1(+IRE或-IRE)重组载体线性化；c、腺病毒的骨架质粒转化感受态细胞；d、Ad-track-DMT1(+IRE或-IRE)分别与腺病毒骨架质粒进行同源重组；e、使重组的病毒骨架质粒线性化后转染细胞进行病毒包装。其中步骤e的细胞优选为HEK293细胞。本发明进一步公开了上述重组人二价金属离子转运蛋白腺病毒在制备用于治疗铁代谢紊乱疾病的药物中的应用。'优选的，所述铁代谢紊乱疾病为铁缺乏引起的疾病，优选为缺铁性贫血。由于采用了以上技术方案，使本发明具备了以下技术效果本发明针对DMT1在体内铁代谢中的独特地位，构建DMT1重组腺病毒以基因替换的模式，可以针对性的对体内铁水平代谢进行调节，本发明的DMT1重组腺病毒，在缺铁性贫血、老年性痴呆以及心肌梗死等常见疾病上有着良好的预防以及治疗效果。本发明是利用缺陷型腺病毒将人二价金属离子转运蛋白(Divalentmetaltransporter-1，DMTl+IRE或DMT1-IRE)基因引入机体组织细胞，使病毒能在患者体内自主表达二价金属离子转运蛋白，提升体内二价金属离子转运蛋白的水平，调节细胞内铁的浓度，降低铁对于细胞的毒性，达到治疗缺铁性贫血等铁缺乏性疾病以及某些神经退行性疾病的目的。这种方法能够克服外源蛋白质不稳定、活性低、成本高以及免疫原性等缺点，并且能够保持蛋白质二级以及高级空间结构的自然特性，使得这一疗法成为大多数患者能够接受并有能力支付的治疗途径。利用缺陷型腺病毒作为载体，具有以下优点-1.腺病毒载体工艺流程简单，病毒滴度高；2.腺病毒载体转染率高，可操作性好；3.腺病毒载体宿主范围广，安全可靠，致病性低；4.腺病毒载体免疫反应弱，外源基因表达稳定持久；5.由CMV启动子控制二价金属离子转运蛋白(Divalentmetaltransporter-l，DMTl+IRE或DMTl-IRE)高效表达，调节体内血清铁水平；6.由于在真核细胞内自主表达蛋白，其产物具有天然蛋白的构象与活性，能完全模拟天然表达情况。图1是腺病毒穿梭质粒的多克隆位点图；图2是重组人二价金属离子转运蛋白(Divalentmetaltransporter-1，DMT1+IRE或DMT1-IRE)生产工艺流程图；图3是Ad-DMT1(+IRE与-IRE)系统mRNA表达情况图；图4是以GFP为标记，观察Ad-DMTl(+IRE与-IRE)系统感染细胞情况图；图5是Ad-DMTl(+IRE与-IRE)系统蛋白表达情况图。图6及图7是构建高血清铁动物模型并利用Ad-DMT1(+IRE与-IRE)系统进行体内实验的组织铁水平结果图。具体实施方式本发明针对二价金属离子转运蛋白构建重组腺病毒表达体系(Ad-DMT1+IRE或Ad-DMT1-IRE),提升体内二价金属离子转运蛋白(Divalentmetaltransporter-l，DMTl+IRE或DMTl-IRE)的水平，调节细胞内铁的浓度，降低铁对于细胞的毒性，达到治疗缺铁性贫血等铁缺乏性疾病以及某些神经退行性疾病的目的。本发明的重组人二价金属离子转运蛋白腺病毒(Ad-DMT1+IRE或Ad-DMT1-IRE)，包含有通道型人二价金属离子转运蛋白基因和缺陷型腺病毒。缺陷型腺病毒为l型腺病毒(Adeasy-1，Adl)。在本发明优选的实施方式中，选择了构建二价金属离子转运蛋白的重组腺病毒，其载体系统为Adeasy-l。Adeasy-l是缺陷性腺病毒的骨架质粒，通过其穿梭质粒Ad-track-CMV将外源性基因与病毒骨架整合，从而包装出具有广泛感染性的重组腺病毒。包装成功的重组腺病毒在一般的细胞内不能复制，具有安全、高效、简单易行等优点。Ad-DMT1结构重组人二价金属离子转运蛋白腺病毒(Ad-DMTl+IRE或Ad-DMTl-IRE)载体缺失了E1区，在普通细胞内不能包装为成熟病毒颗粒，为缺陷型病毒。人二价金属离子转运蛋白(Divalentmetaltransporter-1,DMT1+IRE或DMT1-IRE)基因为目的基因。我们将人通道型二价金属离子转运蛋白基因插入病毒的基因组中，以双CMV为其启动子，绿色荧光蛋白(GFP)为其标记物，下游polyA尾为其终止信号区。本发明的目的基因人二价金属离子转运蛋白基因含有序列表中SeqIDNo.l或SeqIDNo.2所示的序列，其中，DMT1+IRE基因含有SeqIDNo.l所示序列，DMT1-IRE基因含有SeqIDNo.2所示序列。重组人二价金属离子转运蛋白腺病毒(Ad-DMT1+IRE或Ad-DMT1-IRE)生产工艺流程包括重组载体构建、载体线性化制备、转染HEK293细胞、扩大培养、分离纯化、冷冻干燥以及包装制剂。具体地，重组人二价金属离子转运蛋白腺病毒(Ad-DMT1+IRE或Ad-DMT1-IRE)生产工艺流程包括a、将人二价金属离子转运蛋白(Divalentmetaltransporter-1,DMT1+IRE或DMT1-IRE)基因与所述腺病毒的Ad-track穿梭质粒连接构建Ad-track-DMT1(+IRE或-IRE)重组载体；b、分别使所述Ad-track-DMT1(+IRE或-IRE)重组载体线性化；c、腺病毒的骨架质粒转化感受态细胞；d、Ad-track-DMT1(+IRE或-IRE)与腺病毒骨架质粒进行同源重组；e、使重组的病毒骨架质粒线性化后转染细胞进行病毒包装。其中步骤e的细胞优选为HEK293细胞。本发明的重组人二价金属离子转运蛋白腺病毒可用于制备药物组合物，该药物组合物可用于治疗铁代谢紊乱疾病，包括任何类型铁过载引起的疾病与任何类型缺铁性贫血。可用于制备药物组合物时，本发明的重组人二价金属离子转运蛋白腺病毒可以制备成液体制剂，偏碱性，PH8.0，冻干后为白色粉末，可跟水与任何比例混合，无味，可作为针剂、喷剂。本发明是利用缺陷型腺病毒将人二价金属离子转运蛋白(Divalentmetaltransporter-l,DMTl+IRE或DMTl-IRE)基因引入机体组织细胞，使病毒能在患者体内自主表达二价金属离子转运蛋白。这种方法能够克服外源蛋白质不稳定、活性低、成本高以及免疫原性等缺点，并且能够保持蛋白质二级以及高级空间结构的自然特性，使得这一疗法成为大多数患者能够接受并有能力支付的治疗途径。利用缺陷型腺病毒作为载体，具有以下优点1、腺病毒载体工艺流程简单，病毒滴度高；2、腺病毒载体转染率高，可操作性好；3、腺病毒载体宿主范围广，安全可靠，致病性低；4、腺病毒载体免疫反应弱，外源基因表达稳定持久；5、由CMV启动子控制二价金属离子转运蛋白(Divalentmetaltransporter-l,DMT1+IRE或DMT1-IRE)高效表达，调节体内血清铁水平；6、由于在真核细胞内自主表达蛋白，其产物具有天然蛋白的构象与活性，能完全模拟天然表达情况。下面通过具体实施例对本发明作进一步详细的描述。实施例l二价金属离子转运蛋白基因插入重组如图1所示，pTrack-CMV为重组腺病毒的穿梭质粒。我们将二价金属离子转运蛋白基因两端接上BglII与SalI酶切位点，并加上polyA尾作为终止信号区。酶切二价金属离子转运蛋白基因与穿梭质粒，并将两者用T4连接酶进行连接转化，经筛选后，得到正确克隆，送测序公司测序鉴定。Ad-DMT1(+IRE或-IRE)结构重组人二价金属离子转运蛋白腺病毒(Ad-DMT1,+IRE或-IRE)载体缺失了El区，在普通细胞内不能包装为成熟病毒颗粒，为缺陷型病毒。人二价金属离子转运蛋白(Divalentmetaltransporter-1,DMTl+IRE或DMTl-IRE)基因为目的基因。我们将人通道型二价金属离子转运蛋白基因插入病毒的基因组中，以双CMV为其启动子，绿色荧光蛋白(GFP)为其标记物，下游polyA尾为其终止信号区。实施例2重组人二价金属离子转运蛋白腺病毒制备重组人二价金属离子转运蛋白腺病毒(Ad-DMTl，+IRE或-IRE)生产工艺流程包括重组载体构建、载体线性化制备、转染HEK293细胞、扩大培养、分离纯化、冷冻干燥以及包装制剂。具体见以下详述及其生产工艺流程图(见图2)。1、目的基因Divalentmetaltransporter-1,DMT1(+IRE或-IRE)的获取以含人基因组cDNA的作为模板，Pfu高保真酶PCR扩增。PCR热扩增条件为95。C变性5min，95°C80s,58°C100s，72°C120s，30个循环，最后72。C保温5min。产物约1710bp。DMT+IRE的引物序列为上游引物(SeqlDNo.3):下游引物(SeqlDNo.4):DMT-IRE的引物序列为上游引物(SeqlDNo.3):下游引物(SeqlDNo.5):PCR反应条件如下无菌水10xPCRBuffer4xdNTP引物1引物2Pfu聚合酶lfil0.5^10.5^1总体积:2、Ad-DMT1(+IRE或-IRE)穿梭质粒的构建A.双酶切PCR产物与Ad-track质粒，37'C酶切过夜。酶切体系构建如下PCR产物10xbufferlO(il<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>B.QIAquickGelextractionkit试剂盒法凝胶回收酶切片段；C.0.8%琼脂糖凝胶电泳，利用定量Marker初步估计核酸浓度；D.T4连接酶^C过夜，连接凝胶回收PCR产物与酶切质粒，连接体系如下Ad-track质粒酶切片断5filPCR产物酶切片断7|il1Oxbuffer2^1ddH204.5jilT4连接酶1.5^1总体积注先加入DNA片段与ddH2Q，45r温浴5min，且所有试剂加入前于(TC预冷。E.将连接产物转化入DH-5a感受态细菌中，涂板37"C过夜16h;F.次日每个平板挑取较小的克隆10个，小量法提取质粒；G.双酶切重组质粒；H.酶切产物5。/。聚丙烯酰胺凝胶电泳，银染显色；I.挑选切出相应小片断的克隆扩增，提取质粒；J.保存菌种与质粒，送样品测序鉴定，结果与预期一致。3、Pme-I线性化重组质粒利用Pme-I内切酶线性化穿梭质粒，凝胶回收线形化片断。酶切系统构建如下1Oxbuffer5pllOOxBSA0.5(il质粒DNA25jilPme-IlfilddH20_18.5^1总体积50^14、Adeasy-1质粒转化BJ5183，构建Ad-BJ5183细菌株A.用冷却的无菌吸头，吸取BJ5183感受态细胞200W至无菌离心管中；B.按照比例稀释Adeasy-1质粒；C.每组取lO^ll加入感受态细胞中；D.混匀内容物，冰浴30min;E.将管置42"循环水浴中，恰恰放置90s，不要摇动；F.迅速转至冰浴中，冷却2min;G.每管加800pl无抗生素LB培养基；37。C缓慢(45rpm)振荡45min;H.取200^1至含氨苄青霉素的LB琼脂平板，均匀涂布菌液；I.倒置平板,37°C，16h。J.次日观察结果，看生长菌落多寡是否与浓度梯度一致。5、Ad-track-DMT1(+IRE或-IRE)穿梭质粒与Adeasy-1同源重组A.将目的基因插入穿梭载体的多克隆位点，转化E.coli-DH5ot，铺卡那霉素抗性LB平板，挑取克隆，接种于5ml卡那霉素抗性LB液体培养基中，37'C震摇过夜，次晨提取质粒，PCR或酶切鉴定。B.提取的穿梭质粒经Pme-I酶切过夜，充分线性化(不完全消化往往产生较高的背景，从而降低重组率，将线性化质粒去磷酸化有助于降低背景信号)，凝胶纯化。C.将回收的线性化载体转入Ad-BJ5183感受态细胞内，铺卡那霉素抗性LB平板，置于37"C孵箱内培养14-16小时。D.挑取较小的克隆15-20个，接种于卡那抗性液体LB培养基5ml中，37。C震摇过夜。次晨收菌，立即提取质粒，酶切鉴定，选择成功重组的克隆，大量扩增，命名为Ad-DMT1(+IRE或-IRE)。6、病毒骨架Pac-I线性化利用Pac-I内切酶线性化上述病毒骨架质粒，37。C酶切过夜，以便在293A细胞中包装病毒。酶切体系构建如下1Oxbuffer5(jlIOOxBSA0.5^1Pac-IAd-DMT1DNA40jilddH203.5(il总体积7、病毒骨架鉴定与纯化灭菌取lO(al线形化病毒骨架双酶切鉴定，体系同前所述。鉴定后纯化酶切产物A.收集多管酶切产物，等体积酚-氯仿抽提2次；B.等体积氯仿单独抽提1次；C.加入1/10体积3MNaAC(PH5.2)以及2.5倍体积冰的无水乙醇，至于-8(TC1小时；D.4。C，16000r/min，离心10min;E.冰冷的75%乙醇洗涤沉淀，4"放置过夜；F.4。C，12000r/min，离心5min，移至超净台上操作；G.弃上清，无菌环境下干燥15min;H.50^1无菌ddH20溶解沉淀；I.取2^1电泳，测定核酸浓度。8、病毒包装A.将线性化质粒转染入HEK292细胞；B.放置15天左右，每隔3天换液一次。待细胞出现彗星状荧光收毒；C.大量扩增病毒，约培养100个9cm培养皿的细胞量后，进行超速梯度离心纯化；D.透析后测定滴度，分装后保存于-80度。实施例3Ad-DMT1(+IRE或-IRE)系统感染以及表达实验1、接种C6细胞1.5Xl()7个细胞于9cm培养皿(Corning)中，37°C，5%(302培养过夜；2、感染前换5ml无血清培养基；3、每个培养皿加0.5ul实施例2中制备得到的纯化病毒；4、分别培养0h，6h，12h，24h，48h5、按照时间点收集细胞；6、Real-timePCR与westen-blot定量检测不同时间点二价金属离子转运蛋白表达情况；7、统计结果。结果如图3、4、5所示，12小时左右二价金属离子转运蛋白mRNA水平表达已经达到空白对照组的15倍，并且持续表达。实施例4Ad-DMT1(+IRE或-IRE)体内实验(组织铁测定)1.选择3月龄SD大鼠雄雌各20只，按性别随机分为三组；2.三组实验鼠均以低铁饲料(购自SIGMA)喂养3个月，构建铁缺乏大鼠模型，并测定血清铁浓度；3.两个实验组注射Ad-DMT1(+IRE或-IRE)病毒稀释液，每次剂量为约1X10^个病毒颗粒，每3天注射一次，3次为一疗程；对照组注射PBS等渗盐水；4.一个疗程结束后，分别于3、6、9、12、15、18天处死大鼠，分别取心脏、大脑组织标本，冻干后利用测铁试剂盒测定组织铁含量。结果发现，从第6天开始，组织铁测定显示实验组的组织含铁量显著升高。结果如图6与图7所示。以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。序歹U表<110>钱忠明，葛啸虎，柯亚<120>重组人二价金属离子转运蛋白腺病毒、制备及应用〈130〉081008〈160〉5<170>Patentlnversion3.5<210〉1〈211〉1686〈212〉腿〈213>Homosapiens〈400〉1atggtgctgggtcctgaacagaagatgtcagatgacagtgtttctggagatcatggggag60tctgccagtcttggtaacatcaaccctgcctatagtaatccctctctttcacagtcccct120ggggactcagaggagtacttcgccacttactttaatgagaagatctccattcctgaggag180gagtactcttgttttagctttcgtaaactctgggctttcaccggaccaggttttcttatg240agcattgcctacctggatccaggaaatattgaatccgatttgcagtctggagcagtggct300ggatttaagttgctctggatccttctgttggccacccttgtggggctgctgctccagcgg360cttgcagctagactgggagtggttactgggctgcatcttgctgaagtatgtcaccgtcag420tatcccaaggtcccacgagtcatcctgtggctgatggtggagttggctatcatcggctca480gacatgcaagaagtcattggctcagccattgctatcaatcttctgtctgtaggaagaatt540cctctgtggggtggcgttctcatcaccattgcagatacttttgtatttctcttcttggac600aaatatggcttgcggaagctagaagcattttttggctttctcatcactattatggccctc660acatttggatatgagtatgttacagtgaaacccagccagagccaggtactcaagggcatg720ttcgtaccatcctgttxaggctgtcgcactccacagattgaacaggctgtgggcatxgtg7780ggagctgtcatcatgccacacaacatgtacctgcattctgccttagtcaagtctagacag840gtaaaccggaacaataagcaggaagttcgagaagccaataagtactttttcattgaatcc900tgcattgcactctttgtttccttcatcatcaatgtctttgttgtxtcagtctttgctgaa%0gcattttttgggaaaaccaacgagcaggtggttgaagtctgtacaaataccagcagtcct1020catgctggcctctttcctaaagataactcgacactggctgtggacatctacaaagggggt1080gttgtgctgggatgttactttgggcctgctgcactctacatttgggcagtggggatcctg1140gctgcaggacagagctccaccatgacaggaacctattctggccagtttgtcatggaggga1200ttcctgaacctaaagtggtcacgctttgcccgagtggttctgactcgctctattgccatc1260atccccactctgcttgttgctgtcttccaagatgtagagcatctaacagggatgaatgac1320tttctgaatgttctacagagcttacagcttccctttgctctcatacccatcctcacattt1380acgagcttgcggccagtaatgagtgactttgccaatggactaggctggcggattgcagga1440ggaatcttggtccttatcatctgttccatcaatatgtactttgtagtggtttatgtccgg1500gacctagggcatgtggcattatatgtggtggctgctgtggtxagcgtggcttatxtgggc1560tttgtgttctacttgggttggcaatgtttgattgcactgggcatgtccttcctggactgt1620gggcatacggtaagcatctctaaaggcctgctgacagaagaagccacccgtggctacgtt16801686<210>2〈211〉1707〈212〉DNA<213>Homosapiens〈400〉2atggtgctgggtcctgaacagaagatgtcagatgacagtgtttctggagatcatggggag60tctgccagtcttggtaacatcaaccctgcctatagtaatccctctctttcacagtcccct120ggggactcagaggagtacttcgccacttactttaatgagaagatctccattcctgaggag180gagtactcttgttttagctttcgtaaactctgggctttcaccggaccaggttttcttatg240agcattgcctacctggatccaggaaatattgaatccgatttgcagtctggagcagtggct300ggatttaagttgctctggatccttctgttggccacccttgtggggctgctgctccagcgg360cttgcagctagactgggagtggttactgggctgcatcttgctgaagtatgtcaccgtcag420tatcccaaggtcccacgagtcatcctgtggctgatggtggagttggctatcatcggctca480gacatgcaagaagtcattggctcagccattgctatcaatcttctgtctgtaggaagaatt540cctctgtggggtggcgttctcatcaccattgcagatacttttgtatttctcttcttggacGOOaaatatggcttgcggaagctagaagcattttttggctttctcatcactattatggccctc660acatttggatatgagtatgttacagtgaaacccagccagagccaggtactcaagggcatg720ttcgtaccatcctgttcaggctgtcgcactccacagattgaacaggctgtgggcatcgtg780ggagctgtcatcatgccacacaacatgtacctgcattctgccttagtcaagtctagacag840gtaaaccggaacastaagcaggaagttcgagaagccaataagtactttttcattgaatcc900tgcattgcactctttgtttccttcatcatcaatgtctttgttgtctcagtctttgctgaa%0gcattttttgggaaaaccaacgagcaggtggttgaagtctgtac已a已taccagcagtcct1020catgctggcctctttcctaaagataactcgacactggctgtggacatctacaaagggggt1080gttgtgctgggatgttactttgggcctgctgcactctacatttgggcagtggggatcctg1140gctgcaggacagagctccaccatgacaggaacctattctggccagtttgtcatggaggga1200ttcctgaacctaaagtggtcacgctttgcccgagtggttctgactcgctctattgccatc1260atccccactctgcttgttgctgtcttccaagatgt卿gc19atctaacagggatgaatgac1320tttctgaatgttctacagagcttacagcttccctttgctctcatacccatcctcacattt1380acgagcttgcggccagtaatgagtgactttgccaatggactaggctggcggattgcagga1440ggaatcttggtccttatcatctgttccatcaatatgtactttgtagtggtttatgtccgg1500gacctagggcatgtggcattatatgtggtggctgctgtggtcagcgtggcttatctgggcl刷tttgtgttctacttgggttggcaatgtttgattgcactgggcatgtccttcctggactgtgggcatacgtgccatctgggattgacagctcagcctgaactctatcttctgaacaccatg1680gacgctgactcacttgtgtctagatga1707〈210〉3〈211〉41〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉3ctcacagatctatggtgctgggtcctgaacagaagatgtca41〈210〉4<211>41<212〉DNA〈213〉人工序列<400〉4txaatgtcgacttatttaacgtagccacgggtggcttcttc41〈210〉5〈211〉41〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉5tcaatgtcgactcatctagacacaagtgagtcagcgtccat4权利要求1、重组人二价金属离子转运蛋白腺病毒，其特征在于包含有人二价金属离子转运蛋白(Divalentmetaltransporter-1，DMT1)基因与腺病毒载体，所述人二价金属离子转运蛋白(DMT1)为异构体DMT1-IRE或异构体DMT1+IRE。2、根据权利要求1所述的重组人二价金属离子转运蛋白腺病毒，其特征在于所述人二价金属离子转运蛋白基因插入所述腺病毒基因组中。3、根据权利要求2所述的重组人二价金属离子转运蛋白腺病毒，其特征在于所述人二价金属离子转运蛋白基因的表达读码框包含巨细胞病毒(CMV)启动子、通道型人二价金属离子转运蛋白(DMT1)基因以及下游的polyA信号。4、根据权利要求1所述的重组人二价金属离子转运蛋白腺病毒，其特征在于所述腺病毒为缺陷型腺病毒。5、根据权利要求4所述的重组人二价金属离子转运蛋白腺病毒，其特征在于所述腺病毒为1型腺病毒。6、根据权利要求4所述的重组人二价金属离子转运蛋白腺病毒，其特征在于所述腺病毒为缺失了E1区的缺陷型腺病毒。7、权利要求16中任意一项所述的重组人二价金属离子转运蛋白腺病毒的制备方法，所述方法包括a、将人二价金属离子转运蛋白(DMT1)基因与所述腺病毒的Ad-tmck穿梭质粒连接构建Ad-DMT1重组载体；b、使所述Ad-DMTl重组载体线性化；c、腺病毒的骨架质粒转化感受态细胞；d、Ad-DMT1与腺病毒骨架质粒进行同源重组；e、使重组的病毒骨架质粒线性化后转染细胞进行病毒包装。8、权利要求16中任意一项所述的重组人二价金属离子转运蛋白腺病毒在制备用于治疗铁代谢紊乱疾病的药物中的应用。9、根据权利要求8所述的应用，其特征在于所述铁代谢紊乱疾病为铁缺乏引起的疾病。10、根据权利要求9所述的应用，其特征在于所述铁代谢紊乱疾病为缺铁性贫血。全文摘要本发明公开了重组人二价金属离子转运蛋白腺病毒(Ad-DMT1，+IRE或-IRE)，分别包含有人二价金属离子转运蛋白两种异构体(Divalentmetaltransporter-1，DMT1+IRE或DMT1-IRE)基因与腺病毒载体。本发明还公开了上述重组人二价金属离子转运蛋白腺病毒的制备及其应用。本发明是利用缺陷型腺病毒将人二价金属离子转运蛋白两种异构体(DMT1+IRE或DMT1-IRE)基因分别引入机体组织细胞，使病毒能在患者体内自主表达二价金属转运蛋白。文档编号C12N15/12GK101538557SQ20081014191公开日2009年9月23日申请日期2008年8月19日优先权日2008年8月19日发明者亚柯,葛啸虎,钱忠明申请人:香港理工大学深圳研究院