专利名称：弓形虫重组卡介苗及制备方法
技术领域：
本发明提供了一种弓形虫重组卡介苗，用于预防治疗弓形虫病，本发明还提供了该疫苗的制备方法，属于疫苗制备技术领域。
背景技术：
弓形虫病(Toxoplamasis)是由刚地弓形虫引起的一种世界范围内广泛分布的人兽共患病，由于其宿主范围非常广，能够感染人及大多数动物。弓形虫感染对畜牧业生产危害严重，主要造成流产、畸胎、死产等。弓形虫的危害巨大，但对该病的防治至今尚未找到理想的药物。尽管抗寄生虫药物非常有效、廉价并且易于用药，但弓形虫耐药性的产生以及人们普遍关注的药物残留问题日益严重。相比而言，疫苗比较安全，无化学残留且无污染。有学者通过对弓形虫抗原及免疫效应的深入研究后认为有效的疫苗对该病的防治具有显著的意义。弓形虫疫苗的研究经历了灭活疫苗、减毒活疫苗等多种探索，前者刺激机体产生的抗感染能力弱，后者虽能较好地产生保护作用，但由于经突变后恢复毒力，故不适用于人类，因此，采用基因工程方法发展一种高效，廉价的新型弓形虫疫苗是本发明的任务。
发明内容
本发明提供一种弓形虫重组卡介苗，为穿梭表达载体弓形虫重组卡介苗和整合表达载体弓形虫重组卡介苗疫苗，具有热稳定性好，运输和保存较为容易，易于生产，产品不需纯化等特点。本发明还公开了弓形虫重组卡介苗的制备方法，适用于工业化生产。本发明弓形虫重组卡介苗的解决方案如下首先将获得刚地弓形虫保护性抗原基因，进行TA克隆，测序鉴定正确后酶切回收目的片段，再分别与同样进行酶切反应的大肠杆菌-分枝杆菌穿梭表达载体PMV261和整合表达载体pMV361相连，重组质粒转化到BCG， 经抗性和PCR筛选得到阳性刚地弓形虫重组卡介苗。本发明所提供的弓形虫重组卡介苗疫苗的制备方法
技术领域：
本发明以刚地弓形虫保护性抗原Cyclophilin (CyP)基因为例，进行穿梭表达载体和整合表达载体的构建，分别制成疫苗。、穿梭表达载体弓形虫重组卡介苗疫苗的制备
根据刚地弓形虫CyP基因序列的开放阅读框设计引物进行PCR，TA克隆。测序鉴定正确后进行双酶切，切胶回收，与进行同样酶切的PMM61穿梭表达载体进行连接，转入DH5 α 中，将重组质粒CyP161电穿孔转化卡介苗中，37°C培养至对数生长期后，筛选BCG重组子， PCR证实为阳性克隆后进行45°C热诱导表达，对基因表达产物进行SDS-PAGE电泳分析及 Western blotting 鉴定，命名为 rBCG pMV261-CyP0检测疫苗将制备好的穿梭表达载体刚地弓形虫重组卡介苗疫苗rBCG pMV261-CyP以IOOug/只的剂量通过口服、静脉注射两种不同免疫途径免疫BALB/c雌性小鼠，并同时设BCG组和空白对照组，三免一周后腹腔注射的方式接种弓形虫RH株速殖子进行攻虫试验，通过存活时间、存活率、脑组织包囊数、体液免疫水平和细胞免疫水平检测等指标进行综合评价。穿梭表达载体弓形虫重组卡介苗疫苗rBCG pMM61_CyP可对抗中等剂量刚地弓形虫的攻击，静脉注射试验组与对照组相比，特异性抗体滴度随免疫次数增加而逐渐升高，且差异极显著(P<0. 01)；⑶4+与⑶8+T淋巴细胞数均明显升高，且与对照组相比差异极显著 (P<0.01);CD4+/CD8+比值，各组差异不显著(P>0. 05)。经腹腔接种弓形虫1000个/只，结果为静脉注射试验组较对照组脑组织包囊数减少可达45%，小鼠存活时间与对照组相比差异显著(P<0. 05)。口服试验组与对照组相比，特异性抗体滴度随免疫次数增加而逐渐升高， 且差异显著(P<0.05)；⑶4+与⑶8+T淋巴细胞数均明显升高，且与对照组相比差异显著 (P<0. 05);CD4+/CD8+比值，各组差异不显著(P>0. 05)。经腹腔接种弓形虫1000个/只，结果为口服试验组较对照组脑组织包囊数减少可达41. 2%，小鼠存活时间与对照组相比均差异显著(P<0.05)。提示我们单独使用BCG对增强刚地弓形虫免疫保护力也有一定的效果， 其中以静脉注射方式免疫效果更好。、整合表达载体弓形虫重组卡介苗疫苗的制备
根据已发表的刚地弓形虫CyP基因序列的开放阅读框设计引物进行PCR，TA克隆。测序鉴定正确后进行双酶切，切胶回收，与进行同样酶切的PMV361穿梭表达载体进行连接， 转入DH5ci中，将重组质粒CyP-361电穿孔转化卡介苗中，37°C培养至对数生长期后，筛选 BCG重组子，PCR证实为阳性克隆后进行45°C热诱导表达，对基因表达产物进行SDS-PAGE电泳分析及 Western blotting 鉴定，命名为 rBCG pMV361-CyP0检测疫苗将制备好的穿梭表达载体刚地弓形虫重组卡介苗疫苗rBCG pMV361-CyP以IOOug/只的剂量通过口服、静脉注射两种不同免疫途径免疫BALB/c雌性小鼠，并同时设BCG组和空白对照组，三免一周后腹腔注射的方式接种弓形虫RH株速殖子进行攻虫试验，通过存活时间、存活率、脑组织包囊数、体液免疫水平和细胞免疫水平检测等指标进行综合评价。两种免疫途径使用重组卡介苗疫苗均能不同程度的提高免疫水平，免疫鼠CD4+ 与⑶8+的值和特异性抗体滴度等免疫指标均升高，静脉注射试验组与对照组相比差异显著(P<0. 05)，口服试验组与对照组相比差异显著(P<0. 05)，各组之间⑶4+/⑶8+比值差异不显著(P>0. 05)；攻虫试验显示，静脉注射试验组较对照组小鼠生存时间延长，与PBS对照组差异显著(P<0. 05)，脑组织包囊虫体数量减少，可减少34%。亲环蛋白(Cyclophilin，CyP)家族是一类广泛存在于原核和真核生物体内，并在结构上高度保守的多功能蛋白质。最近几年，寄生虫的CyI^s引起人们的极大注意，因为CsA 不仅是一种免疫抑制剂，而且它还具有抗寄生虫活性。环孢素A的抗寄生虫活性已经在一些原虫和肠道蠕虫上得到证明。TgCyP是细胞内、细胞间信息传递的介质，它能结合树状突细胞上的CCR5细胞因子受体，刺激树状突细胞产生IL-12。此外，TgCyP能够诱导产生一氧化氮，一氧化氮不仅在抑制弓形虫的繁殖过程中起到重要的作用，而且在诱导慢殖子的转变过程中也起着举足轻重的作用。通过对CyP的研究，有人认为CyP在宿主细胞对刚地弓形虫的保护性免疫反应中起到重要的作用。因此本发明选择使用Cyclophilin基因作为保护性抗原基因进行重组卡介苗的构建。这样的活载体疫苗既能发挥卡介苗本身较强的细胞免疫佐剂作用，又能使表达的蛋白发挥免疫保护作用，达到更好的预防弓形虫病的目的。因此这两种疫苗的研制具有非常广阔的前景和应用价值。将本发明提供的两种弓形虫重组卡介苗通过口服、静脉注射两种途径免疫BALB/ c雌性小鼠后，以腹腔注射的方式接种弓形虫RH株速殖子进行攻虫试验，通过存活时间、存活率、脑组织包囊数、体液免疫水平和细胞免疫水平检测等指标进行综合评价。结果显示， 刚地弓形虫重组卡介苗rBCG pMV261-CyP和rBCG pMV361-CyP组均具有明显的免疫促进作用，各指标均强于阴性对照组，具有很好的抗刚地弓形虫效果。本发明的积极效果在于利用卡介苗活载体疫苗本身具有较强的细胞免疫和体液免疫佐剂作用，而且又能高效表达刚地弓形虫蛋白，使表达的蛋白发挥很好的免疫保护作用，两者优势组合，达到更好的预防弓形虫病的目的。本发明疫苗热稳定性好，运输和保存较为容易，易于生产，产品不需纯化，可直接用于免疫保护试验，免去了蛋白质后处理的复杂工序，从而大大降低了成本，适宜于广大农村。
图1为PMV261-CyP载体构建示意图2为重组质粒pMM61-CyP在卡介苗表达SDA-PAGE结果； 图3为PMV361-CyP载体构建示意图； 图4为重组质粒pMV361-CyP在卡介苗表达SDA-PAGE结果。
具体实施例方式实施例1
本发明弓形虫重组卡介苗疫苗的制备
以刚地弓形虫保护性抗原Cyclophilin基因为例，进行穿梭表达载体和整合表达载体的构建。一、穿梭表达载体弓形虫重组卡介苗疫苗的制备步骤
参照Cyclophilin基因DNA序列及穿梭载体pMV261物理图谱设计两对引物并引入酶切位点。上游引物QFl :5，- GAATTCATGAAGCTCGTGCTGTTTTTCCT _3，；其中端含有 EcoRI 位点；
下游引物 QR :5，- GTCGACTTACTCCAACAAACCAATGTCCGT -3，；其中 5、端含有 SalI 位
点ο将PCR纯化产物克隆至pMDIS-T载体并进行PCR、酶切及测序鉴定，凝胶回收片段与同样进行酶切的穿梭表达载体PMV261连接，连接产物转化五cWi DH5a感受态细胞后筛选重组质粒，用EcoRIjall进行双酶切反应，重组质粒命名为pMM61_CyP(如图1所示)。 将BCG接种于MB7H9 ADC液体培养基中，37°C培养至对数生长期，离心收集菌体，沉淀用10% 甘油洗涤，最后重悬Iml 10%甘油中，用于电转化。取60-80ulBCG感受态菌液加入0. Iug重组质粒PMV261-CyP置于电转杯中。电穿参数电压2. 5KV，电容25 μ F，电阻1000 Ω。电穿孔转化后立即加入ΜΒ7Η9 ADC培养基中，37°C培养2d后涂布于含20ug/mlKan MB7H9 ADC培养基平板，约3w后长出转化菌落。从培养基平板上挑取BCG重组子，接种于液体培养基(含Kan)，37°C培养至对数生长期，PCR证实阳性克隆后，45°C水浴中诱导4h，离心收集菌体，并处理，最后加入等体积2 X SDS-PAGE上样缓冲液，100°C 5min。取12ul上述菌液SDS-PAGE 分析及Astern blotting鉴定(见图2)。二、整合表达载体弓形虫重组卡介苗疫苗的制备步骤
参照Cyclophilin基因DNA序列及穿梭载体pMV361物理图谱设计两对引物并引入酶切位点。上游引物QF2: 5，- CTCGAGATGAAGCTCGTGCTGTTTTTCCT -3，；其中端含有 XhoI 位点；
下游引物 QR :5，- ATCGATTTACTCCAACAAACCAATGTCCGT -3，；其中 5、端含有 ClaI 位
点ο将PCR纯化产物克隆至PMD18-T载体并进行PCR、酶切及测序鉴定，凝胶回收片断与整合表达载体PMV361连接，连接产物转化五cWi DH5a感受态细胞后筛选重组质粒，用和)(h0I、ClaI进行双酶切反应，重组质粒命名为PMV361-CyP (如图3所示)。取60_80ul感受态BCG菌液加入0. Iug重组质粒PMV361-CyP置于电转杯中。电穿参数电压2. 5KV,电容25 μ F，电阻1000 Ω。电穿孔转化后立即加入ΜΒ7Η9 ADC培养基中，37°C培养2d后涂布于MB7H9 ADC培养基平板。从培养基平板上挑取BCG重组子，接种于液体培养基，37°C培养至对数生长期，PCR证实阳性克隆后45°C水浴中诱导4h，离心收集菌体，并处理，最后加入等体积2 X SDS-PAGE上样缓冲液，100°C 5min。取12ul上述菌液SDS-PAGE分析及Western blotting鉴定(见图4)。试验例1
以下实验表明本发明弓形虫重组卡介苗疫苗的效果一、穿梭表达载体刚地弓形虫重组卡介苗疫苗
实验动物采用BALB/c雌性小鼠，18-22g，随机分为4组，每组10只。将穿梭表达载体重组卡介苗疫苗rBCG PMV261-Cyp以IOOug/只的剂量通过口服、静脉注射两种不同免疫途径免疫小鼠，并同时设BCG免疫组和阴性对照组。分三次免疫，每次间隔一周，三免一周后口服接种腹腔注射的方式接种弓形虫RH株速殖子IX IO3个/只进行攻虫试验，进行以下各项指标判定，包括存活时间、存活率、脑组织包囊数等，免疫后采血，流式细胞仪对CD4+、 CD8+进行细胞水平免疫检测，分离血清ELISA方法对体液免疫水平进行检测。攻虫后观察并记录各组小鼠死亡时间。取等质量死亡小鼠脑组织，用研钵磨碎， ImLPBS混勻，取100 μ L均分成四份镜检脑组织包囊数。结果显示各项指标均明显优于PBS 阴性对照组。结论说明我们所采用的免疫程序是安全有效的，静脉注射试验组较对照组脑组织包囊数减少可达45%，口服免疫组较对照组脑组织包囊数减少可达41. 2%，小鼠存活时间与对照组相比均差异显著(Ρ<0. 05)发挥了 BCG作为免疫增强剂的效果，效果尤为突出的是本发明所提供的穿梭表达载体弓形虫重组卡介苗疫苗rBCG PMM61-CyP，而免疫方式以静脉注射方式效果最佳(见表3，4 )。将发明的新型疫苗rBCG PMV261-CyP免疫小鼠后，于第三次免疫后1周，每组随机各取4只小鼠处死，取脾脏，加2mL PBS，在200目筛上研磨，用PBS稀释成细胞悬液(IO7 个/mL)。取100 μ L细胞悬液，加FITC标记的抗⑶4+和PE标记的抗⑶8+兔抗鼠单克隆抗体，避光作用40min，然后用PBS洗液洗2遍，加入0. 5mL荧光保存液，用流式细胞仪检测CD4+、CD8+ T淋巴细胞的数量，并用SPSS软件对所得数据进行统计学分析。结果表明免疫组及BCG组⑶4+、⑶8+变量明显高于阴性对照组，而rBCG PMV261-CyP静脉注射组小鼠的 ⑶4+、⑶8+ T淋巴细胞数均升高，与其他个组相比差异均显著(P<0. 05)。每次免疫前尾静脉采血，分离血清，用弓形虫RH株速殖子蛋白作为包被抗原，通过间接ELISA方法对小鼠血清中IgG变化情况进行检测。结果一免后各实验组与对照组相比IgG滴度变化不大，差异不显著。二免后IgG滴度逐渐上升，第三次免疫后，各实验组均显示一定的抗体效价，其中， rBCG PMV261-CyP静脉注射组血清抗体吸光度最高，于其它组相比差异极显著(P<0.01)。 (见表1，2)这证实本发明所提供的穿梭表达载体弓形虫重组卡介苗疫苗rBCG PMV261-CyP, 其最佳免疫方式是静脉注射。二、整合表达载体弓形虫重组卡介苗疫苗
实验动物采用BALB/c雌性小鼠，18-22g，随机分为4组，每组10只。将整合表达载体弓形虫重组卡介苗疫苗rBCG PMV361-CyP以IOOug/只的剂量通过口服、静脉注射两种不同免疫途径免疫小鼠，并同时设BCG免疫组和阴性对照组。分三次免疫，每次间隔一周，三免一周后口服接种弓形虫RH株速殖子1 X IO3个/只进行攻虫试验，进行以下各项指标判定， 包括存活时间、存活率、脑组织包囊数等，免疫后采血，流式细胞仪对CD4+、CD8+进行细胞水平免疫检测，分离血清ELISA方法对体液免疫水平进行检测。攻虫后观察并记录各组小鼠死亡时间。取等质量死亡小鼠脑组织，用研钵磨碎， ImLPBS混勻，取100 μ L均分成四份镜检脑组织包囊数。结果显示各项指标均明显优于PBS 阴性对照组。其中静脉注射试验组较对照组脑组织包囊数减少可达34%，口服免疫组较对照组脑组织包囊数减少可达31%，两组小鼠存活时间与对照组相比均差异显著(Ρ<0. 05)发挥了 BCG作为免疫增强剂的效果，效果尤为突出的是本发明所提供的弓形虫重组卡介苗疫苗 rBCG PMV361-CyP (见表 7，8)。将发明的新型疫苗rBCG PMV361-CyP免疫小鼠后，于第三次免疫后1周，每组随机各取4只小鼠处死，取脾脏，加2mL PBS，在200目筛上研磨，用PBS稀释成细胞悬液(IO7 个/mL)。取100 μ L细胞悬液，加FITC标记的抗⑶4+和PE标记的抗⑶8+兔抗鼠单克隆抗体，避光作用40min，然后用PBS洗液洗2遍，加入0. 5mL荧光保存液，用流式细胞仪检测 CD4+、CD8+ T淋巴细胞的数量，并用SPSS软件对所得数据进行统计学分析。结果表明免疫组及BCG组⑶4+、⑶8+变量明显高于阴性对照组，而rBCG PMV261-CyP静脉注射组小鼠的 ⑶4+、⑶8+ T淋巴细胞数均升高，与其他个组相比差异均显著(P<0. 05)。每次免疫前尾静脉采血，分离血清，用弓形虫RH株速殖子蛋白作为包被抗原，通过间接ELISA方法对小鼠血清中IgG变化情况进行检测。结果一免后各实验组与对照组相比IgG滴度变化不大，差异不显著。二免后IgG滴度逐渐上升，第三次免疫后，各实验组均显示一定的抗体效价(见表 5，6)。表1重组卡介苗疫苗pMV261_CyP免疫后各组小鼠血清特异性抗体IgG滴度变化情况。
表2 重组卡介苗疫苗pMM61_CyP免疫后试验组和对照组小鼠脾脏⑶4+和 ⑶8+T淋巴细胞数量。
权利要求
1.一种弓形虫重组卡介苗，其特征在于首先获得刚地弓形虫保护性抗原基因，进行 TA克隆，测序鉴定正确后酶切回收目的片段，再分别与同样进行酶切反应的大肠杆菌-分枝杆菌穿梭表达载体PMV261和整合表达载体pMV361相连，重组质粒转化到BCG，经抗性和 PCR筛选得到阳性刚地弓形虫重组卡介苗。
2.一种穿梭表达载体弓形虫重组卡介苗疫苗是通过以下步骤制备的根据刚地弓形虫CyP基因序列的开放阅读框设计引物进行PCR，TA克隆；测序鉴定正确后进行双酶切，切胶回收，与进行同样酶切的PMV261穿梭表达载体进行连接，转入DH5 α 中，将重组质粒CyP161电穿孔转化卡介苗中，37°C培养至对数生长期后，筛选BCG重组子， PCR证实为阳性克隆后进行45°C热诱导表达，对基因表达产物进行SDS-PAGE电泳分析及 Western blotting 鉴定。
3.根据权利要求2所述重组卡介苗疫苗的制备工艺，包括以下步骤1)参照Cyclophilin基因DNA序列及穿梭载体pMV261物理图谱设计两对引物并引入酶切位点上游引物 QFl :5，- GAATTCATGAAGCTCGTGCTGTTTTTCCT -3，；其中 5、端含有 EcoRI 位占.下游引物 QR :5，- GTCGACTTACTCCAACAAACCAATGTCCGT -3，；其中 5、端含有 SalI 位占.2)将PCR纯化产物克隆至pMDIS-T载体并进行PCR、酶切及测序鉴定，凝胶回收片段与同样进行酶切的穿梭表达载体PMM61连接，连接产物转化五C07iDH5 α感受态细胞后筛选重组质粒，用EcoRI、Sail进行双酶切反应，得pMM61_CyP重组质粒；3)将BCG接种于MB7H9ADC液体培养基中，37°C培养至对数生长期，离心收集菌体，沉淀用10%甘油洗涤，最后重悬Iml 10%甘油中，用于电转化；4)取60-80ulBCG感受态菌液加入0.Iug重组质粒PMV261_CyP置于电转杯中；电穿参数电压2. 5KV,电容25 μ F，电阻1000 Ω ；电穿孔转化后立即加入ΜΒ7Η9 ADC培养基中， 37°C培养2d后涂布于含20ug/mlKan MB7H9 ADC培养基平板，约3w后长出转化菌落；5)从培养基平板上挑取BCG重组子，接种于液体培养基(含Kan)，37°C培养至对数生长期，PCR证实阳性克隆后，45°C水浴中诱导4h，离心收集菌体，并处理，最后加入等体积2 X SDS-PAGE上样缓冲液，100 "C 5min ；取12ul上述菌液SDS-PAGE分析及Western blotting 鉴定6)将构建成功的含有CyP基因的rBCGpMV261-CyP接种于MB液体培养基中，37°C培养至对数生长期(3-4周)，离心收集菌体，沉淀用生理盐水洗涤2次，最后重悬于灭菌生理盐水中。
4.一种整合表达载体弓形虫重组卡介苗疫苗是通过以下步骤制备的根据刚地弓形虫CyP基因序列的开放阅读框设计引物进行PCR，TA克隆；测序鉴定正确后进行双酶切，切胶回收，与进行同样酶切的PMV361穿梭表达载体进行连接，转入DH5 α 中，将重组质粒CyP-361电穿孔转化卡介苗中，37°C培养至对数生长期后，筛选BCG重组子， PCR证实为阳性克隆后进行45°C热诱导表达，对基因表达产物进行SDS-PAGE电泳分析及 Western blotting 鉴定。
5.根据权利要求4所述重组卡介苗疫苗的制备工艺，包括以下步骤1)参照Cyclophilin基因DNA序列及穿梭载体pMV361物理图谱设计两对引物并引入酶切位点上游引物 QF2: 5’ - CTCGAGATGAAGCTCGTGCTGTTTTTCCT -3，；其中端含有 XhoI 位占.下游引物 QR :5，- ATCGATTTACTCCAACAAACCAATGTCCGT -3，；其中 5、端含有 ClaI 位占.2)将PCR纯化产物克隆至PMD18-T载体并进行PCR、酶切及测序鉴定，凝胶回收片断与整合表达载体PMV361连接，连接产物转化五cWi DH5a感受态细胞后筛选重组质粒，用 XhoI.Cla I进行双酶切反应，得PMV361-CyP重组质粒；3)60-80ul感受态BCG菌液加入0. Iug重组质粒PMV361-CyP置于电转杯中；电穿参数电压2. 5KV,电容25 μ F，电阻1000 Ω ；4)电穿孔转化后立即加入ΜΒ7Η9ADC培养基中，37°C培养2d后涂布于ΜΒ7Η9 ADC培养基平板；5)从培养基平板上挑取BCG重组子，接种于液体培养基，37°C培养至对数生长期，PCR 证实阳性克隆后45°C水浴中诱导4h，离心收集菌体，并处理，最后加入等体积2 X SDS-PAGE 上样缓冲液，IOO0C 5min ；取12ul上述菌液SDS-PAGE分析及Western blotting鉴定；6)将构建成功的含有CyP基因的rBCGpMV361-CyP接种于MB液体培养基中，37°C培养至对数生长期(3-4周)，离心收集菌体，沉淀用生理盐水洗涤2次，最后重悬于灭菌生理盐水中。
全文摘要
本发明提供一种弓形虫重组卡介苗及制备方法，首先将获得刚地弓形虫保护性抗原基因，进行TA克隆，测序鉴定正确后酶切回收目的片段，再分别与同样进行酶切反应的大肠杆菌-分枝杆菌穿梭表达载体pMV261和整合表达载体pMV361相连，重组质粒转化到BCG，经抗性和PCR筛选得到阳性刚地弓形虫重组卡介苗。本发明疫苗热稳定性好，运输和保存较为容易，易于生产，产品不需纯化，可直接用于免疫保护试验，免去了蛋白质后处理的复杂工序，从而大大降低了成本，适宜于广大农村。
文档编号C12R1/32GK102198267SQ20111006808
公开日2011年9月28日 申请日期2011年3月22日 优先权日2011年3月22日
发明者于钦磊, 宫鹏涛, 张倩, 张国才, 张楠, 张西臣, 李建华, 李 赫, 杨举 申请人:吉林大学