专利名称：一株以亚硝酸盐为氮源的好氧反硝化细菌及其筛选方法
技术领域：
本发明涉及一株反硝化细菌及其筛选方法。
背景技术：
传统的生物脱氮理论中反硝化过程只能在厌氧和缺氧条件下进行，完整的反硝化脱氮过程是硝酸盐(NO3--N)—亚硝酸盐(NO2--N)——氧化氮(NO)——氧化二氮(N2O)— 氮气(N2)，一般认为在这一过程中氧气的存在会阻止Ν03_-Ν和Ν02_-Ν作为最终的电子受体被还原，但是随着好氧反硝化菌Hiiosphaera pantotropha的被发现，Robertson首次证实了在好氧条件下，NO3^-N和NOf-N同样可以作为电子受体被Thiosphaera pantotropha还原为N2，这一现象随后在对许多好氧反硝化菌株的代谢过程研究中被证实。好氧反硝化菌的获得为实现同步硝化反硝化(SND)提供了新的途径，使用好氧反硝化菌的生物强化技术已经被证实可以在一个反应器中实现SND脱氮，与通过将好氧硝化和厌氧反硝化两段结合来实现SND脱氮的技术相比，其技术优势在于(1)使硝化-反硝化反应在同一个反应器中进行，可以大大减少占地面积和建设资金，缩短处理周期；( 使用好氧反硝化细菌，可以减少处理过程中加入调节系统PH的化学物质，降低成本；(3)在处理过程中，好氧反硝化菌更容易控制。然而对于实现短程硝化反硝化工艺而言，投加的好氧反硝化菌株还需要具备有效降解Ν02_-Ν能力。因此，为了更大程度的节约脱氮成本提高经济效益，就需要分离出高效的以NO2--N为代谢底物的好氧反硝化菌株。
发明内容
本发明提供了一株以亚硝酸盐为氮源的好氧反硝化细菌及其筛选方法；目的是为生物强化短程同步硝化-反硝化工艺提供了种源。以亚硝酸盐为氮源的好氧反硝化细菌，它为假单胞杆菌(I^eudomonas sp.)yy7, 属于假单胞菌属O^seudomonas)，已在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC No =M 2011157，保藏日期为2011年01月20日；它为革兰氏阴性好氧菌，为短杆菌，长为 1. 9 μ m 2. 2 μ m，宽为0. 5 μ m 0. 6 μ m，无芽孢和鞭毛；在牛肉膏蛋白胨培养基上形成不透明的乳白色菌落，菌落隆起且表面及边缘平滑。本发明中以亚硝酸盐为氮源的好氧反硝化细菌，它为假单胞杆菌(I^eudomonas sp. )yy7，其利用葡萄糖、接触酶阳性、氧化酶阴性、甲基红试验阴性、乙酰甲基甲醇阳性、 H2S试验阳性、淀粉试验阳性、明胶试验阳性、产生吲哚、生长pH值为7 8，生长温度为 10 30 。本发明中以亚硝酸盐为氮源的好氧反硝化细菌，它为假单胞杆菌(I^eudomonas sp.)yy7，其16S rRNA基因上有效长度约为580bp的核酸序列(GenBank中的序列登录号为 FJ440553)，将该序列放入GenBank进行比对，结果显示与pseudomonas sp.的16S rRNA序列的相似性最高，达到94%。结合细菌形态特征、生长条件、生理生化鉴定结果，确定假单胞杆菌O^seudomonas sp. ) yy7为假单胞菌属的一个新菌种。
本发明以亚硝酸盐为氮源的好氧反硝化细菌，它为假单胞杆菌(I^eudomonas sp. )yy7，属于假单胞菌属(I^eudomonas)，已在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为 CCTCC No =M 2011157，保藏日期为 2011 年 01 月 20 日。以亚硝酸盐为氮源的好氧反硝化细菌的筛选方法按以下步骤实现一、取哈尔滨污水厂A2/0工艺的好氧段污泥5mL接种到60mL的LB液体培养基中，在温度为25°C、120r/ min的好氧条件下恒温振荡培养24h后得污泥富集培养液；二、采用倍比稀释法将污泥富集培养液进行梯度稀释，并涂于固体选择性培养基上，放于恒温箱中在25°C条件下培养 120h，获得单一菌落，然后接种至15mL的LB液体培养基中，在温度为25°C、120r/min的好氧条件下恒温振荡扩大培养48h ；三、取扩大培养后菌液ImL接种到20mL液体选择性培养基中，在温度为25°C、150r/min的好氧条件下培养36h，然后以液体选择性培养基中Ν02__Ν 的去除效率作为指标进行筛选，选取Ν02_-Ν去除效率高于80%的菌液，经分离、纯化后，获得一株具有好氧反硝化功能的菌株，即完成以亚硝酸盐为氮源的好氧反硝化细菌的筛选；其中步骤二中固体选择性培养基每L由0. Ig的NaN02、0. 5g的KH2P04、0. 05g的 FeCl2 · 6H20、0. 02g 的 CaCl2、0. 5g 的 MgSO4 · 7H20、0. 3g 的乙酸钠、2g 的琼脂、ImL 的微量元素液和余量的水组成，PH值为7. 2 7. 5，115°C高压灭菌25min，所述微量元素液每L由 3g 的 FeSO4 · 7Η20、0· Olg 的 H3B03、0. Olg 的 Na2MoO4 · 2H20、0. 02g 的 MnSO4 · H20,0. Olg 的 CuSO4 · 5Η20、0· Olg 的 ZnS04、0. 5g 的 EDTA 和余量的水组成；步骤三中液体选择性培养基每L由0. Ig的NaN02、0. 5g的KH2P04、0. 05g的 FeCl2 ·6Η20、0. 02g的CaCl2、0. 5g的MgSO4 ·7Η20、0. 3g的乙酸钠、ImL的微量元素液和余量的水组成，PH值为7. 2 7. 5，115°C高压灭菌25min，所述微量元素液每L由3g的i^eS04*7H20、 0. Olg 的 Η3Β03、0· Olg 的 Na2MoO4 ·2Η20,0. 02g 的 MnSO4 ·Η20、0· Olg 的 CuSO4 · 5Η20、0· Olg 的 ZnS04,0. 5g的EDTA和余量的水组成。本发明提供的好氧反硝化菌株(假单胞杆菌(I^eudomonas sp.)yy7)以Ν02__Ν为唯一氮源进行生长代谢，为生物强化短程同步硝化-反硝化工艺提供了种源，有利于短程同步硝化-反硝化工艺的应用，节约了脱氮成本提高经济效益，具有很大的推广价值。本发明中假单胞杆菌O3Seudomonas 8 .)777对0)0、^)2-4去除率分别达到了 70. 7%和97. 3%。
图1为具体实施方式
一中假单胞杆菌(I^eudomonassp.)yy7的原子力学显微镜观察图；图2为具体实施方式
二中假单胞杆菌(I^eudomonassp.)yy7和相近菌株的16S rRNA基因序列构建的系统发育树谱图。
具体实施例方式具体实施方式
一本实施方式以亚硝酸盐为氮源的好氧反硝化细菌，它为假单胞杆菌(I^eudomonas sp. ) yy7，属于假单胞菌属(I^eudomonas)，已在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC No =M 2011157，保藏日期为2011年01月20日；它为革兰氏阴性好氧菌，为短杆菌，长为1. 9 μ m 2. 2 μ m，宽为0. 5 μ m 0. 6 μ m，无芽孢和鞭毛；在牛肉膏蛋白胨培养基上形成不透明的乳白色菌落，菌落隆起且表面及边缘平滑。本实施方式中假单胞杆菌(Pseudomonas sp. )yy7(见图1)，根据《伯杰氏细菌学鉴定手册》对其进行常规生理生化鉴定，实验结果为利用葡萄糖、接触酶阳性、氧化酶阴性、甲基红试验阴性、乙酰甲基甲醇阳性、氏3试验阳性、淀粉试验阳性、明胶试验阳性、产生吲哚。本实施方式中假单胞杆菌(I^eudomonas sp.)yy7的生长pH值为7 8，生长温度为 10 30°C。
具体实施方式
二本实施方式以亚硝酸盐为氮源的好氧反硝化细菌的筛选方法按以下步骤实现一、取哈尔滨污水厂A2/0工艺的好氧段污泥5mL接种到60mL的LB液体培养基中，在温度为25°C、120r/min的好氧条件下恒温振荡培养24h后得污泥富集培养液； 二、采用倍比稀释法将污泥富集培养液进行梯度稀释，并涂于固体选择性培养基上，放于恒温箱中在25°C条件下培养120h，获得单一菌落，然后接种至15mL的LB液体培养基中，在温度为25°C、120r/min的好氧条件下恒温振荡扩大培养48h ；三、取扩大培养后菌液ImL接种到20mL液体选择性培养基中，在温度为25°C、150r/min的好氧条件下培养36h，然后以液体选择性培养基中NO2--N的去除效率作为指标进行筛选，选取NO2--N去除效率高于80%的菌液，经分离、纯化后，获得一株具有好氧反硝化功能的菌株，即完成以亚硝酸盐为氮源的好氧反硝化细菌的筛选；其中步骤二中固体选择性培养基每L由0. Ig的NaN02、0. 5g的KH2P04、0. 05g的 FeCl2 · 6H20、0. 02g 的 CaCl2、0. 5g 的 MgSO4 · 7H20、0. 3g 的乙酸钠、2g 的琼脂、ImL 的微量元素液和余量的水组成，PH值为7. 2 7. 5，115°C高压灭菌25min，所述微量元素液每L由 3g 的 FeSO4 · 7Η20、0· Olg 的 H3B03、0. Olg 的 Na2MoO4 · 2H20、0. 02g 的 MnSO4 · H20,0. Olg 的 CuSO4 · 5Η20、0· Olg 的 ZnS04、0. 5g 的 EDTA 和余量的水组成；步骤三中液体选择性培养基每L由0. Ig的NaN02、0. 5g的KH2P04、0. 05g的 FeCl2 ·6Η20、0. 02g的CaCl2、0. 5g的MgSO4 ·7Η20、0. 3g的乙酸钠、ImL的微量元素液和余量的水组成，PH值为7. 2 7. 5，115°C高压灭菌25min，所述微量元素液每L由3g的i^eS04*7H20、 0. Olg 的 Η3Β03、0· Olg 的 Na2MoO4 ·2Η20,0. 02g 的 MnSO4 ·Η20、0· Olg 的 CuSO4 · 5Η20、0· Olg 的 ZnS04,0. 5g的EDTA和余量的水组成。本实施方式步骤一和二中LB液体培养基每IOOOmL由IOg的胰蛋白胨、5g的酵母浸粉、IOgNaCl的和余量的水组成，pH值为6. 0 8. 0，LB液体培养基在121°C下灭菌15 30min后使用。依据《伯杰氏细菌学鉴定手册》对以亚硝酸盐为氮源的好氧反硝化细菌进行常规生理生化鉴定，采用CTAB法进行细菌总DNA的提取。将所得细菌基因组DNA用细菌16SrRNA 通用引物进行PCR扩增，电泳后割胶回收PCR产物，将产物连接到pMD18载体后转入E. coli DH5 α，通过氨苄抗性和蓝白斑筛选获得阳性克隆，采用ΑΒΙ3730测序仪测序；将测得的序列与GenBank中的已有序列进行Blast比对，并用MEGA4. 1软件通过NJ方法对菌株的16S rRNA基因序列进行分类及系统发育分析(见图幻；本实施方式筛选得到的以亚硝酸盐为氮源的好氧反硝化细菌最相近的种属是假单胞菌属O^eudomonas)，同源性达94%，结合细菌形态特征、生长条件、生理生化鉴定结果，发现与本属其它菌种有区别，确定为假单胞菌属的一个新菌种，命名为假单胞杆菌O^eudomonas sp.)yy7。本实施方式筛选所得以亚硝酸盐为氮源的好氧反硝化细菌，它为假单胞杆菌 (Pseudomonas sp. )yy7的生长代谢分析
采用有机玻璃制备的圆柱体装置(Φ IOcmX 20cm)；将20mL菌液接种到300mL人工培养液中，控制曝气量为0. 06L/min，搅拌速度为180r/min ；人工培养液每L由0. Ig的 NaN02、0. 5g 的 ΚΗ2Ρ04、0· 05g 的 FeCl2 · 6Η20、0· 02g 的 CaCl2,0. 5g 的 MgSO4 · 7H20、lg 的乙酸钠、ImL的微量元素液和余量的水组成，pH值为7. 2 7. 5，115°C高压灭菌25min。生长代谢特性当初始COD为1200mg/L、Ν02__Ν为20mg/L，并维持恒定曝气量为 0. 06L/min时，菌株yy7能够正常地进行生长代谢，并表现出了明显的好氧反硝化特征；对其代谢过程各参数变化进行检测，结果为菌株yy7在其正常生长代谢过程中，能够同时利用CODW2以及NO2--N,其中COD作为电子供体，O2和Ν02__Ν作为电子受体，这符合前人对好氧反硝化菌株代谢途径解释；相应的，C0D、N02_-N去除率分别达到了 70. 7%和97. 3%。
权利要求
1.一株以亚硝酸盐为氮源的好氧反硝化细菌，其特征在于它为假单胞杆菌 (Pseudomonas sp. ) yy7，属于假单胞菌属(I^seudomonas)，已在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC No =M 2011157，保藏日期为2011年01月20日。
2.筛选以亚硝酸盐为氮源的好氧反硝化细菌的方法，其特征在于以亚硝酸盐为氮源的好氧反硝化细菌的筛选方法按以下步骤实现一、取哈尔滨污水厂A2/0工艺的好氧段污泥 5mL接种到60mL的LB液体培养基中，在温度为25°C、120r/min的好氧条件下恒温振荡培养24h后得污泥富集培养液；二、采用倍比稀释法将污泥富集培养液进行梯度稀释，并涂于固体选择性培养基上，放于恒温箱中在25°C条件下培养120h，获得单一菌落，然后接种至 15mL的LB液体培养基中，在温度为25°C、120r/min的好氧条件下恒温振荡扩大培养48h ； 三、取扩大培养后菌液ImL接种到20mL液体选择性培养基中，在温度为25°C、150r/min的好氧条件下培养36h，然后以液体选择性培养基中NO2--N的去除效率作为指标进行筛选，选取Ν02_-Ν去除效率高于80 %的菌液，经分离、纯化后，获得一株具有好氧反硝化功能的菌株，即完成以亚硝酸盐为氮源的好氧反硝化细菌的筛选；其中步骤二中固体选择性培养基每L由0. Ig的NaN02、0. 5g的KH2P04、0. 05g的 FeCl2 · 6H20、0. 02g 的 CaCl2、0. 5g 的 MgSO4 · 7H20、0. 3g 的乙酸钠、2g 的琼脂、ImL 的微量元素液和余量的水组成，PH值为7. 2 7. 5，115°C高压灭菌25min，所述微量元素液每L由 3g 的 FeSO4 · 7Η20、0· Olg 的 H3B03、0. Olg 的 Na2MoO4 · 2H20、0. 02g 的 MnSO4 · H20,0. Olg 的 CuSO4 · 5Η20、0· Olg 的 ZnS04、0. 5g 的 EDTA 和余量的水组成；步骤三中液体选择性培养基每L由0. Ig的NaN02、0. 5g的KH2P04、0. 05g的FeCl2 ·6Η20、 0. 02g的CaCl2、0. 5g的MgSO4 · 7H20、0. 3g的乙酸钠、ImL的微量元素液和余量的水组成，pH 值为7. 2 7. 5，115°C高压灭菌25min，所述微量元素液每L由3g的FeSO4 ·7Η20、0. Olg的 Η3Β03、0· Olg 的 Na2MoO4 · 2H20、0. 02g 的 MnSO4 · H20,0. Olg 的 CuSO4 · 5H20、0. Olg 的 ZnSO4, 0. 5g的EDTA和余量的水组成。
全文摘要
一株以亚硝酸盐为氮源的好氧反硝化细菌及其筛选方法，它涉及一株反硝化细菌及其筛选方法。以亚硝酸盐为氮源的好氧反硝化细菌，它为假单胞杆菌(Pseudomonas sp.)yy7，属于假单胞菌属(Pseudomonas)，保藏编号为CCTCC NoM 2011157，保藏日期为2011年01月20日。筛选一、制备富集培养液；二、固体选择性培养基上制备单一菌落，然后扩大培养；三、扩大培养后菌液在液体选择性培养基中进行筛选，选取NO2--N去除效率高于80％的菌液，经分离、纯化后即完成。本发明yy7以NO2--N为唯一氮源进行生长代谢，为生物强化短程同步硝化-反硝化工艺提供了种源。
文档编号C12N1/20GK102199561SQ20111006763
公开日2011年9月28日 申请日期2011年3月21日 优先权日2011年3月21日
发明者万春黎, 万芳, 杜茂安, 杨雪 申请人:哈尔滨工业大学