专利名称：密码子优化的艰难梭菌外毒素a羧基端基因序列及其核酸疫苗的制作方法
技术领域：
本发明属于生物医药技术领域，涉及密码子优化的艰难梭菌外毒素A羧基端基因片段及其核酸疫苗。
背景技术：
艰难梭菌是一种革兰氏染色阳性、有芽胞、专性厌氧的梭状杆菌。当前，艰难梭菌感染的预防、诊断、治疗面临着重重困难。一方面，艰难梭菌广泛存在于院内环境中，而且作为其休眠形式的芽胞能够耐受多种院内常用的消毒剂，它已经成为仅次于弯曲杆菌的院内感染性腹泻的主要病原体；甲硝唑、万古霉素，作为治疗艰难梭菌感染的两种主要的药物， 它们的耐药性也在不断地累积、传播，疗效日趋降低，而且对于复发病例的治疗，这两种药物呈现出无能状态。另外一方面，到目前为止，尚无有效的、商品化的疫苗问世；基于毒素的 ELISA检测试剂盒价格昂贵，难以对艰难梭菌进行临床常规检测，也不适用于大规模的流行病学调查和长期监测；治疗性抗体作为一种安全、有效、廉价的抗生素替代品，前景光明却依然处于探索期。所以，急需开发安全、有效、方便、廉价的艰难梭菌疫苗来保护高危人群； 同时，争取在疫苗的基础上开发相应的单克隆抗体，为诊断试剂及治疗性抗体打下扎实基石出。艰难梭菌通过粪口途径进入消化道，继而分泌外毒素而导致腹泻。其中，毒素A既是一种肠毒素，又是一种细胞毒素，是艰难梭菌致病的主要毒力因子。研究发现，艰难梭菌外毒素A只有当其羧基端与靶细胞表面受体结合后才能够发挥毒性作用；艰难梭菌外毒素 A的分子表面结构大部分为其羧基端所覆盖；针对艰难梭菌外毒素A羧基端的抗体，能有效抑制其肠毒性和细胞毒性，具有保护效应。所以，艰难梭菌外毒素A羧基端是疫苗研究和抗体开发的理想结构域。核酸疫苗(nucleicvaccine)，又名基因疫苗(gene vaccine)或 DNA 疫苗(DNA vaccine)，其本质是含有抗原基因的真核表达载体被导入动物机体后为动物细胞所摄取并表达相应的抗原蛋白，从而诱导机体对该蛋白的免疫反应。作为近几年来新兴的一种疫苗， 它以其独特的优点吸引着人们(1)抗原合成和递呈过程与病原体的自然感染相似，通过 MHC I类和II类分子直接递呈免疫系统。特别是诱导产生特异性CD8+淋巴细胞(CTL)的免疫反应，这是灭活疫苗和亚单位疫苗所不能比拟的；( 免疫原的单一性。只有载体上的抗原基因在细胞内得到表达，载体本身没有抗原性。而重组的病毒活载体疫苗除了目的基因表达外，还有其自身的许多蛋白得到表达；(3)易于构建和制备，稳定性好，成本低廉，适于大规模生产。但是目前用来构建核酸疫苗的目的基因绝大多数来自于病毒或细菌等原核生物，而疫苗的研究和应用对象主要为真核生物，如小鼠，猕猴或人类等高级哺乳动物。由于原核生物与真核生物在密码子使用偏好上存在差异，导致用来构建核酸疫苗的外源基因在哺乳动物宿主体内不能有效表达，因此就不能有效地刺激宿主的免疫系统产生较好的免疫保护作用。这是导致目前核酸疫苗免疫原性较低的主要原因。
发明内容
本发明的目的在于克服上述缺陷，提供一种密码子优化的艰难梭菌外毒素A羧基端基因序列。本发明的另一目的是提供一种由上述基因构建的艰难梭菌外毒素核酸疫苗。本发明的目的通过如下技术方案实现一种密码子优化的艰难梭菌外毒素A羧基端基因序列，序列为SEQ ID NO. 1一种艰难梭菌外毒素核酸疫苗，由序列为SEQ ID NO. 1的艰难梭菌外毒素A羧基端基因序列和真核表达载体组成。所述的真核表达载体为PJW4303。本发明提供的密码子优化的艰难梭菌外毒素A羧基端基因序列及其核酸疫苗的构建步骤如下(1)密码子优化的艰难梭菌外毒素A羧基端基因序列的设计和合成首先选取艰难梭菌外毒素A基因羧基端末尾978个碱基序列，然后运用软件 MacVector7. 2分析编码的基因序列，找出其密码子使用偏好同时找出与哺乳动物密码子使用偏好、与大肠杆菌密码子使用偏好不同的密码子位点。对于哺乳动物和大肠杆菌使用偏好相同的密码子，用哺乳动物和大肠杆菌都偏好的密码子替代艰难梭菌外毒素A基因中使用偏好不同的密码子，然后设计出密码子优化的艰难梭菌外毒素A羧基端序列，并经过基因公司的化学合成得到了密码子优化的艰难梭菌外毒素A羧基端基因序列。密码子优化的序列所编码的蛋白质氨基酸序列与原有的氨基酸序列保持一致。例如艰难梭菌外毒素A 基因中编码异亮氨酸Ile的三联体密码子主要是ATT，而在人类、小鼠等高级哺乳动物基因组中主要是ATC，在大肠杆菌中也主要是ATC，在密码子优化时会选用哺乳动物细胞和大肠杆菌都偏好的密码子ATC。优化后的艰难梭菌外毒素A羧基端基因序列为SEQ ID NO. 1，优化前的序列为SEQ ID NO. 2。(2)对基因公司提供的含有目标序列的重组载体pMK-RQ-TcdA-C进行酶切，用DNA 凝胶回收试剂盒(TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver. 2· 0，大连宝生物公司) 回收纯化9%bp的目的片段，该片段为在密码子优化的艰难梭菌外毒素A羧基端基因序列 (TcdA-C)两端分别连接有I3St I和BamH I酶切位点的基因序列，以便于核酸疫苗的构建。(3)将步骤⑵得到的基因片段克隆到真核表达载体PJW4303中，得到重组质粒 pJW4303-TcdA-C。经对重组质粒抽提、酶切、测序后，确定得到了与预期相符的质粒。本发明的有益效果与野生型基因相比，密码子优化的基因中哺乳动物细胞偏好的密码子和大肠杆菌偏好的密码子出现频率增加，但是其编码的艰难梭菌外毒素A羧基端氨基酸序列不变，从而使其更适于在哺乳动物细胞和大肠杆菌中的蛋白表达。由于自然界生物体存在密码子的偏好性，从病原体来源的艰难梭菌外毒素A羧基端基因克隆在异源宿主体内难以有效表达，因此就不能有效的刺激宿主的免疫系统，使之产生较好的免疫保护作用。为了提高异源基因在哺乳动物和大肠杆菌中的表达效率，往往需要对核苷酸编码序列进行优化。由于目前对核苷酸序列的优化尚没有统一的标准或原则。因此针对氨基酸序列，不同的研究人员完全会设计出不同的核苷酸序列用于目标多肽的表达和制造，相应地表达效率也可能存在差异。根据我们优化的核苷酸编码序列，克服了上述缺陷，提高了艰难梭菌外毒素A羧基端蛋白表达水平。并且将该优化后的基因用于构建核酸疫苗，在免疫哺乳动物后能有效地刺激了宿主的免疫系统，产生了较好的体液免疫反应。发明人将经过密码子优化的艰难梭菌外毒素A羧基端基因直接克隆入真核表达载体，构建了艰难梭菌核酸疫苗pJW4303-TcdA-C，该疫苗能够在真核细胞细胞中有效表达，免疫动物能刺激产生特异性抗体，而且被动保护试验显示该DNA疫苗的免疫兔血清可以明显降低BALB/c小鼠的死亡率。由此可见，pJW4303-TcdA-C DNA疫苗具有良好的免疫原性刺激产生特异性抗体，而且这些多克隆抗体具有良好的中和活性。
图1野生型和密码子优化的艰难梭菌外毒素A羧基端基因序列的密码子偏好性比较结果A为野生型和密码子优化艰难梭菌外毒素A羧基端基因序列在哺乳动物细胞表达偏好的比较(指数> 1为哺乳动物细胞所偏好)，纵坐标表示偏好指数，横坐标表示核苷酸序列位置。左图为野生型艰难梭菌外毒素A羧基端基因序列，右图为密码子优化的艰难梭菌外毒素A羧基端基因序列。B为野生型和密码子优化的艰难梭菌外毒素A羧基端基因序列在大肠杆菌表达偏好的比较(指数> 1为大肠杆菌所偏好)，纵坐标表示偏好指数，横坐标表示核苷酸序列位置。左图为野生型艰难梭菌外毒素A羧基端基因序列，右图为密码子优化的艰难梭菌外毒素A羧基端基因序列。图2质粒pJW4303-TcdA_C的酶切结果M，marker ；1 3泳道分别为所挑选的第一个克隆未经酶切，经BamH I单酶切， 经I^st I和BamH I双酶切的电泳图；其余依次类推分别为第2、3、4、5个克隆未经酶切，经 BamH I单酶切，经I3St I和BamH I双酶切的电泳图。图3转染pJW4303-TcdA_C的细胞目标蛋白表达的^festern blot分析结果1 :pJW4303-TcdA-C 转染裂解液；2 :pJW4303-TcdA-C 转染上清；3 :pJW4303 转染裂解液；4 :pJW4303转染上清。抗原为PJW4303空载体、pJW4303-TcdA-C转染细胞的培养上清或者裂解液，一抗为1 500稀释的免疫兔血清。图4pJW4303、pJW4303-TcdA_C免疫BALB/c小鼠后IgG抗体应答时间曲线A为pJW4303免疫BALB/c小鼠后的IgG抗体应答时间曲线，共6只小鼠(M1-M6)；B为ρΙ4303- ^(1Α-ε免疫BALB/c小鼠后的IgG抗体应答时间曲线，共7只小鼠 (M7-M13)。箭头表示免疫时间点。图5pJW4303-TcdA_C免疫新西兰白兔后的^festern blot分析结果1 :PJW4303-TcdA-C 转染裂解液；2 :pJW4303-TcdA_C 转染上清；3 :pJW4303 转染裂解液；4 :pJW4303转染上清。所用抗原为PJW4303空载体、pJW4303-TcdA-C转染细胞的培养上清或者裂解液，一抗为1 500稀释的免疫兔血清。图6pJW4303、pJW4303-TcdA-C免疫新西兰白兔后特异性IgG抗体最高滴度PJW4303表示空载体免疫新西兰白兔后的特异性IgG抗体最高滴度，共5只新西兰白兔；pJW4303-TcdA-C表示pJW4303-TcdA-C DNA疫苗免疫新西兰白兔后的特异性IgG 抗体最高滴度，共5只新西兰白兔。图7pJW4303-TcdA-C免疫兔血清在HT-四细胞系上的被动保护试验A图细胞形态图，1，细胞孔内未加4CTU艰难梭菌VPI 10463培养液超滤物(正常细胞对照)；2，细胞孔内只加入4CTU艰难梭菌VPI 10463培养液超滤物(毒素对照)；3， 细胞孔内加入的攻毒内容物为4CTU艰难梭菌VPI 10463培养液超滤物与1 200稀释的 pJW4303-TcdA-C免疫兔血清预混物；4，细胞孔内加入的攻毒内容物为4CTU艰难梭菌VPI 10463培养液超滤物与1 100稀释的pJW4303免疫兔血清预混物。B图PJW4303-TcdA-C免疫兔血清在HT19细胞系上的中和抗体滴度。图8ρΙ4303- ^(1Α-ε免疫兔血清在BALB/c小鼠上的被动保护试验“None”为商品化的纯艰难梭菌Toxin A IOOng ;“TcdA-C”为商品化的纯艰难梭菌 ToxinA 100ng+pJW4303-TcdA-C免疫后兔血清11 μ 1 ；“I^re-bleed”为商品化的纯艰难梭菌 ToxinA lOOng+pJWASOS-^rcdA-C 免疫前兔血清 11 μ 1。
具体实施例方式实施例1.密码子优化的艰难梭菌外毒素A羧基端基因序列的设计与合成首先用软件MacVector 7. 2分析编码艰难梭菌外毒素A羧基端基因序列，找出其密码子使用偏好以及与哺乳动物、大肠杆菌密码子使用偏好不同的位点。对于使用偏好不同的密码子位点，用哺乳动物细胞和大肠杆菌都偏好的密码子替代，设计出密码子优化的艰难梭菌外毒素A羧基端基因序列。上述密码子优化的基因序列所编码的蛋白质氨基酸序列与其原有的氨基酸序列一致。将设计好的序列交美国GENEART公司合成，装入载体 pMK-RQ，构建成重组质粒pMK-RQ-TcdA-C。经测序证实合成的序列正确。为了明确显示进行密码子优化的位点，现将密码子优化后的TcdA-C核酸序列与密码子优化前的TcdA-C核酸序列进行对比。比较结果如下(*为终止密码子)优化前ATG ATT AAA TTA AAA TTT GGT GTT TTT TTT ACA GTT TTA CTA TCT TCA GCA TAT优化后ATG ATC AAG CTG AAA TTC GGC GTG TTC TTC ACC GTG CTG CTG AGC TCC GCC TAC氨基酸MIKLKFGVFFTVLLSSAY优化前GCA CAT GGA ACA CCT CAA AAT ATT ACT GAT TTG TGT GCA GAA TAC CAC AAC ACA优化后GC^ CAC GGC ACC COG CAG AAC ATC ACC GAC CTG TGC GCC GAG TAC CAC AAC ACC氨基酸AHGTPQNITDLCAEYHNT优化前CM ATA CAT AOG CTA AAT GAT AAG ATA TTT TOG TAT ACA GAA TCT CTA GCT GGA优化后CAG ATC CAC ACC CTG AAC GAC AAA ATC TTC TCC TAC ACC GAG TCC CTG GCG GGC氨基酸QIHTLNDKIFSYTESLAG优化前MA AGA GAG ATG GCT ATC ATT ACT TTT AAG AAT GGT GCA ACT TTT CAA GTA GAA优化后MG OGC GAG ATG GCC ATC ATC ACC TTC AAG AAC GGC GCG ACC TTC CAG GTG GAG氨基酸KREMAI ITFKNGATFQVE优化前GTA CCA GGT AGT CAA CAT ATA GAT TCA CAA AAA AAA GCG ATT GAA AGG ATG AAG优化后GTG COG GGC AGC CAG CAC ATC GAC TCC CAG AAG AAA GCC ATC GAG OGC ATG AAG
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氨基酸 VPGSQHIDSQKKAIERMK优化前 GAT ACC CTG AGG ATT GCA TAT CTT ACT GAA GCT AAA GTC GAA AAG TTA TGT GTA优化后 GAC ACC CTG OGC ATC GCC TAC CTG ACC GAG GCC AAG GTG GAG AAG CTG TGC GTG氨基酸 DTLRIAYLTEAKVEKLCV优化前 TGG AAT AAT AAA AOG CCT CAT GOG ATT GCC GCA ATT AGT ATG GCA AAT TAA优化后 TGG AAC AAC AAG ACC COG CAC GCC ATC GCG GCC ATC AGC ATG GCG AAC TAA氨基酸 WNNKTPHAIAAISMAN*上述密码子优化的艰难梭菌外毒素A羧基端基因序列与野生型比较发生了偏好性改变。图1的软件MacVector 7. 2模拟结果可以看出，与野生型基因相比，密码子优化的基因中哺乳动物细胞偏好的密码子和大肠杆菌偏好的密码子出现频率增加，但是它们所编码的氨基酸序列不变，从而使其更适于在哺乳动物细胞和大肠杆菌中的蛋白表达。实施例2.真核表达载体pJW4303-TcdA_C的构建(I)TcdA-C片段、质粒PJW4303线性大片段的获得分别用Pst I和BamH I双酶切质粒ρJW4303和pMK-RQ-TcdA-C (由美国GENEART公司合成)。酶切反应体系为 lOXBufferTango 4 μ 1，质粒(pJW4303、pMK-RQ-TcdA-C) 10 μ 1，Pst I 1· 5 μ 1，BamHI 1. 5μ 1，补水至 40 μ l，37°C，2h。(2)酶切产物纯化上述酶切产物经10g/L的琼脂糖凝胶电泳后，置于紫外检测仪下，按照凝胶回收试剂盒(Agarose Gel DNA Purification Kit Ver. 2. 0，大连宝生物公司)说明书，切下含目的片段的凝胶，分析天平称胶块的质量，按Img = 1 μ 1计算胶块的体积。加入4倍体积的DR-I Buffer，置于75°C水浴中加热融化胶块，间断振荡混合，直至胶块完全融化，加入DR-I Buffer 体积的DR-II Buffer，充分混勻溶液。将离心吸附柱安置在收集管上，转移混合溶液至吸附柱中，12000印111，离心11^11。弃滤液，加入50(^1 Rinse A液，12000rpm，离心30s。弃滤液，加入700 μ 1 Rinse B液，12000rpm，离心30s，重复洗涤一次。将吸附柱安置在新的Ep管上，在吸附柱的膜中央滴加25 μ 1灭菌蒸馏水，静置60s。 12000rpm，离心lmin，此时Ep管中的洗脱液即为目的DNA溶液。测定DNA溶液的浓度，用 10g/L琼脂糖凝胶电泳分析割胶纯化效果，洗脱液保存在-20°C冰箱中备用。(3)连接反应用T4DNA连接酶将目的片段与质粒pJW4303线性大片段连接，得到pJW4303-TcdA-C重组表达质粒，即为本发明所提供的艰难梭菌外毒素A的核酸疫苗。连接反应体系为10XT4DNA Ligase Buffer 1 μ 1，线性化的pJW43031 μ 1，纯化的目的片段 7 μ 1，T4DNA Ligase 1 μ 1，混勻，16°C放置16h。连接物转化HBlOl感受态细胞。实施例3.重组质粒pJW4303-TcdA_C的鉴定3. lpJW4303-TcdA-C 分别转化 HB101 感受态细胞1)将10 μ 1连接物加入到装有100 μ 1 ΗΒ101感受态细胞的Ep管中，轻轻拍动管壁数次，充分混勻，冰浴30min。2)将Ep管置于42°C水浴中90s。3)向Ep管中缓慢加入LB培养基0. 5mL, 37°C，80rpm,振摇45min。4)将菌液涂布在含氨苄青霉素(0. lg/L)的LB平板上，37°C，培养过夜。3. 2筛选阳性克隆随机挑取5个单菌落，分别接种于5只培养试管(含0. lg/L氨苄青霉素的LB培养基)中，37°C，200rpm振摇，培养过夜。3. 3小量提取重组质粒pJW4303-TcdA_C (质粒小量提取试剂盒=TaKaRa MiniBEST PlasmidPurification Kit Ver. 2. O, TaKaRa 公司)1)将3. 2中摇过夜的细菌在无菌超净台中缓慢吸到1. 5ml离心管中，培养试管中剩下少量菌液保存于4°C。2)离心管中菌液，常温下12000rpm离心2min，弃上清。3)加入250 μ 1 Solution I充分悬浮细菌沉淀。4)加入250 μ 1 Solution II，温和颠倒5-6次，形成透明溶液。5)加入400 μ 1 4°C预冷的Solution III，温和颠倒5-6次，然后室温静置2min。6)室温 12000rpm，离心 lOmin。7) Spin Column 安置于 Collection Tube 上，将 6)中上清液加入到 Spin Column 中，12000rpm离心lmin，弃滤液。8)将 500 μ 1 Rinse A 加入 Spin Column 中，12000rpm 离心 30s，弃滤液。9)将 700 μ 1 Rinse B 加入 Spin Column 中，12000rpm 离心 30s，弃滤液。10)重复步骤9。11)将Spin Column安置在1. 5mlEp上，在膜中央滴加60 μ 1的灭菌蒸馏水，室温静置Imin12) 12000rpm离心lmin，洗脱液即为含有质粒的溶液。3. 4酶切鉴定质粒ρΙ4303- ^(1Α-〇质粒ρΙ4303- ^(1Α-(用BamH I单酶切，Pst I和BamH I双酶切。单酶切反应体系(10 μ 1) 10 X Buffer Tango Ιμ ，质粒(0· 22mg/mL) 2 μ 1，BamH I 0·5μ1，补水至 10 μ 1。双酶切反应体系(10 μ 1) 10 X Buffer Tango 1 μ 1，质粒(0. 22mg/mL) 2 μ 1，I3St I 0. 25μ 1, BamH I 0· 25 μ 1，补水至 10 μ 1。37°C孵育 2h。力口入 1 μ 1 IOXLoading buffer 终止酶切反应。10g/L琼脂糖凝胶电泳观察结果，酶切后电泳图谱见图2，图2显示5个克隆均构建正确。将酶切鉴定正确的细菌送上海英骏公司测序，测序正确细菌划三次平板，任选其中两个单克隆细菌保存。实施例4.质粒pJW4303-TcdA_C的大量制备(质粒大提试剂盒为QIAGEN Plasmid MegaKit (5)，Qiagen ^w])1)吸取鉴定正确的细菌保存液5 μ 1接种于5ml含氨苄青霉素的LB培养液中， 37°C，200rpm，过夜生长。幻按1 500将1)中培养菌液接种于1000ml含氨苄青霉素的LB培养液中，37°C， 200rpm，过夜生长。3)第二天将细菌移到250ml离心瓶中，4°C、6000g离心15min，弃上清，收集细菌。4)加入50ml缓冲液P1，反复振摇，使细菌全部重悬于溶液中。5)加入50ml缓冲液P2，温和颠倒5_6次，溶液呈均勻蓝色，静置5min。6)加入50ml缓冲液P3，温和颠倒5_6次，蓝色溶液消失，溶液分层，上层为结实的乳白色团块，下层为清亮液体，冰上放置30min。7)4°C，21000g，离心 30min，8)将上清转移至另一离心瓶，4°C，21000g，离心15min。
9)在吸附柱中加入QBT缓冲液35ml平衡吸附柱。10)将步骤8中得到的上清加到吸附柱内，滤过，弃滤液。11)加入洗涤缓冲液QC 200ml，过柱，弃滤液。12)加入洗脱缓冲液QF 35ml，过柱，收集滤液。13)向收集液体中加入5ml异丙醇，4°C，16000g，离心30min，弃上清。14)加入7ml 70%乙醇，常温16000g离心lOmin，弃上清。14)将有沉淀的离心管于超净台自然晾干，然后用Iml生理盐水溶解质粒团块。15)紫外分光光度法(波长260nm ^Onm)测定抽提所得溶液中的质粒浓度及 260/280 比值。实施例5.细胞转染细胞用含100U/ml青霉素、0. lmg/ml链霉素及10 %胎牛血清的DMEM高糖培养基在37°C，5% CO2饱和湿度培养箱内培养至对数生长期，用2. 5g/L胰酶消化后，以 5. O X IO6个细胞(6mL)接种于IOcm培养皿中，待生长至80%融合时，依据PEI转染法进行细胞转染。取 PEI 75 μ 1，pJW4303-TcdA-C 15 μ g，加含 lOOU/ml 青霉素、0. lmg/ml 链霉素的DMEM高糖培养基至825 μ 1，充分混勻，室温孵育15min，然后将上述混合液加到培养皿中并轻轻摇动使混合均勻，同时以PJW4303空质粒转染细胞作为阴性对照。他后更换不含血清含100U/ml青霉素、0. lmg/ml链霉素的DMEM培养液。继续培养4 后收获培养上清及细胞裂解液，进S^festern blot分析。分析结果如图3所示。图3中显示pJW4303-TcdA_C 转染细胞后可在上清及细胞裂解液中检出特异性蛋白的表达，其表观分子量约为 36kDa。阴性对照空载体PJW4303转染细胞的上清及裂解液没有检出特异性蛋白的存在。Western blot分析表明，pJW4303-TcdA_C核酸疫苗可以在细胞内表达相应的蛋白。说明经密码子优化后的核酸疫苗能在宿主细胞中表达蛋白。其中，转染细胞收获步骤为吸取细胞上清液，2500rpm，室温，离心lOmin，吸取上清-20°C冻存。用PBS (浓度10mM，pH7. 2)将细胞从培养皿中洗脱，收集细胞悬液，2500rpm， 室温，离心 lOmin，弃上清，加入裂解液(50mM Tris-HCl PH7. 6,150mM NaCl，1 % Triton，临用前加入2% IOOmM PMSF(苯甲基磺酰氟))，冰上孵育15min，12000rpm，4°C，离心60min， 收集上清液，-20°C冻存。实施例6.密码子优化pJW4303-TcdA-C核酸疫苗免疫原性的研究在核酸疫苗构建和表达成功后，对实验动物进行免疫，通过ELISA和Wfestern blot方法检测密码子优化的艰难梭菌外毒素A羧基端核酸疫苗的免疫原性和诱导产生的抗体的特异性。6. lpJW4303-TcdA-C免疫BALB/c小鼠和新西兰白兔，实验设计如下表IpΙ\ν4303- ^(1Α-ε 免疫 BALB/c 小鼠
权利要求
1.一种密码子优化的艰难梭菌外毒素A羧基端基因序列，序列为SEQ ID NO. 1。
2.—种艰难梭菌外毒素核酸疫苗，其特征在于该疫苗由权利要求1所述的艰难梭菌外毒素A羧基端基因序列与真核表达载体组成。
3.根据权利要求2所述的艰难梭菌外毒素核酸疫苗，其特征在于所述的真核表达载体为 pJW4303。
全文摘要
本发明属于生物医药技术领域，涉及密码子优化的艰难梭菌外毒素A羧基端基因片段及其核酸疫苗。该密码子优化基因序列兼顾了哺乳动物细胞和大肠杆菌密码子使用偏好，所涉及的艰难梭菌疫苗由密码子优化的外毒素A羧基端基因序列和真核表达载体pJW4303组成。经密码子优化后的艰难梭菌外毒素A羧基端基因片段，不但可以用于构建核酸疫苗，在免疫哺乳动物后有效地刺激了宿主的免疫系统，产生了较好的体液免疫反应，而且也适用于在大肠杆菌中对其进行蛋白的原核表达，为以后该蛋白的大量获取奠定了基础。
文档编号C12N15/31GK102199611SQ20111006760
公开日2011年9月28日 申请日期2011年3月21日 优先权日2010年3月23日
发明者卢山, 王世霞, 金柯, 黄祖瑚 申请人:卢山, 王世霞, 金柯, 黄祖瑚