专利名称：植物愈伤组织质量鉴定方法
技术领域：
本发明涉及植物组织培养技术领域，具体植物愈伤组织的检测及其应用。
背景技术：
目前我们对愈伤组织状态质量的判断都是基于观察得到的，也就是通过愈伤表面的形态观察，或者是通过愈伤组织的切片观察。组织形态观察简单方便需要非常丰富的经验，而且不同个体之间的判断结果差异比较大，有时表面状态并不一定代表生理状态因此出现误判，如我们在实验中就发现籼稻品种G44其外观符合胚性愈伤组织的特征但是转化率却极低。虽然切片观察能够更准确的从细胞水平判断，但是愈伤组织并不是均一的， 而是由不同质量状态的细胞组成，切片所取的样本量少，很难代表整个愈伤组织的整体状态，而且操作复杂。根据组织学观察、外观特征、愈伤组织的再生性和再生方式等，愈伤组织可分成两大类胚性愈伤组织(embryonic callus, EC)和非胚性愈伤组织(non-embryonic callus, NEC)。一般胚性愈伤组织质地较坚实，颜色有淡黄色或黄色，表面具球形颗粒，颗粒较脆，其生长缓慢；非胚性愈伤组织则表现出多种形态水质化，褐化，表面根/根毛状分化。从细胞形态特征来看，胚性愈伤组织由等直径细胞组成，细胞较小、原生质浓厚、无液泡、常富含淀粉粒、细胞核大、分裂活性强。非胚性细胞往往比较大、不规则形状、长形、易出现多核细胞。目前愈伤组织质量以组织形态观察为基础的，往往都是经验性的。至于愈伤组织形态结构的形成以及分子机理并不清楚。许多研究结果表明所观察的愈伤组织状态与其实际的生理状态并不完全相符合。例如，长时间培养的愈伤组织根据形态判定是为胚性愈伤组织，但这种愈伤组织却难以分化，甚至根本不能再生成为植株。愈伤组织的转化和分化的能力是不同的状态决定的(Lin, Y. J. and Q. F. Zhang (2005). Optimising the tissue culture conditions for high efficiency transformation of indica rice. Plant Cell Reports23(8) : 540-547.)，尚不清楚何种状态的愈伤组织适合于分化和遗传转化。现有的愈伤组织判定方法不能将不同生理功能的愈伤组织给予区分，因此，非常需要一种将愈伤组织质量研究从定性判断走向定量分析，更精确区分愈伤组织质量状态的生理生化分析方法，应用这种分析方法不仅能够判断愈伤组织是否适合进行遗传转化，而且有助于深入研究培养基组分对愈伤组织质量的影响，不同状态的愈伤组织基因表达的差异和表观遗传学机理。
发明内容
本发明的目的在于针对上述不足，提供一种鉴定愈伤组织质量的方法。本发明研究发现，愈伤组织的质量与其相对荧光值呈负相关，因而，可以通过检测愈伤组织的相对荧光值来评价愈伤组织的质量。本发明方法包括如下步骤将待检愈伤组织勻浆后，离心去上清，将沉淀悬浮于溶液中，测定其相对荧光值。上述待检愈伤组可以通过勻浆器勻浆，也可以通过人工研磨勻浆。勻浆时应将愈伤组织置于勻浆溶液中，例如NaCl溶液，在本发明实施例中采用IM的NaCl溶液，加入勻浆液的体积可以是愈伤组织体积的3飞倍，优选4倍。勻浆液通过离心去除上清，保留沉淀， 在13000-15000g下离心3-7min即可，优选14000g离心5min。沉淀用溶液重悬，例如用蔗糖溶液重悬，蔗糖溶液优选浓度为50%-80%，溶液的加入量按照上清等量(体积)加入。接着震荡使细胞壁碎片充分悬浮。再用溶液稀释5-10倍，例如用50%-80%的蔗糖溶液将悬浮液稀释10倍。上述荧光检测的激发光波长330-370nm，发射波长440-460nm，例如优选在360nm 激发光，445nm发射光下用荧光酶标仪读取相对荧光值。在本发明的一个优选实施实方式中，取200μ1加入96孔荧光板中，在360nm激发光，445nm发射光下用荧光酶标仪读取相对
荧光值。在检测中可以使用3个样品重复，并且读取7-10次取平均值作为此愈伤组织的相对荧光值，以使得检测结果更加准确。本发明的所述的愈伤组织可以是任何植物愈伤组织，包括但不限于禾本科、早熟禾科、葱科、六出花科、石蒜科、夹竹桃科、棕榈科、菊科、小檗科、红木科、十字花科、凤梨科、 大麻科、石竹科、藜科、秋水仙科、葫芦科、薯蓣科、麻黄科、大戟科、豆科、唇形科、亚麻科、石松科、芭蕉科、蓝果树科、罂粟科、松科、蔷薇科、茜草科、杨柳科、茄科、紫杉科、茶科以及葡萄科等植物，例如在水稻及小麦等农作物上。本方法首次采用愈伤组织的生理指标作为判断愈伤组织质量的方法，将愈伤组织质量判断从常规表面观察，主观经验性的定性研究，推进到用仪器进行生理生化定量分析， 本方法操作简单，而且能够准确地判断愈伤组织质量。
图1抗性愈伤组织PCR检测结果，检测目标基因为潮霉素，目标片段长度为CK为质粒对照。9，15，18为假阳性愈伤组织。图2抗性愈伤组织的⑶S染色结果CK为未转基因愈伤组织对照，6号为⑶S染色阴性愈伤。图3相对荧光值和转化效率之间的关系，转化率为潮霉素抗性&GUS染色阳性的愈伤组织数比上总共接种愈伤组织数。在相对荧光小于1500时转化率大约大于20%， 这时可以满足平时转化需求。转化率和相对荧光值之间存在着对数负相关，相关系数 R2=O. 8086。图4用相对荧光值分析愈伤组织在继代和诱导过程中质量变化情况。aill-yd: zhll 诱导；zhll-jd :zhll 继代；njx74-yd :njx74 诱导；njx74_jd :njx74 继代。图5籼稻生长在LY培养基上比生长在N6培养基上有着更高的质量，而粳稻质量相似，蓝色柱代表LY培养基，紫色柱代表N6培养基培养不同品种愈伤组织的相对荧光值。
具体实施例方式以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。实施例1用相对荧光值分析转基因效率 1.1材料说明转基因实验选了 10种愈伤组织分别是Sll 1-1，ZHl 1-2，9311-1,9311-2，9311-3， Njx74-1, Njx74-2, YTA-I, YTA-2，YTA-3。其中 ZHl 1-1，9311-1，Njx74_l，YTA-1 是在 LY 培养基上诱导和继代的愈伤组织，ZHl 1-2, 9311-3，YTA-3是在N6培养基上诱导和继代的愈伤组织，9311-2，Njx74-2, YTA-2是在LY培养基上诱导但是在N6培养基上继代的愈伤组织。其中LY培养基购自武汉珞樱生物科技有限公司(LY培养基试剂盒包括LY培养基，LY-A 试剂，LY-B试剂等)。转基因菌株EHA105 转基因质粒pCAMBIA1301
荧光检测取各种愈伤组织0. 5g加入aiil IM的NaCl溶液中，研磨至勻浆，14000g离心5min，其上清，沉淀用上清等体积的60% (W/V)蔗糖溶液重悬，接着震荡使细胞壁碎片充分悬浮。再用60% (W/V)蔗糖溶液将悬浮液稀释10倍。取200μ1加入96孔荧光板中，在 360nm激发光，445nm发射光下用荧光酶标仪读取相对荧光值。在检测中每个样品重复3次， 并且读取7-10次取平均值作为此愈伤组织的相对荧光值。1.2转基因方法诱导
诱导培养基
1，IL诱导培养基配制(根据需要等比例缩放)在1升的烧杯中加入800ml双蒸水，称取2. 5g Phytagel微波炉加热致全部融化。将IOOml 10XLY, IOml 100X铁盐(1升100* 铁盐配制方法称取I^eSO4 · 7H20 2. 79g完全溶解于1升蒸馏水后，加入NaEDTA 3. 7g至完全溶解，4摄氏度保存)，SOOmg酸水解酪蛋白，500mg谷氨酰胺；30g蔗糖加入到phytagel 溶液中。加入 Υ-Α:100μ1，双蒸水定容到1升。IM氢氧化钾调ρΗ值5.6-5.8
2，将培养基30ml每瓶分装到50ml容积三角瓶或50ml/瓶分装到IOOml容积的三角瓶中，用组配封口膜封口后115摄氏度灭菌15分钟。冷凝后即可用。成熟胚诱导(选用当年新收种子。在诱导之前进行烤种50摄氏度2天以上，此步骤可以减少霉菌污染提高发芽率和诱导率。)
1，成熟水稻胚去颖壳之后，75%酒精浸泡l.Omin ；2,0. 15%的HgCl2浸泡10分钟。3， 用灭菌水洗4遍，每次1分钟，再用灭菌水浸泡5分钟，用灭菌水再洗一次。接种到诱导培养基上，每瓶5 — 6颗。为保证诱导率接种时最好保持种子发芽方向与培养基平行或者稍微向下，不要让发芽方向向上或者垂直向下。放置34摄氏度环境下暗培养，在诱导25天后进行第一次继代。继代 继代培养基
1，IL继代培养基配制在1升的烧杯中加入800ml双蒸水，称取2. 5g Phytagel微波炉加热致全部融化。将100ml IOXLYUOml 100X铁盐、800mg酸水解酪蛋白、500mg谷氨酰胺、30g蔗糖加入到加入到融化后得到的phytegel溶液中。加入LY_B: ΙΟΟμΙ，双蒸水定容到1升。1 M KOH调ρΗ值5. 8。2，将培养基30ml每瓶分装到50ml容积三角瓶或50ml/瓶分装到IOOml容积的三角瓶中，用组配封口膜封口后115摄氏度灭菌15分钟。继代培养灭菌后在组培室(30-33 摄氏度)的环境中放置4-5天后方可使用。
5
继代操作第一次继代每50ml培养基放置4块诱导出愈伤组织，每30ml培养基放置3块诱导出的愈伤组织，继代15-20天待长出散开的愈伤组织可进行继代或直接转化。 挑取生长旺盛，质地坚硬，色泽嫩黄，颗粒直径3mm左右的愈伤组织进行继代，每50ml瓶接种0. 2克左右(直径3mm的愈伤5-6颗)。每IOOml三角瓶接种0. 3g左右(直径3mm的愈伤 8-9颗)。33-；34度生长10到15天。·
预培养
1升培养基配制(根据需要等比例缩放)在一个IL的可灭菌瓶中加入800ml双蒸水， 加入 3g Phytagel ； 100ml 10XLY ； IOml 100X 铁盐；800mg 酸水解酪蛋白；500mg 谷氨酰胺；30g蔗糖；LY-B :150μ1 ；双蒸水定容到1升。ρΗ值5. 8
115摄氏度灭菌15分钟。冷却到50摄氏度左右加入终浓度IOOMfflol的乙酰丁香酮； 倒平板30ml/9cm平叛。超净台晾干30min。预培养操作
将生长良好的愈伤组织块接种于预培养培养基上50-60块/9cm平皿，愈伤组织颗粒不易太大3mm左右，30-33度暗培养生长3_4天。此时愈伤状态应该是色泽黄而且致密。农杆菌准备于预培养前一天将转化好的农杆菌菌液在相应抗性的平板上划线， 30度生长36-48小时。再进行一次划线，生长M-36小时后可以进行转基因操作.
悬浮培养基
1，每一升悬浮培养基配制方法(根据需要等比例缩放)在一个IL的可灭菌瓶中加入 800ml双蒸水。加入50ml 10XLY ；5ml 100X铁盐；400mg酸水解酪蛋白；250mg谷氨酰胺；15g蔗糖；ΙΟΟμΙ LY-B ；双蒸水定容到1升。ρΗ值5.8。2，115摄氏度灭菌15分钟。灭好菌后4度，可长期放置使用时加入终浓度 IOOumol的乙酰丁香酮。悬浮侵染操作将生长好的农杆菌平板上的农杆菌刮到农杆菌悬浮培养基里，30 度震荡，OD值在0. 02左右的范围内即可转基因侵染。将预培养的愈伤组织转移到悬浮的菌液中，室温浸泡2-5min。共培养同预培养培养基
共培养操作将侵染中在菌液中的菌液到掉，浙干农杆菌菌液，将愈伤放置在灭菌后风干的多层(8-10层)滤纸上，尽量浸干农杆菌菌液，超净台晾干20-30min，以免共培养的时候农杆菌生长过多，对愈伤损害过度。然后将滤纸上的愈伤颗粒挑到共培养培养基上，每皿 70颗左右，30度暗培养48-72小时。共培养要跟踪观察，如果见农杆菌出现表示浸染过度。 后续筛选容易长菌。筛选筛选培养基
1.每一升配制方法在一个IL的可灭菌瓶中加入800ml双蒸水，加入3.5g Phytagel ； 100ml 10XLY ； IOml 100X铁盐；800mg酸水解酪蛋白；500mg谷氨酰胺；30g蔗糖；150μ1 LY-B ；双蒸水定容到1升。IN氢氧化钾调ρΗ值5. 4-5. 8
2.115摄氏度灭菌15分钟。冷却到50摄氏度左右加入40mg/L终浓度的潮霉素， 500mg/L终浓度的头孢，倒平板30ml/9cm平叛。超净台晾干30-60min。筛选操作将预筛选平板上的愈伤均勻的放在筛选培养基上20-30颗/皿。30度暗培养(第一次筛选10天，第二次筛选长出阳性愈伤(约30天)。将新长出的阳性克隆再转接到筛选培养基培养7天，对生长正常的愈伤组织进行统计数量。并进一步进行PCR检测和⑶S染色检测。1.3转基因检测
1. 3. 1愈伤组织基因组提取
1 升 2*CTAB 配制方法称取 20g CTAB, 81. 82g NaClU M Tris-HCl ( ρΗ8· 0) 100ml,0. 5 mol/1 EDTA( pH8. 0) 40ml在IL的容量瓶中定容至IL摇勻，高压灭菌后，降至室温，冷却后加入的2-巯基乙醇(0. 2-1%使用前加入)，4°C保存。提取步骤
1.2%CTAB抽提缓冲液和0. 4%的巯基乙醇在65°C水浴中预热；
2.取200mg左右的愈伤组织放入1.5ml的EP管，并放入一个直径3mm左右钢珠；
3.加入200μ 1的2%CTAB抽提缓冲液，研磨仪震荡研磨20seC ；
4.置于65°C的水浴槽或恒温箱中，每隔5min轻轻摇动，45 min后取出；
5.冷却2min后，加入400 μ 1等体积氯仿-异戊醇( : 1)，缓慢振荡抽提10 min，使两者混合均勻；
6.14000g离心5min，移液器轻轻地吸取上清液至另一新的灭菌离心管中；
7.加入400μ 1的异丙醇，均勻混合，4度放置15min ；
8.14000g离心5 min后，立即倒掉液体，注意勿将白色DNA沉淀倒出
9.加入800μ 1 75的乙醇(均可以)，洗涤DNA ；
10.14000g离心Imin后，立即倒掉液体，蒸干乙醇；
11.加入50μ 1双蒸水，使DNA溶解； 1.3.2 PCR检测方法
PCR体系 ddH20 IO^buffer Mg2+ (25mM) Hpt+ (IOmM) Hpt- (IOmM) Taq DNA
PCR循环
1，940C 5min
2，94°C 30sec
3，60°C 45sec
4，72°C 30sec
5， 2-4步重复35个循环
6，72 °C 3min
7，4°C IOmin
潮霉素引物
16. 5μ 1
2. 5μ 1
2μ 1 1 μ 1 1 μ 1
IU
1 μ 1hpt+: ACGGTGTCGTCCATCACAGTTTGCC
hpt-: GGAAGTGCTTGACATTGGGGAGT
1. 3. 3⑶S染色检测方法
⑶S染液组成
K3 [Fe (CN)6]5mM,
K4 [Fe(CN)6] · 3H20 5mM,
Na2EDTA50mM,
X-Gluc0. 1% (ff/V)
溶解于 PBS ( 0. 1M, ρΗ7· 0)
染色方法，取IOOmg左右的直径2-3mm的愈伤组织放于Iml⑶S染液中30度显色12 小时。 1. 4结果和分析
表1 转基因愈伤组织的相对荧光值和筛选结果
权利要求
1.植物愈伤组织质量鉴定方法，其是通过检测愈伤组织的相对荧光强度来鉴定愈伤组织的质量。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，该方法将待检愈伤组织勻浆后，离心去上清，将沉淀悬浮于溶液中，测定其相对荧光值。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，测定相对荧光值的条件是激发光波长 330-370nm,发射波长 440_460nm。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述激发光波长为360nm，发射光波长为 445nm。
5.根据权利要求2、任一项所述的方法，其特征在于，所述勻浆是在IMNaCl的溶液中进行。
6.根据权利要求2、任一项所述的方法，其特征在于，在13000-15000g下离心 3-7min，去除上清，加入等体积的50%_80% (W/V)蔗糖溶液重悬，震荡使细胞壁碎片充分悬浮，再50%-80% (W/V)蔗糖溶液稀释5 10倍。
7.根据权利要求1、任一项所述的方法，其特征在于，所述荧光的相对强度与愈伤组织的质量呈负相关。
8.权利要求广7任一项所述的方法用于分析培养基的质量，评估愈伤组织的质量或预测愈伤组织的基因转化效率。
全文摘要
本发明涉及一种用于鉴定愈伤组织质量的方法，通过检测愈伤组织的相对荧光强度来鉴定愈伤组织的质量。本发明首次采用愈伤组织的生理指标作为判断愈伤组织质量的方法，将愈伤组织质量判断从常规表面观察，主观经验性的定性研究，推进到用仪器进行生理生化定量分析。本方法操作简单，而且能够准确地判断愈伤组织质量。
文档编号C12Q1/68GK102181512SQ20111006751
公开日2011年9月14日 申请日期2011年3月21日 优先权日2011年3月21日
发明者丁博, 李阳, 李阳生 申请人:武汉大学