日本血吸虫SjTollip重组抗原蛋白及其制备方法和用途的制作方法

专利名称：日本血吸虫SjTollip重组抗原蛋白及其制备方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子和细胞生物学研究领域，具体涉及日本血吸虫SjTollip的重组抗原蛋白及其制备方法。此外，本发明还涉及该日本血吸虫SjTollip重组抗原蛋白作为日本血吸虫病防治疫苗的应用。
背景技术：
血吸虫病是由于人或哺乳动物感染了血吸虫所引起的一种人畜共患寄生虫病。血吸虫病历史悠久，分布广泛，在世界范围内其患病人数仅次于疟疾，是第二大热带寄生虫病。据1998年WHO血吸虫病专家咨询报告，估计全世界有76个国家和地区流行血吸虫病， 被感染的人口达2亿，受威胁人群5-6亿，其中有症状的约1. 2亿人，重症和伤残2000万人，每年死亡2万人，严重影响着人类的健康和社会经济的发展。我国曾经是日本血吸虫病流行最严重的国家之一，历时2100多年。通过半个世纪的努力，我国血吸虫病防治工作取得了巨大成就。然而近年来，在我国血吸虫病的流行区，疫情有所回升，并正逐步向城市蔓延，血吸虫病防治工作面临严峻形势。血吸虫病的严重疫情引起了党和国家领导的高度重视，国家卫生部已将其与艾滋病、乙型肝炎、肺结核共同列为我国须重点防治的4个重大传染病。感染人体的血吸虫共有19种，主要的病原为曼氏血吸虫(Schistosoma, mansoni)、日本血吸虫(S. japonicum)、埃及血吸虫(S. haematobium)、间插血吸虫 (S. intercalatum)和湄公血吸虫(S. mekongi)等。血吸虫生活史比较复杂，包括在哺乳动物终宿主体内的有性世代和在中间宿主螺体内的无性世代的世代交替，其生活史分虫卵、 毛蚴、胞蚴、尾蚴、童虫和成虫6个阶段。血吸虫病被世界卫生组织列为再现传染病，是一种极易再感染、并卷土重来的寄生虫病。在我国和亚洲，日本血吸虫是引起严重血吸虫疾病的主要病原。由于日本血吸虫动物宿主多、成虫寿命长、感染后的伴随免疫和治愈后的免疫力差、中间宿主钉螺不易控制等原因，分布于亚洲的日本血吸虫感染引起的病情最重，防治难度最大。目前血吸虫病主要的防治策略是化疗，同时研制血吸虫疫苗以及研究血吸虫转录组、蛋白质组及基因组也将为防治血吸虫病提供新的策略与途径。化疗是控制血吸虫病患病率的重要措施之一，但连续群体化疗在血吸虫未消灭地区只能暂时降低发病，而不能阻断传播。虽然，高效低毒的吡喹酮使血吸虫病化疗有了突破性进展，但是长期反复使用同一化学药物，有可能导致产生抗药性。此外，吡喹酮是一个对血吸虫成虫有效而对童虫无效的治疗药物，虽可降低人群的感染率，但不能防止重复感染。我国在七十年代末和八十年代初发现青蒿素、蒿甲醚、青蒿琥酯具有抗血吸虫的作用， 该类药物对各个虫期的血吸虫均有一定效果，特别是对血吸虫童虫有很强的杀灭作用，已于二十世纪末被发展成为预防血吸虫病的药物。蒿甲醚和青蒿琥酯的问世为血吸虫病的早期治疗提供了条件，但杀成虫的效果不佳。因此，WH0/TDR于2002年提出要发展一个既具有杀灭成虫又有杀童虫效果的治疗血吸虫病(抗血吸虫成虫)的新药。目前，虽然国内外已有部分实验室开始进行此项研究，但多种原因制约了新药的研制，至今尚无理想的二线侯选药物的报道。因此，专家认为抗日本血吸虫病新药的研究需要技术创新，发掘新的药物靶点将有助于新药的开发。由于血吸虫病在全世界范围内的严重危害，血吸虫基因组研究受到世界卫生组织 (WHO)的特别关注，并已建立了血吸虫基因组网络。血吸虫基因组大小为270MB，其中60% 为高度 和中度重复序列，而30%为单拷贝序列，含8对染色体，预测含有15，000-20, 000个
表达基因。在日本血吸虫转录组研究方面，2003年10月，巴西和中国两国学者分别同时在 《Nature genetics》杂志上发表了重大研究进展，发布了大量数据信息和分析结果；在蛋白质组研究方面，由中国国家人类基因组南方研究中心、中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所以及上海第二医科大学等有关科研人员组成的研究小组，主要针对日本血吸虫不同发育阶段包括雌虫、雄虫和虫卵进行大规模基因片段检测并作全面分析和验证。基于此工作，于2004年底，中国研究小组完成了日本血吸虫比较转录组和蛋白质组的相关分析， 这项研究是揭开血吸虫分子之谜的有效手段；在基因组研究方面，以国家人类基因组南方研究中心为主的研究小组采用了全基因组随机测序(whole genome shotgun sequencing, WGS)方法结合大片段克隆(BAC，Fosmid)末端测序方法的综合战略，得到至少6倍基因组大小的日本血吸虫序列信息，预计近期将释放完整的日本血吸虫基因组数据。目前，控制血吸虫病仍以灭螺和吡喹酮化疗为主，但由于钉螺难以彻底消除，目前还没有针对血吸虫成虫的特效药，防治效果并不理想，且仍然存在治愈患者发生血吸虫再感染等众多问题。因此，研制安全有效的疫苗是长期综合防治日本血吸虫病的重要措施之一。自上世纪20年代初期，国际上就开始了血吸虫疫苗的研究和探索。最近，WH0/TDR对最有希望的血吸虫疫苗候选分子进行独立检测，结果表明保护力均不到40%，只有部分保护力的疫苗在疫区使用可能最终导致疫苗无效，因此如何提高候选抗原分子的保护力水平仍是一个值得重视的问题。血吸虫生活史包括有性世代和无性世代，必须通过这两个世代的交替才能够繁衍。因此，血吸虫成虫不能在终宿主体内繁殖。尾蚴侵入宿主皮肤到童虫发育为成熟成虫的体内移行阶段是药物治愈血吸虫病的最佳阶段，也是疫苗产生免疫应答诱导免疫保护力的重要目标。血吸虫虫卵形成的虫卵肉芽肿对宿主造成损害最大，虫卵既是主要致病因子也是血吸虫病传播的源头，因此具有抗生殖作用的抗血吸虫病疫苗也是研究的热点之一。减虫率是衡量抗血吸虫病疫苗的“金标准”，如果抗血吸虫病疫苗在动物方面能够产生50% 70 %的免疫力，那么动物疫苗就能够给人类血吸虫疫苗的研制提供一个范例。现有的抗血吸虫病疫苗主要包括以下几类天然制备疫苗、基因工程(重组)疫苗、核酸疫苗和多价疫苗。天然制备疫苗是以化学致弱或体外培养等技术处理后的血吸虫虫体/体细胞直接作为免疫原。曾庆仁、王敏等利用体外培养的虫体细胞作为疫苗直接免疫小鼠，获得较高的减虫率和减卵率。但天然制备疫苗也存在虫体来源有限，疫苗的保存，虫体直接作为免疫原可能造成的病理损害以及其安全性控制困难等诸多问题，这些都限制了其进一步的研究及应用。基因工程疫苗是根据重组DNA技术，在体外进行基因剪接将重组DNA转化/转染到新的细菌或细胞中复制、转录、翻译而得到的。基因工程疫苗克服了天然制备疫苗的不足，具有较高的科研开发价值。很多研究采用重组抗原进行动物实验并获得了一定的保护性效果，取得了较大的研究进展。如已在进行抗曼氏血吸虫II期临床实验的曼氏血吸虫 28KDa GST抗原就是基因工程产物，是列入世界卫生组织公布的血吸虫疫苗主要候选抗原之一。核酸疫苗是一种新型疫苗，属于亚单位疫苗，包括DNA疫苗和RNA疫苗。核酸疫苗是由编码引起保护性免疫应答抗原的基因片段与质粒载体重组构建而成，直接注入体内刺激机体产生体液免疫应答 和细胞免疫应答。核酸疫苗与重组蛋白疫苗相比有许多突出的优点能够诱导更有效的免疫应答、制备简单、稳定性好、使用安全等。但目前核酸疫苗仍存在许多问题，一项亟待解决的问题就是如何选择理想的载体。血吸虫作为多细胞生物，其生活史复杂且抗原表位众多，单价疫苗诱导产生的免疫保护力不足以抵抗血吸虫攻击感染。因此，考虑采用多价疫苗免疫可能提高免疫保护力， 取得良好效果。用vRsi23+VRSj28联合的多价DNA疫苗通过肌内注射免疫牛，可获得38% 减虫率和48%减卵率；而用VRSj62+VRsj28+VRSj23+VRSj 14-3-3四价联合的DNA疫苗通过肌内注射免疫小鼠，可诱导获得40%减虫率。但并非所有多价疫苗的免疫保护力都高于单价疫苗。目前已发展了联合核酸疫苗和重组蛋白疫苗(DNA-primer/protein-boost)的联合免疫方法，先以DNA疫苗诱导，再通过蛋白免疫强化的方法已成功地应用于曼氏血吸虫免疫接种，但其在日本血吸虫免疫应答及免疫保护方面的作用尚待研究。Toll样受体(TLRs)是一类跨膜蛋白，广泛分布于各种免疫效应细胞上，如巨噬细胞、树突细胞、自然杀伤细胞、中性粒细胞、Y&T细胞、THl和TH2细胞、小肠上皮细胞、成纤维细胞及血管内皮细胞等。Toll样受体由胞外富含亮氨酸的重复序列(LRR)、跨膜区和胞内负责信号传导的Toll/IL-IR同源结构域(TIR)三部分组成。胞外富含亮氨酸的重复序列在微生物的特异性识别方面有重要作用，LRR的差异是不同家族成员识别不同病原体的分子基础。固有免疫是多细胞生物抵抗病原微生物的第一道快而有效的防线，同时还参与激活获得性免疫反应，在生物体的免疫应答中起着重要作用。Toll样受体是固有免疫系统的重要组成部分。TLRs在微生物感染和炎症后活化，在配体作用下，相应TLRs发生同源或异源二聚化，将刺激信号向细胞内传递，依次激活MyD88、IRAK、TRAF6、MAPK等，最终引起 NF-KB的激活，导致一系列相关基因的活化表达，引起炎症因子大量释放。经由TLRs的刺激对于传染微生物的早期识别和消灭是十分重要的。然而，固有免疫过度且长期的活化对宿主是有害的，甚至是致命的。因此，刺激信号必须严格控制以确保其幅度和持续时间为合适的有益的反应。Toll反应蛋白(Tollip)能与TLR2、TLR4及IRAK结合，Tollip结合IRAK后抑制 IRAK磷酸化进而抑制IRAK的激酶活性使其下游的信号传导中断，即Tollip过表达抑制 NF- κ B活化，是TLRs信号通路中负性调节因子之一，能够抑制过度和长时间的免疫反应。日本血吸虫肉芽肿的形成对宿主造成严重损害，原因之一是沉积在组织中的虫卵成熟后，不断通过卵壳上的微孔释放出虫卵抗原，引起终宿主长期且过度的免疫反应，造成严重的不良后果。而Tollip正是过度免疫反应的负性调节因子之一，由此推测Tollip可能能够减轻宿主过度免疫反应，提高宿主的免疫水平，对宿主有一定的免疫保护力并对日本血吸虫有一定的杀伤作用。本发明通过PCR扩增出日本血吸虫SjTollip全基因，并在大肠杆菌中重组表达此基因，得到重组蛋白，经免疫保护性实验确认所得重组蛋白能诱导产生较强的免疫保护力， 是潜在的疫苗候选靶标，从而完成了本发明。在本发明之前，还没有出现涉及本发明日本血吸虫SjTollip重组抗原蛋白及其作为日本血吸虫疫苗的公开报道。

发明内容
本发明要解决的技术问题之一是提供一种日本血吸虫SjTollip重组抗原蛋白。本发明要解决的技术问题之二是提供一对用于日本血吸虫SjTollip基因PCR扩增的特异性引物。本发明要解决的技术问题之三是提供该日本血吸虫SjTollip重组抗原蛋白的制备方法。本发明要解决的技术问题之四是提供该日本血吸虫SjTollip重组抗原蛋白在制备日本血吸虫病防治疫苗中的应用。本发明首先通过生物信息学技术和分子生物学技术分析并获得了日本血吸虫 SjTollip的编码基因序列(如SEQ ID NO. 1所示序列(Genbank AY814053))。然后，通过对日本血吸虫SjTollip基因进行PCR扩增，纯化扩增产物，将所得产物与质粒载体pET 28-a(+)构建成测序用重组pET 28-a(+)-SjTollip，通过转化筛选，抽提重组质粒，并进行测序鉴定；随后将纯化了的质粒pET 28-a(+)-SjTolIip与质粒pET 28-a(+)通过酶切、回收及连接，构建成SjTollip基因原核表达的重组质粒pET 28-a(+)-SjTolIip ；转化此重组质粒至感受态细胞，培养，并抽提，所得重组质粒经PCR、测序及酶切鉴定确认后，转化至宿主细胞大肠肝菌中表达；取表达量较高的克隆，发酵制备菌体，破碎所得菌体；由于构建的重组蛋白含6个His，可选用Ni-NTA亲和层析纯化重组蛋白，最终得到纯化的重组蛋白 SjTollip，完成了 SjTollip基因的体外克隆表达及纯化。为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现本发明第一个方面是提供一种日本血吸虫SjTol 1 ip重组抗原蛋白，其具有SEQ ID NO. 2所示氨基酸序列的蛋白、或由该蛋白发生一个或多个氨基酸的置换、缺失或插入而形成的具有相同功能的蛋白。本发明第二个方面是提供了一对用于日本血吸虫SjTollip基因PCR扩增的特异性引物，其序列为上游5，-CGCGGATCC ATGAACCTTTACTGCATA-3，(如 SEQ ID NO 3 所示)或其互补链；下游:5，-CCGCTCGAG TCAAGTTTCCGATGCCAT-3，(如 SEQ ID NO 4 所示)或其互补链。本发明第三个方面提供了一种日本血吸虫SjTollip重组抗原蛋白的制备方法， 包括如下步骤1)日本血吸虫SjTollip基因序列的扩增(用PCR技术从含有目的基因的pBlue script质粒获得日本血吸虫SjTollip的DNA片段)；
2)日本血吸虫SjTollip重组质粒的构建和鉴定用pET 28_a(+)载体构建日本血吸虫 SjTollip 重组表达质粒 pET 28-a(+)-SjTolIip ；3)将pET 28_a(+)-SjTollip重组质粒转化于宿主细胞中，并在宿主细胞中表达， 得到表达产物重组蛋白SjTollip ；4)螯和的Ni-NTA树脂亲和层析纯化表达产物重组蛋白SjTollip。步骤1)日本血吸虫SjTollip基因序列的扩增，具体为以含有日本血吸虫SjTollip基因序列的cDNA克隆为模板，SEQ ID NO. 3 (CGCGG ATCCATGAACCTTTACTGCATA)为 5，引物，SEQ ID NO. 4(CCGCTCGAGTCAAGTTTCCGATGCCAT) 为3’引物，进行PCR扩增，所得PCR产物经琼脂糖凝胶电泳，用QIA快速PCR纯化试剂盒 (QIAquick PCR Purification Kit)回收纯化。所述PCR扩增的反应条件为95°C预变性 5min ；94°C变性lmin, 58°C退火lmin, 72°C延伸lmin, 72°C延伸IOmin, 30个循环；最后保存于 4°C。步骤2)构建可在宿主细胞中表达SjTollip编码基因的重组质粒pET 28-a (+)-SjTolliP，具体为将纯化的SjTolliP基因PCR产物片段和质粒载体pET 28_a(+)分别用限制性内切酶BamHI和XhoI进行酶切，用QIAquick PCR Purification Kit回收纯化。根据纯化后的目的基因片段和载体酶切片段的浓度进行连接，构建成SjTolliP编码基因原核表达的重组质粒pET28-a(+)-SjTolliP。将此质粒通过CaCl2法转化入大肠杆菌DH5 α感受态细胞，培养后涂布于含卡那霉素(Kan)的LB琼脂平板上，随机挑取上述平板上的菌落，培养后收集菌体，用Mini-MTM Plasmid DNA Extraction System抽提菌体中所含重组质粒，进行 PCR鉴定、测序鉴定及酶切鉴定。步骤3)重组质粒pET 28-a (+)-SjTolIiP在大肠肝菌(宿主细胞)中的表达，具体为通过钙转化将上述抽提所得pET 28-a(+)-SjTolliP重组质粒分别转化入大肠杆菌BL21 (DE3)和BL21 (DE3)pLysS中，培养后涂布于含卡那霉素的LB琼脂平板上。随机挑取上述平板上的菌落，培养菌液至对数生长期，加入诱导剂继续培养。SDS-聚丙烯酰胺凝胶 (SDS-PAGE)电泳鉴定诱导表达结果，直接以全菌体电泳显示。步骤4)纯化SjTolliP重组蛋白取表达重组蛋白SjTolliP量较高的冻存菌种于含卡那霉素的液体培养基中，培养过夜之后，转种至同样含卡那霉素的液体培养基，培养菌液至对数生长期，加入诱导剂继续培养，最后收取菌体。在上述菌体中加入缓冲液超声裂解细菌，离心后保留上清夜与沉淀，由SDS-PAGE电泳鉴定结果。根据上述结果，用变性剂裂解所得沉淀，离心后用Ni-NTA 亲和层析树脂进行纯化。SDS-PAGE检验纯化结果。本发明第四个方面提供了一种日本血吸虫SjTollip重组抗原蛋白在制备日本血吸虫病防治疫苗中的应用。本发明将纯化的蛋白对雌性C57BL/6小鼠分三次进行免疫，然后再用日本血吸虫尾蚴进行攻击感染，待感染后35天解剖小鼠，对其体内的成充数和虫卵数进行计数，比较免疫组和对照组之间两者的数值，计算减虫率和减卵率。经过上述日本血吸虫SjTolliP重组蛋白的免疫保护性实验的验证，本发明的日本血吸虫SjTollip重组抗原蛋白能诱导产生较强的免疫保护力，是潜在的疫苗候选靶标，可以作为日本血吸虫病防治疫苗的目的抗原。


图1是实施例1中日本血吸虫SjTollip基因序列的扩增结果示意图。图1中，M DNA分子量标准；1 =SjTollip0图2是实施例3中pETjSa/SjTollip重组质粒及其PCR鉴定结果示意图。图2 中，M :DNA 分子量标准；1 =SjTollip ；2 ipETISa/Sj^Tollip。图3是实施例4中重组质粒重组日本血吸虫Tollip蛋白(SjTollip)的SDS-PAGE 分析结果示意图。图3中，M 蛋白分子量标准；1 未诱导对照；2 诱导后4h(lmM/L IPTG)； 3 菌体裂解后上清；4 菌体裂解后沉淀；5 蛋白纯化后。图4是实施例5中rSjTollip/pET28a重组蛋白纯化结果的SDS-PAGE电泳分析结果示意图。图4中，M 蛋白分子量标准；1 上样前；2 穿出；3-9 洗脱收集液。
具体实施例方式以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。主要试剂
权利要求
1.一种日本血吸虫SJTollip重组抗原蛋白，其特征在于，具有SEQ ID NO. 2所示氨基酸序列的蛋白、或由该蛋白发生一个或多个氨基酸的置换、缺失或插入而形成的具有相同功能的蛋白。
2.一对用于日本血吸虫SjTollip基因PCR扩增的特异性引物，其特征在于，其序列为上游5’ -CGC GGATCC ATGAACCTTTACTGCATA-3 (如 SEQ ID NO :3 所示)或其互补链；下游5，-CCG CTCGAG TCAAGTTTCCGATGCCAT-3，(如 SEQ ID NO 4 所示)或其互补链。
3.—种如权利要求1所述的日本血吸虫SjTollip重组抗原蛋白的制备方法，其特征在于，包括如下步骤1)日本血吸虫SjTollip基因序列的扩增；2)日本血吸虫SjTollip重组质粒的构建和鉴定；3)将该重组质粒转化于宿主细胞中，并在宿主细胞中表达，得到表达产物重组蛋白；4)螯和的Ni-NTA树脂亲和层析纯化表达产物重组蛋白。
4.如权利要求3所述的日本血吸虫SjTollip重组抗原蛋白的制备方法，其特征在于， 步骤1)具体为设计SEQ ID NO :3和SEQ ID NO :4所示的核苷酸序列或其互补链为引物， 以含日本血吸虫SjTollip基因序列的cDNA克隆为模板进行PCR扩增；所得PCR产物经琼脂糖凝胶电泳，并回收纯化。
5.如权利要求4所述的日本血吸虫SjTollip重组抗原蛋白的制备方法，其特征在于， 所述PCR扩增的反应条件为95°C预变性5min ；94°C变性lmin，58°C退火lmin，72°C延伸 lmin，72°C延伸10min，30个循环；最后保存于4°C。
6.如权利要求3所述的日本血吸虫SjTollip重组抗原蛋白的制备方法，其特征在于， 步骤2)具体为将步骤1)所得的PCR产物片段与质粒载体pET-28a(+)分别用限制性内切酶BamHI和XhoI进行酶切，并回收纯化；根据纯化后的目的基因片段和载体酶切片段的浓度进行连接，构建成SjTolliP编码基因原核表达的重组质粒pET 28-a(+)-SjTolIiP ；将此重组质粒通过CaCl2法转化入大肠杆菌DH5 α感受态细胞，培养后涂布于含卡那霉素的LB 琼脂平板上，随机挑取上述平板上的菌落，培养后收集菌体，抽提菌体中所含重组质粒，进行PCR鉴定、测序鉴定及酶切鉴定。
7.如权利要求3所述的日本血吸虫SjTollip重组抗原蛋白的制备方法，其特征在于，步骤3)具体为通过钙转化将步骤2)测序鉴定无误的pET 28-a(+)-SjTolliP重组质粒分别转化入大肠杆菌BL21(DE3)和BL21(DE3)pLysS中，培养后涂布于含卡那霉素的LB 琼脂平板上；随机挑取上述平板上的菌落，培养菌液至对数生长期，加入诱导剂继续培养； SDS-PAGE电泳鉴定诱导表达结果，直接以全菌体电泳显示。
8.如权利要求3所述的日本血吸虫SjTollip重组抗原蛋白的制备方法，其特征在于， 步骤4)具体为取表达重组蛋白SjTolliP量较高的冻存菌种于含卡那霉素的液体培养基中，培养过夜之后，转种至同样含卡那霉素的液体培养基，培养菌液至对数生长期，加入诱导剂继续培养，最后收取菌体；在上述菌体中加入缓冲液超声裂解细菌，离心后保留上清夜与沉淀，由SDS-PAGE电泳鉴定结果；根据上述结果，用变性剂裂解所得沉淀，离心后用Ni-NTA亲和层析树脂进行纯化，SDS-PAGE检验纯化结果。
9. 一种如权利要求1所述的重组抗原蛋白在制备日本血吸虫病防治疫苗中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种日本血吸虫SjTollip重组抗原蛋白，具有SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的蛋白、或由该蛋白发生一个或多个氨基酸的置换、缺失或插入而形成的具有相同功能的蛋白。此外，本发明还公开了该日本血吸虫SjTollip重组抗原蛋白的制备方法，包括日本血吸虫SjTollip基因序列的扩增、日本血吸虫SjTollip重组质粒的构建和鉴定、重组蛋白的诱导表达和纯化等步骤。此外，本发明还公开了该日本血吸虫SjTollip重组抗原蛋白在制备日本血吸虫病防治疫苗中的应用。经过日本血吸虫SjTolliP重组蛋白的免疫保护性实验的验证，本发明的日本血吸虫SjTollip重组抗原蛋白能诱导产生较强的免疫保护力，是潜在的疫苗候选靶标，可以作为日本血吸虫病防治疫苗的目的抗原。
文档编号C12N15/11GK102167735SQ201110067130
公开日2011年8月31日 申请日期2011年3月21日 优先权日2011年3月21日
发明者冯正, 卢艳, 彭建新, 徐斌, 王晓娜, 胡薇, 鞠川 申请人:中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所, 华中师范大学