专利名称：水稻干旱响应蛋白或编码该蛋白的基因的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物学领域，具体地说，涉及一种水稻干旱响应蛋白或编码该蛋白的基因的应用。
背景技术：
水是生命之源，是自然界所有生物生存和发展的必要条件。然而随着人口的增长以及人类对环境破坏的加剧，水资源短缺越来越成为制约人类社会生存和发展的重要因素。水稻是全世界是需水最大的作物之一。在水稻的主要种植地亚洲，农业用水占总用水量的80%，而水稻用水占农业用水的70%左右(罗利军和张启发，2001)。同时，水稻也是世界上最重要的粮食作物。目前，全球每年种植水稻15亿公顷，生产水稻约60亿吨，养活世界一半以上的人口。在我国，水稻是第一大农作物，在粮食生产和国民经济中起着极其重要的作用。此外，水稻在禾谷类作物中具有最小的基因组，只有430MB，是玉米的14%和小麦的3%左右，在作物科学研究中被作为重要的模式植物。因此，研究植物特别是水稻的抗旱机理，培育具有节水抗旱特性的新型水稻品种对于提高水资源利用率，促进社会的可持续发展具有十分重要的作用。抗旱性(Drought resistance)是一个总的概念，根据其反应类型的不同，可以细分为逃旱性(Drought escape)、避旱性(Dehydration avoidance)、耐旱性(Drought tolerance)和复原抗旱性(Drought recovery) (Fukai & Cooper, 1995)。植物干旱响应基因/蛋白根据其功能的不同又可以分为调节性基因/蛋白与功能性基因/蛋白，其中调节性基因/蛋白主要是在植物抗旱分子调控的上游起作用，比如调节抗旱信号转导、促进抗旱基因转录等；而功能性基因/蛋白主要是直接提高植物的抗旱能力，比如加速渗透调节物质的合成、维持细胞质膜的稳定、清除过多的活性氧离子等(Jangpromma et al. ,2010, Xiong &Zhu，20(^)。发掘和鉴定干旱响应基因/蛋白作为标记，对于抗旱性材料的筛选以及植物抗旱能力的遗传改良无疑具有十分重要的作用。蛋白质组(Proteome)是指一种生物基因组编码的全部蛋白质(Wilkins et al.， 1996)，而蛋白质组学(Proteomics)是基于蛋白质组的对大量蛋白质的一个整体研究，包括在生长发育中和各种外界因素作用下的蛋白质结构、功能和丰度的变化等(Pandey & Mann, 2000)。采用蛋白质组学策略进行植物抗旱标记的开发已有很多的例子，比如水稻的肌动蛋白解聚因子(Salekdeh et al. ,2002)和超氧化物歧化酶(Zang &Komatsu，2007)、 玉米的ABA水分胁迫成熟诱导蛋白(Riccardi et al.，1998)和甘蔗的18kDa未知蛋白 (Jangpromma et al. ,2010)等。此外，采用转录组学策略研究植物抗旱基因的表达以及发掘抗旱标记基因也有很多应用，包括水稻中的蛋白磷酸酯酶(Singh et al.，2010)，小麦中的葡聚糖酶(Mohammadi et al.，2008)等。水稻抗旱性的遗传改良往往采用典型旱稻品种与高产水稻品种之间的杂交配组， 通过对其后代分离群体的多次抗旱性鉴定，选择同时具备优良综合农艺性状和抗旱性的材料，进而培育水稻抗旱品种或者杂交稻组合。水稻全生育期的田间抗旱鉴定主要有两种解决途径，其一是在大陆各稻区(当地)建立防雨水的鉴定设施，人工制造土壤干旱胁迫条件；其二是利用海南岛冬季南繁种植时的旱季气候条件，对水稻材料进行干旱胁迫处理。前一方法投入成本高、可用面积小，对于产量和生理指标的测定费时费工，稳定性较低；后一方法为水稻的反季节种植，不能对产量等同期进行选择，也会受到寒潮降雨等干扰。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供OsDRP蛋白或其任意肽段，和/或Osdrp基因或其特异性片段在水稻抗旱育种中的应用。其中，所述的干旱响应蛋白OsDRP的GenBank登录号为gi | 115489014,编码上述蛋白的基因为 Osdrp (0sl2g0555000)。本领域技术人员应当理解，上述的蛋白任意肽段，为所述蛋白的至少10个氨基酸、至少20个氨基酸、至少30个氨基酸、至少50个氨基酸、100个氨基酸、120个氨基酸等的肽段。上述的基因的特异性片段为所述基因的至少100个核苷酸、至少150个核苷酸、至少200个核苷酸、至少300个核苷酸等的基因片段，优选为SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2所示的引物扩增的片段。具体的，杂交配组前，可以通过所述的蛋白或其肽段，所述的基因或其片段鉴定亲本的抗旱能力，如杂交育种中，可鉴定父母本的抗旱能力，优化杂交组合。在各分离世代， 可对后代进行抗旱能力的早期鉴定，筛选出符合特定目标，如抗旱性强的后代，加快育种程序。本发明的第二个目的在于提供一种水稻抗旱能力的鉴定方法。本发明提供的水稻抗旱能力鉴定方法，包括将待测水稻进行干旱处理，再检测干旱处理前后水稻中OsDRP蛋白和/或其任意肽段的表达量的变化情况，和/或检测干旱处理前后水稻中Osdrp或其特异性片段的表达量变化情况。具体的，干旱处理后较干旱处理前，蛋白或基因的表达量下降，则表示该水稻为旱敏感型；干旱处理后较干旱处理前，蛋白或基因的表达量提高，则表示该水稻为抗旱型。在本发明的一个实施方案中，通过双向凝胶电泳和/或质谱检测所述蛋白和/或肽段的表达量；在本发明的另一个实施方案中，用基因芯片和/或荧光定量PCR检测所述基因和/或基因片段的表达量。其中，对水稻进行干旱处理的时期可为水稻的整个生育期，优选为水稻的三叶一心期，从而实现对水稻抗旱能力的早期鉴定和抗旱品种的早期筛选。本发明中，可采用本领域公知的任何干旱处理方法对待测水稻进行干旱处理，较为经济的是，对待测水稻进行小桶盆栽和停止浇水处理，优选停止浇水2 5天，最为优选为停止浇水3天。本发明的另一个目的在于提供一种抗旱水稻的筛选方法，包括将待筛选的水稻进行干旱处理，再检测干旱处理前后水稻中OsDRP或其任意肽段的表达量的变化情况，和/或检测干旱处理前后水稻中Osdrp或其特异性片段的表达量变化情况。其中，可采用上述的方法检测所述蛋白和/或肽段的表达量、检测所述基因和/或基因片段的表达量。其中，可采用上述的方法对水稻进行干旱处理。
本方法通过对抗旱水稻品种IRAT109进行干旱胁迫处理后，通过双向凝胶电泳和质谱分析了干旱处理前后蛋白质表达的差异，发现了一个受干旱诱导的蛋白，这一个蛋白在抗旱水稻品种中，干旱胁迫后表达提高。此外，编码这一个蛋白的基因的表达量也在干旱胁迫后提高。结果表明这一个蛋白及其基因可以应用与水稻的抗旱育种中，与对水稻抗旱性进行鉴定或筛选抗旱水稻。本发明提供的水稻抗旱能力鉴定方法或抗旱水稻的筛选方法与考察水稻籽粒产量等传统方法相比，实现在较早阶段对水稻品种(品系)的抗旱性鉴定或进行抗旱水稻筛选，有利于当代完成杂交配组的育种程序，也可部分避免不同水稻品种间因生育期差异过大而难以同期进行成株期干旱胁迫鉴定等技术性障碍。
图1旱稻品种IRAT109苗期植株正常浇水(左)和干旱胁迫(右)处理形态比较。图2为正常浇水以及干旱胁迫的旱稻材料IRAT109叶片总蛋白质的双向电泳图谱分析。正常浇水㈧和干旱胁迫⑶的代表性凝胶图谱。箭头指示本项申请的目标蛋白质斑点，在干旱处理下其表达明显升高。C-E为正常浇水的三次生物学重复，F-H是干旱处理的三次生物学重复。图3为蛋白点OsDRP在正常浇水和干旱胁迫的抗旱水稻品种IRAT109叶片中的相
对表达量。图4为蛋白点OsDRP经MALDI-T0F后的一级质谱图(A)和分子量为973. 517⑶、 1651. 78(C) ,2136. 03(D)的肽段经MALDI-T0F/T0F后得到的二级质谱图。二级质谱图右上角列出各肽段的氨基酸序列。图5为基因Osdrp在正常浇水和干旱胁迫的抗旱水稻品种IRAT109叶片中的表达量。通过cDNA芯片检测发现Osdrp在干旱胁迫叶片中的表达上升，是正常浇水的1. 7倍。图6为抗旱与旱敏感水稻品种的叶片中Osdrp基因对干旱胁迫的响应。
具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例1水稻干旱处理及叶片样品的收集选用抗旱水稻品种IRAT109。将发芽的种子播种于圆柱形塑料桶(直径15cm，高 20cm)内，每桶播12粒。每盆每天浇水5次，每次0. 1L，使土壤保持湿润而土表没有积水。 在播种四周后，植株处于三叶一心期开始进行断水处理(干旱胁迫)。干旱时间为3天，正常浇水对照每天保持原有浇水量不变(图1)。从正常浇水组和干旱处理组分别剪取叶片， 冷冻条件下(_80°C )储存备用。实施例2标记蛋白筛选1双向凝胶电泳根据Hajduch等Q001)的方法总结在以下几个段落中，使用IP(ihor Isoeletric Focusing System与垂直SDS-PAGE系统，对来自于正常浇水组和干旱处理组的叶片的蛋白质样品进行双向凝胶电泳。1.1 等电聚焦(IEF)
采用Mcm长的固相pH梯度(IPG)胶条(GE Healthcare)进行等电聚焦。取1. 2mg 蛋白样品，加蛋白水化液(7M尿素、2M硫脲、4% CHAPSU%DTT,0. 5% IPG缓冲液和0.002% 溴芬兰)补足体积至450μ 1。加入聚焦槽中央，去除IPG胶条的保护膜，并覆盖在蛋白溶液上方，50V电压吸胀10小时，使蛋白充分进入胶条。按照IOOV(Ih)、200V(lh)、500V(lh)、1000V(lh)、8000V(lh，gradient)、 8000V(15h)的步骤进行等电聚焦电泳，使得蛋白根据其等电点的不同而分离到胶条的不同位置。1. 2SDS-PAGE 分离将等电聚焦后的胶条放入装有15ml平衡缓冲液1 (0. 05mol/LTris-HCL，6mol/L尿素，30%甘油，2% SDS, 1% 017，0.002%溴酚兰)的平衡管中摇晃15min，然后转入15ml平衡缓冲液 2(0. 05mol/LTris-HCL，6mol/L 尿素，30%甘油，2% SDS，4%碘乙酰胺，0. 002%溴酚兰)的平衡管中摇晃15min。平衡好的胶条放入12% SDS-PAGE凝胶顶部，并采用0. 5%的低熔点琼脂糖密封， 按照IOOV(Ih) ,200V(7h)的步骤进行SDS-PAGE电泳。1. 3凝胶染色与分析根据(Candiano G et al.，2004)等的方法，对电泳完成后的凝胶进行染色，具体操作包括采用400ml固定液(12% TCA)中固定2h，然后采用400ml染色液(0. 12% G-250， 10% (NH4)2SO4,10% H3PO4, 20%甲醇)中进行染色，时间为12hrs，并用去离子水清洗凝胶数
次至背景清晰。 染色后的凝胶Imag必carmer扫描仪(GE Healthcare)扫描，扫描模式为透射，分辨率为300dpi，图像存储为tiff格式；随后采用ImageMaster-Elite软件(GE Healthcare)进行图像分析，包括蛋白点检测、背景扣除、蛋白点体积标准化，凝胶匹配等几个步骤，获取每一个蛋白点在不同凝胶上的标准体积值并进行比较分析。结果如图2所示。结果表明，有一些蛋白质点在干旱胁迫处理后比对照显著上调或者下调表达，即差异表达的蛋白质点。2质谱分析2.1蛋白酶解用去离子水对需要鉴定的蛋白斑点进行清洗，然后用50μ 1含50%乙腈 (Acetonitrile, ACN)的碳酸氢铵溶液(25mmol/L NH4HCO3)脱色。脱色完成后用50 μ 1去离子水处理5分钟，弃去多余水分，加入50 μ 1含50% ACN的水溶液处理5min，弃去多余溶液，加入100% ACN处理5min。完全脱色后的凝胶加入5 μ 1含IOng胰蛋白酶(ftOmega， Madison, WI, USA)的碳酸氢铵溶液05mmol/L NH4HCO3)重新吸胀，采用20 μ 1碳酸氢铵溶液进行覆盖，37°C酶解lOhrs。吸取上清，真空干燥后重新溶解在50 μ 1 α-氰基-4-羟肉桂酸的饱和溶液中(含0. TFA和50% ACN)，点样进行质谱测试。2. 2质谱测试与结果检索采用ΑΒΙ4800 MALDI-T0F/T0F质谱仪进行质谱检测与数据采集(Applied Biosystems, Framingham, MA, USA)。合并一级质谱和二级质谱数据，使用 MASCOT V2. 1 搜索引擎进行数据检索(Matrix Science，London，U.K.)，检索数据库为NCBI nr水稻(Oryza sativa L.)数据库，酶解过程采用的酶为胰蛋白酶，最大允许错切位点为1，可变修饰设置为carbamidomethylation (半胱氨酸)和oxidized (甲硫氨酸)，无固定修饰，一级质谱容差为50ppm，二级质谱为0. 25Da，根据以上参数进行数据库检索，以实现蛋白斑点的鉴定。通过双向电泳对正常浇水和干旱处理的水稻叶片进行的比较分析表明，在叶片中，有多种蛋白差异表达。特别的，在干旱处理中，发现了 OsDRP蛋白斑点在干旱胁迫叶片中的表达上升，是正常浇水的2.2倍(图幻。利用质谱分析的方法对这一个差异表达的蛋白斑点进行检测，获得其特征肽指纹谱(图4)，与已知蛋白质谱库中已有数据记录进行比对查询，结果表明蛋白点OsDRP在NCBI数据库上的登录号为gi|M489014，来自于0sl2g0555000基因，该蛋白为病程相关Bet Vl家族蛋白(Pathogenesis-related Bet ν 1 family protein)，具有聚酮环化酶/脱水酶和脂类转运功能(Polyketide cyclase/ dehydrase and lipid transport)。实施例3基因标记检测IRNA提取及纯化取植株叶片，液氮研磨后加入总RNA提取液(天根生化科技(北京)有限公司)进行总RNA提取。然后加入DNA酶，37°C水浴30min，以充分去除DNA，并对DNA酶解后的RNA 进行抽提。采用1 %的琼脂糖电泳检测RNA的完整性，采用DTO50型紫外分光光度仪(Beckman Coy Iter, Fy llerton, American)检测 RNA 的浓度，提取的总 RNA 进一步采用 QIAGEN RNeasy Kit (QIAGEN, Hilden, Germany)进行纯化。2cDNA和cRNA合成与纯化将纯化的总RNA导入cDNA合成体系并进行PCR反应，设定参数为热盖65°C，40°C 反应airs，65°C灭活15min，4°C反应5min。然后将合成的cDNA导入cRNA合成体系进行 PCR反应，设定参数为热盖65°C，40°C反应2小时。合成的cRNA采用QIAGEN RNeasy Mini Kit (QIAGEN, Hilden, Germany)进行纯化并采用分光光度计测定合成的cRNA浓度。3cRNA荧光标记和样品纯化取cRNA4ug，加入 10 μ 1DMS0 禾口 3. 4 μ 1 0. 3mol/L 的 NaHCO3 (pH9. 0)溶液，混勻。 将该cRNA混合物加入到荧光染料(Cy3或Cy5)中，混勻，25°C温浴lh，加入9 μ 1浓度为 4mol/L 的 Hydroxylamine，混勻后 25°C温浴 15min。采用 QIAGEN RNeasy Mini Kit (QIAGEN, Hilden, Germany)进行纯化。4芯片杂交扫描和信号处理按如下比例进行片段化混合液的配置(Cy3cRNA :875ng，Cy5cRNA :875ng， 10 Xblocking Agent : 11 μ 1,25XFragmentation Buffer :2.2 μ 1, 用 Nuclease-free water补充总体积至55 μ 1)，60°C温浴30min。加入55μ1 2 X GEx Hybridization Buffer 后取 100 μ 1 样品液在 G2545A 型杂交炉(Agilent Technologies, USA)进行杂交，设定参数65°C、Hhrs，IOrpm 滚动。芯片采用水稻Oligo芯片(Agilent Technologies,USA) 0先采用芯片洗涤液清洗芯片，然后采用 G2565BA 型扫描仪(Agilent Technologies, USA)进行扫描，并采用 GenePix Pro3. 0 (Axon Instrument,Foster City,American)图像处理软件分析Cy3和Cy5两种荧光信号的强度。采用cDNA芯片技术对编码OsDRP蛋白的基因0sl2g0555000的表达水平进行检测，发现该基因在抗旱品种的干旱胁迫叶片中的表达量是正常叶片中表达量的1. 7倍(图
75)，并将该基因命名为水稻抗旱响应蛋白质的编码基因Osdrp。实施例4不同水稻品种抗旱能力鉴定与Osdrp基因表达量检测4. 1实验处理及样品收集经过抗旱稻品种晚旱稻、早旱稻(传统陆稻品种)、IRAT109以及普通水稻品种乌尖内田谷、N22、N0rinM (上海市农业生物基因中心种质库，公众可以获得)分别进行断水3 天处理，处理方法同前。正常浇水对照每天保持原有浇水量不变。从正常浇水组和断水处理组分别剪取叶片，冷冻条件下(-80°C )储存备用。4. 2标记基因的荧光定量PCR检测4. 2. IRNA反转录及引物设计取制备的RNA，采用A3500反转录体系(ftOmega，USA)合成cDNA，做为荧光定量 PCR分析的模板。采用ft~imer 6进行引物设计，筛选得到其引物序列为正向引物TCGGCATGCTCAAGATGATC(SEQID No. 1)；正反引物TGGATTTGTCGTGGCTCACA(SEQID No. 2)；4. 2. 2荧光定量PCR反应^ Applied Biosystem7000 RealTime PCR System(Applied Biosystems, USA) 进行 PCR 反应，实验程序为50°C 2min，95°C 10min,95°C 15sec，60°C lmin，45 个循环； 95°C 15sec，60°C 20sec，95°C 15sec 采用2、Act法(Livak and Schmittgen, 2001)计算 RNA 相对表达量，同时采用水稻Actin基因做为内参。4. 3抗旱能力不同的水稻品种叶片在干旱处理下标记基因的鉴定及特征通过荧光定量PCR分析了已知抗旱稻品种晚旱稻、早旱稻、IRAT109以及一般水稻品种乌尖内田谷、N22、Norin24叶片中Osdrp基因对干旱胁迫的响应，发现3份抗旱材料在干旱胁迫下，其Osdrp基因的mRNA表达水平上升，而3份一般水稻材料在干旱胁迫下， Osdrp基因的mRNA表达水平下降。据此分析认为通过对水稻品种叶片中Osdrp基因对干旱胁迫的响应方式，可以评估其抗旱能力的强弱。在干旱胁迫下，Osdrp基因上升表达的水稻材料其抗旱能力可能较强，而Osdrp基因下降表达的水稻材料，其抗旱能力可能较弱。4. 5干旱胁迫后不同水稻品种的产量对上述品种的植株进行单株籽粒产量和百粒重的考察，以正常淹水条件下获得指标为对照，干旱处理组为干旱胁迫后复水生长。结果如表1所示，三个旱稻品种的籽粒产量增加，而三个水稻品种(旱敏感品种)全部下降；三个旱稻品种的百粒重略有增加或者仅下降5%以内，而三个水稻品种的百粒重指标，旱处理组比对照下降8% 16%。说明三个旱稻品种能抵御干旱胁迫处理，甚至更加适应于土壤通气条件，在旱处理后能获得更高籽粒产量，即抗旱性显著好于参试的三个水稻品种。从结果可以看出，本发明提供方法的鉴定结果与传统考察水稻籽粒产量的方法结果是一致的。然而，本发明可以在早期对其抗旱性进行鉴定，就可以大大缩短杂交配组育种过程中父母本的选择时间，从而缩短了育种周期，加快了育种进程。另外也可以避免不同水稻品种间因生育期差异过大而难以同期进行成株期干旱胁迫鉴定等技术性障碍。表1单株籽粒产量和百粒重
权利要求
1.OsDRP蛋白或其任意肽段，和/或编码OsDRP蛋白的Osdrp基因或其特异性片段在水稻抗旱育种中的应用。
2.一种水稻抗旱能力的鉴定方法，包括将待测水稻进行干旱处理，再检测干旱处理前后水稻中OsDRP蛋白和/或它们的任意肽段的表达量的变化情况，和/或检测干旱处理前后水稻中Osdrp基因和/或其特异性片段的表达量变化情况。
3.根据权利要求2所述的鉴定方法，其特征在于，用双向凝胶电泳和/或质谱检测所述蛋白和/或肽段的表达量。
4.根据权利要求2所述的鉴定方法，其特征在于，用基因芯片和/或荧光定量PCR检测所述基因和/或基因片段的表达量。
5.根据权利要求2 4任一项所述的鉴定方法，其特征在于，对水稻干旱处理的时期为三叶一心期。
6.根据权利要求5所述的鉴定方法，其特征在于，所述干旱处理包括将水稻进行小桶盆栽和停止浇水处理2 5天。
7.一种抗旱水稻的筛选方法，包括将待筛选的水稻进行干旱处理，再检测干旱处理前后水稻中OsDRP蛋白或其任意肽段的表达量的变化情况，和/或检测干旱处理前后水稻中 Osdrp基因或其特异性片段的表达量变化情况。
8.根据权利要求7所述的筛选方法，其特征在于，用双向凝胶电泳和/和质谱检测蛋白和/或肽段的表达量；用基因芯片或荧光定量PCR检测基因和/或基因片段的表达量。
9.根据权利要求7或8所述的筛选方法，其特征在于，对水稻干旱处理的时期为三叶一心期。
10.根据权利要求9所述的筛选方法，其特征在于，所述的干旱处理包括将水稻进行小桶盆栽和停止浇水处理2 5天。
全文摘要
本发明公开了水稻干旱响应蛋白或编码该蛋白的基因的应用。本发明还公开了利用所述的干旱响应蛋白或编码该蛋白的基因对水稻进行抗旱能力的鉴定或抗旱水稻的筛选。本发明提供的水稻抗旱能力鉴定或抗旱水稻筛选方法，与考察水稻籽粒产量等方法相比，在较早阶段对水稻品种(品系)的抗旱性进行筛选，有利于当代完成杂交配组的育种程序，也可部分避免不同水稻品种间因生育期差异过大而难以同期进行成株期干旱胁迫鉴定等技术性障碍。
文档编号C12Q1/68GK102181531SQ20111006688
公开日2011年9月14日 申请日期2011年3月18日 优先权日2011年3月18日
发明者梅捍卫, 罗利军, 舒烈波 申请人:上海市农业生物基因中心