专利名称：与猪免疫性状相关的ehmt2基因片段克隆及作为分子标记的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于家畜基因工程技术领域，具体涉及ー种作为猪标记辅助选择应用的与猪免疫性状相关的分子标记的克隆及应用。
背景技术：
近年来，由于各种动物疾病在世界范围内严重暴发，药物及其有害物质残留影响动物食品安全和环境，动物抗病遗传育种越来越受到重视，已成为动物育种的重要目标。而且随着分子生物学和生物信息学的发展，使利用分子抗病育种技术快速有效培育抗病新品种成为可能，为提高动物抗病力开辟了一条新的途径。分子标记辅助选择是目前有效的抗 病育种技术，转基因技术培育抗病新品种将具有广泛的应用前景。组蛋白是染色质的核心，具有重要生物学功能。EHMT2属于组蛋白赖氨酸甲基化转移酶Suv39家族成员，该家族成员含有高度保守的SET同源结构域，是一段由130个氨基酸残基组成的肽链，其N端和C端各自盘曲回旋成不向邻近的空间构象3-4个短的β折叠、ー个短螺旋及几个环将这些结构连接起来。绝大多数SET的C端局部形成一个拓扑学上不寻常的“假结”样结构。SET结构域对于维持组蛋白甲基化转移酶活性是必需的。ΕΗΜΤ2主要作用与Η3Κ9位赖氨酸的甲基化，发挥转录抑制作用。ΕΗΜΤ2基因由23个外显子和22内含子组成，定位在第7号染色体。组蛋白的尾部こ酰化、磷酸化、甲基化、泛素化等共价修饰组成组蛋白密码，调节许多生物学事件。近年来研究表明组蛋白赖氨酸甲基化在基因表达调控、X染色体失活、基因组印迹、DNA修补中起到重要作用。Lee(2010)研究敲除EHMT2基因的小鼠，发现胚胎在发育早期阶段死亡，由于组蛋白H3-K9不能发生甲基化，从而使小鼠胚胎在发育早期阶段死亡，表明EHMT2在早期胚胎发育是必需的。目前对EHMT2的研究主要集中与人和鼠类的研究，而在猪上的研究尚未发现(Lee JS等,Negative regulation ofhypoxic responses via induced Reptin metnylation. Mol Cell,2010,39(I) :71-85)。现有研究表明性状相关SNP标记绝大多数处在功能基因DNA序列中，陆续ー些研究筛选出更多与猪遗传基础相关的抗病カ有较好关联的候选基因来，有助于筛选新的分子标记和培育抗病品种。但是目前国内外对EHMT2基因的研究主要集中在人和小鼠的生物学功能，对猪EHMT2基因多态性还没有报道，迄今为止没有研究猪EHMT2基因与猪免疫力相关的分子标记。因此，申请人克隆了与猪免疫カ相关EHMT2基因的第27内含子部分序列，利用该序列进行了多态性和关联分析，以期得到新的作为猪免疫力相关的分子标记。
发明内容
本发明的目的在于克隆与猪免疫力相关的分子标记，利用该分子标记作为猪标记辅助选择的应用。本发明通过以下技术方案实现
申请人克隆得到一种作为分子标记应用的与猪免疫力相关的EHMT2基因片段，它的孩 Ρ酸序夕1J如 h 所不ccaagagtcctcattcctaacaagctcctgggcagcgctggggctgtaggtgcagagagcataggagggctcagagccc (a/c) gctgaagatggggacagatg ；(该序列见序列表 SEQ ID NO 2所述。括号内碱基突变位置及碱基的替换，下划线为83位引入一个错配的碱基t)在所述序列的80bp处有ー个80A-80C的碱基替换，在该序列的第83位引入ー个错配的碱基k导致PvuII-RFLP多态性。检测上述基因片段碱基突变的引物对，其核苷酸序列如下所示正向引物5’-ccaagagtcctcattcctaaca-3’ (见序列表 SEQ ID NO 3)反向引物5' -gcTgaagatggggacagatg-3'(原序列第3位的a错配成T,以大写 字母表示，见序列表SEQ ID N0:4所示)申请人:建立一种制备上述分子标记和检测上述分子标记的方法，该方法的步骤如下从猪品种的耳组织，毛囊，血液中提取总DNA，根据GenBank公布的猪EHMT2 (GeneBank登录号EU709015. I)序列为模板设计引物正向引物5，-gccttcttcagttcacgagac-3>,反冋弓I 物5 ' -tctgggacatcaaaagcaaatat-3>, PCR 扩増，PCR产物纯化和克隆测序，获得如序列表SEQ ID NO: I所示的核苷酸序列(序列长度为413bp)，应用CRS-PCR-RFLP方法检测猪EHMT2基因的多态性，并初步进行该位点与猪繁殖与呼吸综合征的关联分析。更详细的技术方案參见《具体实施方式
》。
序列表SEQ ID N0:1是猪EHMT2基因第27内含子的原始序列(序列长度为413bp)，显示在302bp处存在ー个A 302-C302的等位基因突变。序列表SEQ ID NO 2是利用碱基错配方法获得的猪EHMT2基因第27内含子的部分核苷酸序列，在80bp处存在ー个A 80-C80的等位基因突变，在该序列的第83位的t为引物中错配后的碱基。序列表SEQ ID NO 3和4是检测猪EHMT2基因片段突变的引物对的核苷酸序列。图I :是本发明的技术流程图。图2 :本发明克隆的猪EHMT2基因第27内含子的序列，括号为碱基的突变位点，即A302-C302，序列首尾的阴影区为引物对。图3 :本发明克隆的猪EHMT2基因用于PCR-RFLP检测A302-C302突变位点的序列，该序列包含在图2所示的序列中，括号内碱基的突变位点A80-C80即图2中的A302-C302，首尾的阴影区为设计的引入酶切位点引物对，下游引物中下划线T替代原碱基A，创造ー个酶切位点 PvuII (5，CAG/CTG 3，，3，GTC/GAC5，)。图4 :是本发明中猪EHMT2基因第27内含子序列部分序列扩增的电泳图谱，片段大小为413bp (琼脂糖胶浓度为I. 2% )。图中=Marker泳道为DNA分子量标准。图5 :是本发明中猪EHMT2基因用于PCR-RFLP检测的DNA片段，扩增含有A302-C302突变位点的序列的电泳图谱，片段大小为IOObp (琼脂糖胶浓度为I. 2% )。图中Marker泳道为DNA分子量标准。
图6 :是猪EHMT2基因测序后发现的I个突变位点，即A302-C302 (测序图为反向测序)。图7 :是本发明中猪EHMT2基因PCR-PvuII-RFLP的三种基因型(AA，AC和CC)电泳图谱。
具体实施例方式实施例I :制备实施例一、EHMT2基因部分片段的克隆和突变位点的筛选I.引物设计利用引物设计软件Primer 5.0,以猪EHMT2基因序列(GeneBank登录号 EU709015. I)为模板设计出包含第27内含子序列的引物，用来扩增“杜长大”(由国外品种“杜洛克”，“长白”和“大白”三个品种杂交得到，是ー种中国普遍推广应用的商用猪)EHMT2基因的第27内含子部分序列。引物对的合成由上海生物工程技术服务有限公司完成，该引物对的DNA序列如下正向引物5' -gccttcttcagttcacgagac-3!，反向引物5' -tctgggacatcaaaagcaaatat-31 02. PCR产物的纯化和测序(I) PCR 扩增PCR 扩增反应体系 20ul，包括 500ng 的 DNA，2. Oul 10XPCR buffer，O. 6ul IOmMdNTP, O. 8ul of each primer (IOuM) and IU Ampli Taq DNA polymerase (上海生エ生物工程技术公司)。PCR反应条件为PCR的反应程序为95°C 5min ；94°C 40s, 56. 3°C 30s， 72°C 30s，34个循环；72°C延伸lOmin。扩增产物用I. 2%的琼脂糖凝胶进行电泳检测(见图4)。(2) PCR产物的纯化及测序以5个猪品种(长白，大白，清平，金华，小梅山)的DNA为模板，每个猪品种内随机挑选3个个体用于PCR扩增，回收上述5个猪品种PCR扩增产物，混合测序。利用北京天根生物技术公司生产的小量DNA片段纯化试剂盒进行纯化回收，具体方法參照该试剂盒的操作说明书。序列測定由上海生ェ生物工程技术公司完成。(3) DNA序列同源性检索鉴定通过NCBI-BLAST (Basic Local Alignment Search Tool)工具，将测序后获得的序列与GenBank数据库中公布的參考序列(登录号EU709015. I)进行比对，结果显示成功克隆得到猪EHMT2基因含第27内含子部分序列413bp的片段(见图2和序列表SEQ ID NO:I)。(4) DNA序列中突变位点的筛选通过NCBI-BLAST (Basic Local Alignment Search Tool)工具，将测序后获得的序列与GenBank数据库中公布的序列(登录号EU709015. I)进行比对，将5个猪品种的混合测序峰图导入SeqMan软件进行比对分析，结果显示在猪EHMT2基因第27内含子部分序列有I个位点出现明显的双峰，这说明该基因在这个位点处发生了碱基突变(见图6)。这个位点是A302-C302
ニ、CRS-PCR-RFLP基因型检测方法的建立I.引入酶切位点引物设计针对多态位点A302-C302设计引入酶切位点引物，用于基因型检测，其DNA序列分别如下正向引物5，-ccaagagtcctcattcctaaca-3’(见序列表 SEQ ID NO 3)反向引物5' -gcTgaagatggggacagatg-3'(原序列的第3位的碱基a错配成碱基T，突变位置见下划线所示，见序列表SEQ ID NO 4)2. PCR 扩增20uL 的反应体系中加入 DNA模板 I μ L，双蒸水 14.3 μ L，10 X PCR buffer 2. O μ L,
Taq酶1U。PCR反应条件为94°C预变性5min后，94で变性408、56.3で退火308、72で延伸308，34个循环，最后72で延伸lOmin。3μ L PCR产物经I. 2%琼脂糖凝胶电泳检测(见图5)，阳性样品用于下ー步酶切检测。3. RFLP 检测(I)PvuII-RFLP 检测分子标记 A302_C302将PCR产物8 μ L，10XBuffer I μ L，限制性内切酶PvuII为4U，加双蒸水补至10μ L，将样品混匀后离心，37°C培养箱放置12h，酶切产物用8%聚丙烯酰胺凝胶电泳检测分型，银染并拍照。分子标记基因型分析如图7所示，分别代表A302-C302处SNP 3种不同的基因型(基因型用其突变碱基表示)AA、AC、CC，电泳结果显示CC基因型(只有一条帯，长度为IOObp)、AA基因型(一条带，长度为81bp)和AC基因型(2条带，长度为100bp/81bp)。(2)聚丙烯酰胺凝胶的制备及RFLP的电泳检测a. 8%聚丙烯酰胺凝胶的制备(见表I)表I聚丙烯酰胺凝胶的成分
权利要求
1.一种与猪免疫力相关的EHMT2基因片段，它的核苷酸序列如下所示 ccaagagtcctcattcctaacaagctcctgggcagcgctggggctgtaggtgcagagagcataggagggctcagagccc (a/c)gctgaagatggggacagatg ； 在所述序列的80bp处有一个80A-80C的碱基替换，导致PvuII-RFLP多态性。
2.扩增权利要求I所述基因片段的引物对，其核苷酸序列如序列表SEQID N0:3和4所示。
3.权利要求I所述的基因片段在猪分子标记辅助选择中的应用。
4.权利要求2所述的引物对在猪分子标记辅助选择中的应用。
全文摘要
本发明属于家畜分子标记制备技术领域，具体涉及一种作为猪标记辅助选择应用的与猪免疫力相关的分子标记的制备与应用。所述的分子标记由猪EHMT2基因克隆得到，它的基因序列如序列表SEQ ID NO1所示。序列表SEQ ID NO1的第302bp处有一个A302-C302的碱基突变。本发明还公开了扩增EHMT2基因第27内含子序列所用的引物以及用于A302-C302分子标记的检测方法。本发明为猪的标记辅助选择提供了1个新的分子标记。
文档编号C12Q1/68GK102690827SQ20111006752
公开日2012年9月26日 申请日期2011年3月21日 优先权日2011年3月21日
发明者任钰为, 刘向东, 刘文举, 周傲, 宋利军, 张杨, 张淑君, 杨利国, 江一波, 滑国华, 熊家军, 童勤, 赵书红 申请人:华中农业大学