专利名称：一种用于临床检测的测序方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种结合荧光定量PCR的基因测序方法。
背景技术：
测序技术是生物技术领域具有划时代意义的发明，该技术在基因扩增(聚合酶链反应，PCR)的基础上，直观的得到目的片段的核酸序列，为突变发现、疾病分析等提供了可能。测序技术是公认的序列分析和突变位点检测的“金标准”，使用测序技术，不但能检测已知的突变位点，亦能发现未知的突变位点。同时，测序技术也是病原微生物分型的理论基础，乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒等病原微生物的亚型分型原理就是基于病毒的全基因组序列差异或部分基因区域的序列差异。近年来，临床诊断领域常遇到的耐药位点突变、病毒亚型分型等新问题，需要新的技术和产品予以解决。而传统的测序技术使用定性PCR结合电泳检测模式对目的核酸片段进行扩增和扩增后的效果检测，存在一些弊端，不适用于临床诊断领域。这些弊端包括
(1)反应时间长，定性PCR结合电泳检测，一般需要2 3个小时的时间；
(2)在电泳时，需要打开PCR反应管，在PCR产物纯化过程中，需要切胶，这些操作时间长，容易产生大量的PCR产物气溶胶，引起假阳性；
(3)电泳检测的灵敏度低，造成低浓度模板漏检；
(4)切胶过程中将损失大量PCR产物，影响低浓度模板的测序效果；
(5)PCR产物的产量只能通过电泳图谱粗略估计，而在测序反应中，过多的PCR产物将使测序引物过快消耗，造成测序峰图不正常。荧光定量PCR技术是完全闭管操作(整个过程中，仅有加入样品一次开盖)，直接探测PCR过程中荧光信号的变化以获得定量的结果，不需要PCR后电泳处理，一举克服了定性 PCR技术的诸多难题，为PCR的临床应用又开辟了新的道路。但是荧光定量PCR是将检测的目的片段和探针设计在目的物的DNA或RNA的保守区域，单一的荧光定量PCR技术只能检测目的核酸的载量而无法检测目的物的类型和是否具有相关突变。
发明内容
本发明要解决的技术问题有两个方面，一个是克服现有技术的弊端，提供一种适用于临床诊断领域的基因测序方法，另一个方面是，提供基于该方法在制备基因检测试剂盒中的应用。为此，本发明通过下述技术方案予以实现。在本发明第一个方面，提供了一种结合荧光定量PCR的基因测序方法，它包括如下步骤
(1)荧光定量PCR使用目的片段特异性的引物和荧光探针，对目的片段的核酸模板， 进行扩增，得到目的片段的定量结果和PCR产物；
(2)酶解用外切酶(ExoI)和牛小肠碱性磷酸酶(CIAP)处理步骤(1)得到的PCR产物，以降解多余的引物和dNTP，避免对后续反应的干扰；
(3)测序反应使用目的片段特异性的测序引物，对步骤(2)得到的酶解产物进行延伸反应，获得带荧光标记的测序产物；
(4)测序产物纯化使用醋酸钠、无水乙醇、甲酰胺处理步骤(3)得到的测序产物，以获得高纯的测序产物；
(5)测序仪检测将步骤(4)得到的测序产物在测序仪上进行检测，获得目的片段的基因序列。在本发明的另一个方面，提供了基于上述方法在制备基因检测试剂盒中的应用， 所述基因检测试剂盒至少包含
(1)用于荧光定量PCR的各反应试剂，至少包括PCR反应液、目的片段特异性的上游 PCR引物、目的片段特异性的下游PCR引物、目的片段特异性的荧光探针、耐高温的DNA聚合酶；
(2)用于PCR产物酶解的试剂，至少包括外切酶和牛小肠碱性磷酸酶；
(3)用于测序反应的试剂至少包括目的片段特异性的测序引物、测序反应液。所述基因检测试剂盒，还可以包括阴性质控品、阳性质控品、定量标准品、尿嘧啶-N-糖基化酶(UNG酶)、醋醋酸钠、无水乙醇、甲酰胺等试剂。由于采用了上述的技术方案，本发明中的结合荧光定量PCR的基因测序方法，克服了传统的基因测序方法的弊端
(1)荧光定量PCR反应时间较定性PCR结合电泳检测的模式，能缩短广2个小时；
(2)没有电泳、切胶纯化等长时间操作的步骤，避免了大量PCR产物气溶胶的产生，降低了假阳性；
(3)荧光信号检测的灵敏度高于电泳检测，一般1000拷贝/ml的DNA模板即可被检测， 并应用于测序，降低了漏检率；
(4)没有切胶纯化的步骤，避免了PCR产物大量损失的情况；
(5)PCR产物的产量可以通过荧光值予以确定，较电泳图确认的准确度要高，提高了测序峰图的质量。基于该方法制备的基因检测试剂盒，有效的降低了临床最关注的假阳性问题，能够广泛的应用于临床诊断领域。
图1是本发明的操作流程图。图2是本发明实施例3的荧光定量PCR图。图3是本发明实施例3的荧光定量PCR后的电泳图。图4是本发明实施例7的测序图。
具体实施例方式下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。需要指出的是，以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法， 通常按照常规条件，例如《分子克隆实验指南》(第三版，科学出版社2002 [美]J.萨姆布鲁克，D.W拉塞尔著，黄培堂等译)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例1 引物、探针设计。针对乙型肝炎病毒的P基因的高突变区，设计特异性的PCR引物、探针和测序引物，序列如下表所示，并委托专业公司进行合成和荧光标记。
权利要求
1.一种结合荧光定量PCR的基因测序方法，其特征在于，它包括如下步骤1)荧光定量PCR使用目的片段特异性的引物和荧光探针，对目的片段的核酸模板，进行扩增，得到目的片段的定量结果和PCR产物；2)酶解用外切酶和牛小肠碱性磷酸酶处理步骤(1)得到的PCR产物，以降解多余的引物和dNTP，避免对后续反应的干扰；3)测序反应使用目的片段特异性的测序引物，对步骤(2)得到的酶解产物进行延伸反应，获得带荧光标记的测序产物；4)测序产物纯化使用醋酸钠、无水乙醇、甲酰胺处理步骤(3)得到的测序产物，以获得高纯的测序产物；5)测序仪检测将步骤(4)得到的测序产物上测序仪进行检测，获得目的片段的基因序列。
2.一种基于权利要求1所述方法的基因检测试剂盒，其特征在于，所述基因检测试剂盒至少包含如下部分1)用于荧光定量PCR的各反应试剂，至少包括PCR反应液、目的片段特异性的上游 PCR引物、目的片段特异性的下游PCR引物、目的片段特异性的荧光探针、耐高温的DNA聚合酶；2)用于PCR产物酶解的试剂，至少包括外切酶和牛小肠碱性磷酸酶；3)用于测序反应的试剂至少包括目的片段特异性的测序引物、测序反应液。
3.权利要求2所述基因检测试剂盒，还可以包括阴性质控品、阳性质控品、定量标准品、尿嘧啶-N-糖基化酶、醋醋酸钠、无水乙醇、甲酰胺等试剂。
全文摘要
本发明公开了一种结合荧光定量PCR的基因测序方法，它包括荧光定量PCR、酶解、测序反应、测序产物纯化、测序仪检测等步骤。本发明还公开了基于该方法制备基因检测试剂盒的应用。本发明的方法使用荧光定量PCR代替传统的定性PCR加电泳的模式对目的核酸进行扩增和扩增效果的检测，既缩短了检测时间，又避免了电泳过程中开盖带来的PCR气溶胶污染问题，降低了假阳性，非常适用于临床检测等医疗领域。同时，根据荧光定量PCR对目的片段的定量结果，可以得知目的片段的起始浓度，并大致判断PCR产物的浓度，可直接指导后续的基因测序，提高了检测的灵敏度和基因测序的效率。
文档编号C12Q1/68GK102154502SQ20111009787
公开日2011年8月17日 申请日期2011年4月19日 优先权日2011年4月19日
发明者刘明坤, 叶锋, 赵洪斌 申请人:北京鑫诺美迪基因检测技术有限公司