专利名称：一种肠道病毒71衣壳蛋白1抗原、制备方法及免疫检测试剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及肠道病毒71(EV71)衣壳蛋白I(VPl)基因改造及重组抗原，还涉及用于检测EV71抗体的检测试剂。
背景技术：
肠道病毒71型(Enterovirus 71，EV71)感染在临床上主要引起患者手足口病 (hand, foot and mouth disease，HFMD)。主要感染对象为5岁以下的幼儿。2岁以下儿童的血清抗EV71抗体水平阳性率仅为0. 8%，到5 6岁时血清抗体水平上升并达到一个稳定的状态，约为50%;5 6岁以上人群的抗体水平则随着年龄的增加再次逐渐下降。[Ooi E E, Phoon M C, Ishak B, et al. Seroepidemiology of human enterovirus 71. Emerg Infect Dis. 2002 ；8 :995-997.]。成年人亦可感染，并在同一家庭成员内部传播，但临床症状不明显。这种亚临床感染或隐性感染也是EV71快速传播的又一个重要途径。EV71病毒为小RNA病毒科肠道病毒属，病毒基因组为单股正链RNA，基因组中仅有一个开放阅读框，编码含2194个氨基酸的多聚蛋白。多聚蛋白可进一步被水解成P1、P2、 P3三个前体蛋白，其中Pl蛋白降解成VP1、VP2、VP3、VP4四个病毒衣壳蛋白；P2和P3前体蛋白裂解为2A、2B、2C、3A、VPg、3C、3D共7个非结构蛋白。组成EV71病毒粒子基本单位为4 种衣壳蛋白(VPl VP4)，除VP4包埋在病毒粒子外壳的内侧与病毒核心紧密连接以外，其它3种结构蛋白均暴露在病毒颗粒的表面，因而抗原决定簇基本上位于VPl VP3上。EV71 的基因型主要根据病毒衣壳蛋白VPl核苷酸序列的差异，目前，EV71可分为A、B、C三个基因型，其中，我国主要为 C 型[Xu JjQian Y, Wang S，et al. EV71 :an emerging infectious diseasevaccine target in the Far East ？ . Vaccine. 2010 ；28 (20) :3516-21.]EV71病毒引发的手足口病近年呈上升趋势。由于EV71预后差，其早期症状与柯萨奇、疱疹病毒、埃可病毒引发的临床症状极为相似，因此，EV71的早期诊断对后期疾病的防治工作意义重大。传统的病毒培养和中和试验繁琐、灵敏度低，检测周期通常需要 5-10天，严重影响EV71患者的早期临床治疗和隔离工作[Wang SY, Lin TL, Early and rapid detection of enterovirus 71infection by an IgM—capture ELISA. J Virol Methods. 2004 ； 119(1) :37-4]。随着分子生物学技术的发展，目前，可以直接通过对患者标本中EV71-RNA的检测开展EV71的早期诊断工作。但通常EV71-RT-PCR检测需要特殊的仪器，对人员素质要求较高，很难在国内基层医院开展，最为重要的是EV71存在隐性感染，仅样本中EV71-RNA阳性并不能判断疾病的急性发病，因此，开展简单快速的EV71-IgM酶联检测试剂在EV71早期临床检测中具有重要意义[Chang LY, Tsao KC, Hsia SH, et al. Transmission andclinical features of enterovirus 71 infections in household contacts in Taiwan. JAMA. 2004 Jan 14 ；291 (2) :222-7.]。Tsao以抗μ链单抗包被酶联板，建立IgM捕获法EV71-ELISA检测技术，以病毒培养法为标准，该检测技术的灵敏度和特异性分别为91. 5和93. 1%，在发病的第二天就可以检测出 EV71_IgM 的出现[Tsao KC, Chan EC, Chang LY, et al. Responses of IgM for enterovirus 71 infection. J Med Virol. 2002 ；68 (4) :574-80] ；Xu 对商品化 EV71_IgM ELISA检测试剂进行评价，发现在发病当天，就有90%的患者中能检测出IgM抗体，这种状况一直维持4天，随后敏感度上升到95%至100%，并一直保持一个月以上。在中和测试低于1 100的健康人群和健康儿童中其特异性分别为99. 9%和99.2% ；在非手足口儿童患者中，交叉率为 11. 4% [Xu F, Yan Q，Wang H, et al. Performance ofdetecting IgM antibodies against enterovirus 71 for early diagnosis. PLoS One. 2010 ；5 (6) ell388]，由此可见采用IgM捕获法EV71-ELISA检测技术在临床EV71早期检测中是可行的。但遗憾的是，上述IgM-ELISA检测技术均采用的是灭活的EV71病毒颗粒作为检测抗原，生产及操作的安全性远比重组抗原差，Siih等曾用EV71的VPl基因的原核表达产物作为抗原诊断EV71的感染，结果表明，原核表达的VPl蛋白作为检测抗原，既可检测急性感染期患儿血清中的IgM，也可检测曾感染EV71患者血清中的IgG，而且与CA16抗血清无交叉免疫反应。初步证实重组蛋白VPl抗原在制备EV71-ELISA诊断试剂的重要地位 [Shin-Ru Shih,et al Expression of Caspid Protein VP Ifor Use as Antigen forthe Diagnosis of EV71 Infection. J Med Virol, 200061 :228-234]。除此以外，用原核表达的 VPl蛋白作为基因工程亚单位疫苗对实验母鼠进行免疫接种，结果表明，VPl蛋白疫苗对新生小鼠有免疫保护效果，在疫苗研究中也具有同等重要地位。但由于VPl抗原基因中含有大量的大肠杆菌稀有密码子，基因表达量较低，无法大量制备，限制了其在EV71-IgM ELISA 检测试剂及疫苗中的应用。
发明内容
为了满足EV71-VP1抗原在检测试剂及疫苗生产中的需求，本发明采用大肠杆菌优势密码子对EV71-VP1基因进行改造，并采用退火延伸PCR技术获得改造后的VPl基因， 采用基因重组技术对上述VPl基因进行克隆表达，获得高表达的VPl抗原，以此重组抗原为基础建立IgM捕获法EV71-ELISA检测试剂，并评价其EV71-VP1抗原的免疫学活性。本发明的目的是提供有大肠杆菌优势密码子组成的EV71-VP1基因。本发明公开的EV71-VP1基因，其基因序列如序列表中序列1所示(1)序列表中序列1，本发明还公开了上述EV71-VP1基因的拼接改造及克隆表达技术及其在制备 EV71-IgM抗体检测试剂中的用途。本发明提供了一种基于重组VPl抗原建立的鉴定 EV71-IgM的临床检测技术。与现有技术相比，本发明具有以下特点1.发明是建立在改造的EV71-VP1基因的基础上EV71-VP1含有重要的中和性抗原表位，在EV71诊断与疫苗研发中处于重要地位， 但由于其基因含有大量的大肠杆菌稀有密码子，表达量低。本发明根据VPl氨基酸序列，采用大肠杆菌优势密码子，反向翻译成基因序列，并采用退火延伸PCR技术进行基因拼接，获得891个核苷酸组成的改造后VPl基因，并以此为基础，进行EV71-VP1抗原的高效表达。CN 102242132 A
说明书
3/6页2.发明是建立EV71-VP1重组抗原的基础上目前EV71_IgM检测试剂中采用的诊断用抗原均是来自灭活的EV71病毒颗粒，生产和检测中安全性差。本发明是建立高效表达的EV71-VP1重组抗原的基础上，可有效的避开生产和检测过程中与EV71病毒的接触，降低了整个实验的危险性。3.本发明是在IgM捕获法基础上实现对EV71的临床诊断。目前报道的重组VPl抗原由于受到表达量及后续抗原标记过程的限制，均是采用 VPl抗原包被，抗IgM抗体标记辣根酶显色的间接ELISA检测技术，本研究将利用抗μ链单抗包被酶联板，以辣根酶标记重组VPl抗原，建立IgM捕获法EV71-ELISA检测技术，与间接 ELISA技术相比，具有较高的特异性。为实现上述目的，发明人根据我国主要EV71-VP1氨基酸序列，采用大肠杆菌优势密码子反向翻译成核苷酸序列，改造后的VPl基因序列如序列表中序列1所示。采用退火延伸PCR技术，获得改造后的VPl基因，基因工程表达后，大量纯化制备 VPl抗原，并进行辣根酶标记，制备酶标二抗；采用IgM捕获法实现对EV71-IgM的临床检测。本发明是通过以下技术方案得以实现的利用生物信息学软件，采用大肠杆菌优势密码子反向翻译成核苷酸序列。为了便于基因拼接，本发明将VPl序列分成4段进行退火延伸PCR，为了便于基因克隆到表达载体， 在连接臂的两端引入BamHI和EcoRI两个酶切位点，以适合表达载体pBET_28a。双酶切后插入载体pBET-28a中，构建相应的表达质粒。测序法证明各基因片段已获正确地插入。EV71-VP1抗原表达质粒，转化E. coli BL21后，通过IPTG诱导，取全菌液进行 SDS-PAGE鉴定，证明该质粒均已获得了高效的表达，再经镍柱及凝胶过滤纯化，可获得电泳纯的EV71-VP1抗原纯品。采用碘化钠法进行辣根酶标记，制备酶标抗原复合物。采用IgM 捕获法对EV71患者血清中IgM进行检测，并评价其检测的灵敏度和特异性。实验结果证明，本发明所提供的四份手足口病患者中检出M份阳性，检出率为 82.8%, 50份健康人血清中检出50份，特异性为100%，显示出本发明获得的VPl抗原具有 EV71特异性的免疫学活性，在诊断试剂和疫苗研究中具有一定的应用价值。
附图1EV71-VP1改造基因的克隆表达的SDS-PAGE
具体实施例方式1、EV71_VP1基因的改造和合成。我们通过生物信息学软件，采用大肠杆菌优势密码子将EV71-VP1抗原的氨基酸序列反向翻译成核苷酸序列，改造后的EV71-VP1基因序列如序列表中序列1所示；考虑到目前国内基因引物合成效率，本发明将上述基因分为E、F、G、H共4段分别予以合成，四段基因片段末端具16个核苷酸的匹配序列。在进一步拼接成完整EV71-VP1基因序列，每段合成的引物序列如序列表中的2-33所示，为了方便描述所述制备方法，为相应基因序列命名，SEQ ID NO :2 至 5 分别命名为 EF4、EF3、EF2、EFl ；SEQ ID NO :6 至 9 分别命名为 ERl、 ER2、ER3、ER4 ； SEQ ID NO 10 M 13 分别命名为 FF4、FF3、FF2、FFl ； SEQ ID NO 14 M 17 分别命名为 FRl、FR2、FR3、FR4 ； SEQ ID NO 18 M 21 分别命名为 GF4、GF3、GF2、GFl ；SEQ ID NO 22 至 25 分别命名为 GR1、GR2、GR3、GR4 ；SEQ ID NO 26 至 29 分别命名为 HF4、HF3、HF2、 HFl ；SEQ ID NO 30至33分别命名为HR1、HR2、HR3、HR4 ；所述方法共分为3步第1步E、F、G、H基因片段的合成合成上述基因共需要4轮退火延伸PCR反应，第一轮PCR反应体系为百泰克公司 2 XPCR反应液25μ 1、双蒸水23μ 1、XF1及)(R1引物各1 μ 1，期中X代表Ε、F、G、H，PCR反应条件为94°C 1分钟后，94°C 1分钟，55°C 1分钟，72°C 1分钟，5个循环；后续第η轮PCR 反应体系为百泰克公司2XPCR反应液25μ 1、双蒸水22 μ 1、XFn及Xfoi引物各1 μ 1，η_1 轮PCR产物1 μ 1，η代表2，3，4 ；反应条件为PCR反应条件为94°C 3分钟后，94°C 1分钟， 550C 1分钟，72°C 1分钟，30个循环后再72°C延伸5分钟，即获得E、F、G、H四段基因。第2步EF基因片段和GH片段的PCR退火延伸合成EF基因片段拼接的PCR反应体系为百泰克公司2XPCR反应液25 μ 1、双蒸水 23μ 1、E基因及F基因各1μ 1，PCR反应条件为94 °C 1分钟后，94 °C 1分钟，55°C 1分钟，72°C 1分，5个循环；第二轮PCR反应体系为百泰克公司2XPCR反应液25μ 1、双蒸水 22μ 1、引物EF4及引物FR4基因各1μ 1，PCR反应条件为94°C 1分钟后，94°C 1分钟，55°C 1 分钟，720C 1分钟，5个循环；30个循环后再72°C延伸5分钟，即获得EF基因片段；GH基因片段的拼接方法同EF，相应E换成G，F换成H，即可获得GH基因片段。第3步EV71_VP1基因片段的获得PCR反应体系为百泰克公司2XPCR反应液25μ 1、双蒸水23μ 1、EF基因及GH基因各1μ 1，PCR反应条件为94°C 1分钟后，94°C 1分钟，55°C 1分钟，72°C 1分钟，5个循环；第二轮PCR反应体系为百泰克公司2 XPCR反应液25μ 1、双蒸水22μ 1、引物EF4及引物HR4 基因各1 μ 1，PCR反应条件为94°C 1分钟后，94°C 1分钟，55°C 1分钟，72°C 1分钟，5个循环；30个循环后再72°C延伸5分钟，即获得整个基因片段。2、EV71_VP1改造基因的克隆、表达及标记。1. EV71-VP1抗原表达质粒的构建1. IPCR产物及表达载体pBET_28a双酶切取以上合成基因产物及pBET_28a表达载体各30 μ 1分别放于Eppendorf离心管中，各加入 10 X buffer (D) 4 μ 1、BamHI (lOu/ μ 1)和 EcoRI (12u/ μ 1)各 1 μ 1，加灭菌蒸馏水至40 μ 1，置37 °C水浴酶切过夜。酶切产物的琼脂糖凝胶电泳纯化和回收PCR产物及载体pBVILl经双酶切后，用 1.2%琼脂糖凝胶进行纯化，具体方法按《分子克隆》(科学出版社，第二版)的方法进行。 纯化基因再用上海华舜生物工程有限公司生产的小量胶回收试剂盒回收即在紫外灯下分别切下含质粒和目的基因的琼脂糖，放于Eppendorf离心管中，各加入Sl液，置55°C水浴 10分钟使胶溶解，加入等量异丙醇，混勻，55°C温浴1分钟，然后分别移入吸附柱后，按试剂盒说明书进行纯化。1. 2.连接于灭菌Eppendorf离心管中加入上述酶切后的载体及目的基因各 1 μ 1U0XT4 DNA Ligase buffer 1μ1、Τ4 DNA Ligase (12u/ul) 1 μ 1，加灭菌蒸溜水至 10μ 1，置 16°C 过夜。1. 3转化在超净工作台中，用无菌吸头取100 μ 1感受态细胞(感受态细胞按《分子克隆》(科学出版社，第二版)的方法进行)悬液于Eppendorf中，加入上述连接物5 μ 1， 轻轻旋转混勻，冰浴30分钟。立即转移到42°C水浴中放置2分钟，每管加入0.5ml LB培养基(不加抗生素)，30°C水浴摇床培养60分钟后，各取0. 2ml分别涂于LB琼脂培养基平皿上(含抗生素)，室温晾干后，置37°C恒温箱倒置培养过夜。挑选数个菌落，分别接种于LB 中(5ml/管)，培养过夜，次日各取0. Iml转移到LB中(^iil/管)，32°C培养3小时，ImMIPTG 诱导培养小时，收菌，用SDS-PAGE鉴定，选择目的基因获得高表达菌株，并测序鉴定。2.抗原的表达与纯化2. 1表达菌株的培养取_70°C保存的表达菌株20 μ 1接种于LB培养基中(100ml LB/500ml三角瓶)，30°C空气摇床培养过夜，次日按5 %的比例转种于LB培养基(同上)， 30°C空气摇床培养约3小时，当0D600值达到0. 7时，加入ImM IPTG，诱导培养小时，将菌液合并，6000rpm离心20分钟，弃上清，收集沉淀部分。2. 2提取包涵体将沉淀称湿重，用10倍体积的20mmol/L pH8. OTE缓冲液将沉淀悬起，加入溶菌酶(lmg/ml悬液)，在室温下磁力搅拌10分钟。在冰浴中超声波破碎菌，每次超30秒钟，间隔30秒钟，共超10次。8°C，1，2000rpm,离心20分钟，弃上清，沉淀用Imol/ L NaCl (用TE配制)洗一次，再用TE洗2次，收集沉淀。沉淀用8M脲(用PH8. OTE配制) 溶解，加β -巯基乙醇。再于20°C，1，2000rpm，离心10分钟，去沉淀取上清，EV71-VP1 克隆表达的情况参见附图1。2. 3纯化将上述溶解的包涵体溶液过镍离子柱，用吸附缓冲液(pH8. 0，20mmol/L TE含6mol/L脲，0. β -巯基乙醇，5mM咪唑，0. 25M NaCl)平衡清洗上样后，用洗脱缓冲液(pH8. 0, 20mmol/L TE含6mol/L脲，0. 1 % β -巯基乙醇，200mM咪唑)洗脱，收集第一洗脱峰。再过Sephardex G-50凝胶过滤柱，缓冲液采用ρΗ8· 0，20mmol/L TE含0· 1 % SDS,收集第一洗脱峰。洗脱抗原采用SDS-PAGE进行纯化鉴定。3.辣根酶(HRP)标记EV71-VP1抗原取HRP 5mg溶于0. 2mol/L PH 5. 6醋酸盐缓冲液0. 5ml ；加入新鲜配制的0. Imol/ L NaI04 0. 25ml ；混勻。(此时溶液颜色应由黄棕色变为墨绿色)4°C 30分钟；加入2. 5% 己二醇0.5ml，混勻。室温置30分钟。(此时溶液应恢复为黄色)；加入待标记抗体5 10mg，用 1. Omol/L PH 9. 5CBS 调 PH 至 9. 0，混勻。4°C过夜；加入 NaHB4 0. Iml (0. 5mg)，混勻。4°C 2小时后对O.Olmol/L PH 7. 4PBS透析，4°C过夜。加入适量中性甘油后小量分装。3、基于重组VPl抗原EV71_IgM抗体检测(捕获法)技术的建立及其应用。1.基于重组VPl抗原建立EV71_IgM抗体检测(捕获法)技术抗IgM-μ链单抗包被酶联板(PBS稀释到2μβ/π 1)，每孔100μ1，4 过夜后弃液，蒸馏水冲洗3次，拍干，每孔加入BSA 100 μ 1，室温2小时，弃液。每孔加入100 μ 1 样品稀液后，分别加入10 μ 1的待测样本血清，37°C 30分钟，弃液，用洗涤液洗板5次后弃液，拍干，加入辣根过氧化物酶标记的EV71-VP1抗原(1 1000) 100μ 1，37°C温浴20分钟， 弃液洗板5次拍干。加TMB显色液A和B液各50 μ 1，37°C避光显色10分钟，每孔加入终止液50 μ 1，用酶标仪读取450nm吸光值0D。OD > 0. 1判断为阳性。2. EV71-IgM抗体检测(捕获法)技术的临床检测共采用四份手足口病患者血清进行检测，VPl-IgM抗体阳性M例，检出率为 82.8%, 50份健康人血清中检出50份，特异性为100%，显示出本发明获得的VPl抗原具有EV71免疫学活性，在诊断试剂和疫苗研究中具有一定的应用价值。
权利要求
1.一种由大肠杆菌优势密码子组成的肠道病毒71 (EV71)衣壳蛋白I(VPl)抗原，其核苷酸序列SEQ ID NO 1所示。
2.制备如权利要求1所述抗原的方法，其特征在于，通过如下步骤获得基因表达为相应基因序列命名，SEQ ID NO :2至5分别命名为EF4、EF3、EF2、EFl ；SEQ ID NO 6 至 9 分别命名为 ERl、ER2、ER3、ER4 ； SEQ ID NO 10 M 13 分别命名为 FF4、FF3、FF2、FFl ； SEQ ID NO 14 M 17 分别命名为 FR1、FR2、FR3、FR4 ； SEQ ID NO 18 M 21 分别命名为 GF4、 GF3、GF2、GF1 ；SEQ ID NO 22 至 25 分别命名为 GR1、GR2、GR3、GR4 ；SEQ ID NO 26 至四分别命名为 HF4、HF3、HF2、HF1 ；SEQ ID NO 30 至 33 分别命名为 HR1、HR2、HR3、HR4 ；第1步合成E、F、G、H基因片段；合成E、F、G、H基因片段共需要4轮退火延伸PCR反应，第一轮PCR反应体系为百泰克公司2XPCR反应液25 μ 1、双蒸水23 μ 1、XFl及XRl引物各1 μ 1，其中X代表Ε、F、G、H， PCR反应条件为94°C 1分钟后，94°C 1分钟，55°C 1分钟，72°C 1分钟，5个循环；后续第η轮 PCR反应体系为百泰克公司2XPCR反应液25 μ 1、双蒸水22 μ 1、XFn及Xfoi引物各1μ 1， η-1轮PCR产物1 μ 1，η代表2，3，4 ；反应条件为PCR反应条件为94°C 3分钟后，94°C 1分钟，55°C 1分钟，72°C 1分钟，30个循环后再72°C延伸5分钟，即获得E、F、G、H四段基因；第2步EF基因片段和GH片段的PCR退火延伸合成；EF基因片段拼接的PCR反应体系为百泰克公司2 XPCR反应液25 μ 1、双蒸水23 μ 1、E 基因及F基因各1 μ 1，PCR反应条件为94°C 1分钟后，94°C 1分钟，55°C 1分钟，72°C 1分钟，5个循环；第二轮PCR反应体系为百泰克公司2XPCR反应液25μ 1、双蒸水22μ 1、引物EF4及引物FR4基因各1 μ 1，PCR反应条件为94°C 1分钟后，94°C 1分钟，55°C 1分钟， 720C 1分钟，5个循环；30个循环后再72°C延伸5分钟，即获得EF基因片段；GH基因片段的拼接方法同EF，相应E换成G，F换成H，即可获得GH基因片段；第3步获得EV71-VP1基因片段；PCR反应体系为百泰克公司2 XPCR反应液25 μ 1、双蒸水23 μ 1、EF基因及GH基因各 1μ 1，PCR反应条件为94°C 1分钟后，94°C 1分钟，55°C 1分钟，72°C 1分钟，5个循环；第二轮PCR反应体系为百泰克公司2 XPCR反应液25μ 1、双蒸水22μ 1、引物EF4及引物HR4基因各1 μ 1，PCR反应条件为94°C 1分钟后，94°C 1分钟，55°C 1分钟，72°C 1分钟，5个循环； 30个循环后再72°C延伸5分钟，即获得整个基因片段。
3.—种EV71抗体检测试剂，其特征在于，使用如权利要求1所述的EV71-VP1抗原制备。
4.一种EV71重组疫苗，其特征在于，使用如权利要求1所述的EV71-VP1抗原制备。
全文摘要
本发明公开了一种采用大肠杆菌优势密码子拼接的肠道病毒71(EV71)衣壳蛋白1(VP1)抗原基因序列。本发明直接由32条短的基因引物片段，通过退火延伸PCR技术，获得改造后的VP1基因，无需EV71病毒模板；改造后的VP1基因具有较高表达量，可以通过纯化获得相应的重组EV71-VP1抗原，较病毒裂解法具有较高的安全性。
文档编号C12R1/19GK102242132SQ20111009767
公开日2011年11月16日 申请日期2011年4月19日 优先权日2011年4月19日
发明者修冰水, 宋晓国, 张贺秋, 王国华, 陈堃 申请人:中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所