专利名称：一种猪流感h1n1亚型灭活疫苗及制备方法
技术领域：
本发明属于动物病毒学技术领域，具体涉及一种猪流感HlNl亚型灭活疫苗及制备方法。本发明还涉及由该HlNl亚型猪流感病毒毒株制备的灭活疫苗及应用。
背景技术：
猪流感(SI)是一种急性感染的呼吸系统疾病，以突然发病、咳嗽、呼吸困难、发热和衰竭，以及随后的迅速恢复或死亡为特征。各品种、性别和年龄的猪均能感染，发病率高，猪群暴发流感时，发病率可高达100%。猪的呼吸道上皮细胞同时存在着可与禽流感、人流感、猪流感、马流感等流感结合的受体，这些受体的存在使猪可以携带禽流感、人流感、猪流感、马流感病毒，因此，猪可能被人、禽及其他动物流感病毒感染，是流感病毒的“混合器”及病毒基因重配的“温床”。猪流感传播迅速，常引起急性呼吸道疾病暴发。其典型的临床症 状为流鼻涕、咳嗽和呼吸困难，伴有发热、嗜睡以及随之而来的厌食和消瘦等症状。因为猪流感在单独感染的情况下很少引起死亡，所以在国内并没有引起足够的重视，规模化猪场未将猪流感疫苗免疫提到议事日程。然而，Siv与猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、圆环病毒及肺炎支原体混合感染时，会显著增加上述疾病的损害程度和病死率。另外，SIV也是猪呼吸道疾病综合征的主要病原。SIV与其它病原体共感染或继发感染所造成的损害已成为制约当前猪场经济效益的主要原因之一。由于猪流感在禽流感和人流感的流行、传播和分子变异中的特殊作用，其对公共卫生也有着十分重要的意义。2009年甲型HlNl流感的大流行再次给我们这个交流日益频繁的世界提出了一个大公共卫生的问题。2009年4月以来，始发于墨西哥的甲型HlNl流感波及全球，给人类健康构成了巨大威胁。研究表明墨西哥的甲型HlNl流感病毒与以往在猪体内分离的流感病毒有明显的差异，属于变异后的新毒株，可以人传染人。美国CDC分析表明，甲型HlNl流感病毒基因来自于北美猪流感、北美禽流感、人流感以及欧洲和亚洲的经典猪流感等4个不同病毒，是不同病毒间杂交混合的结果。由于甲型HlNl流感病毒有五个基因片段来自于猪流感，因此一度被称为猪流感，再次引发了人们对猪流感的高度关注。回顾猪流感流行的百年历史，可以清楚的看到猪流感给人类带来的危害。猪流感自1918年在美国首次发生以来，已造成世界范围内的多次大流行。SIV于1931年由Shope首次分离并鉴定，这就是20世纪初引起美国猪流感流行的古典型HlNl病毒株，该毒株是古典猪流感病毒的代表株。其分离鉴定开始了猪流感及猪流感病毒研究的新纪元。与美国不同的是，欧洲大陆猪流感发生较晚，直到20世纪70年代末才出现暴发式流行，其流行的毒株虽然也是H1N1，但是与美国流行的古典型SIV在抗原性和遗传性上均有显著差异，而与来自鸭的HlNl有着很高的同源性。为了区别2种不同的HlNl亚型毒株，通常把后者称为类禽型H1N1。这2种HlNl亚型毒株随后都传入亚洲并在世界各国长期流行。1969年H3N2亚型SIV首次分离于台湾，1970年在香港也分离到SIV的H3N2亚型毒株。这次流行的H3N2毒株及其变异株在以后的十多年间传播到了世界各地。1984年，欧洲大陆首次报道了类人H3N2亚型毒株引起的猪流感暴发，并且整个欧洲大陆的猪群都表现出高水平的抗体。1988年，美国许多接种了 HlNl流感疫苗的猪场暴发了严重的猪流感，其病原经鉴定为H3N2亚型毒株。此后，HlNl和H3N2成为世界各国广泛流行的2个SIV主要血清型。研究表明，近几年发生于日本、韩国、美国的H1N2亚型SIV是HlNl和H3N2的重组产物，迄今在猪群中流行的猪流感主要有古典猪H1N1、类禽HlNl和类人H3N2毒株，古典型HlNl SIV以地方流行性存在于欧美大陆，并于20世纪70年代传到了东亚各国，并在这些国家广泛流行。目前已发现的流感病毒HA亚型有15个，NA亚型有9个。尽管不同的亚型之间可以组成很多种流感病毒血清型。但目前造成世界性流行SIV血清型只有H1N1，H1N2和H3N2。但也有其它血清型的零星报道，如H1N7、H3N6、H4N6、H9N2和H5N1等。我国猪流感的血清学和病原学调查结果都表明，在我国横跨南北的多个省市都有严重的猪流感流行，血清学和病毒学监测显示出我国猪群不仅广泛存在Hl和H3亚型猪流感病毒感染，也出现了 H9亚型猪流感病毒感染。·2006年5月 2008年7月之间，本实验室对湖南、湖北、江西、河南等地23个规模化猪场送检的7790份种公猪、后备和经产母猪的血清进行了猪流感病毒Hl亚型血凝抑制试验(HI)检测。结果表明，所检测猪血清中存在Hl亚型SIV抗体，06年、07年、08年HI阳性率分别为 23. 46%,33. 90%,39. 71%02009年4月北美甲型HlNl流感暴发流行，本实验室分别用北美甲型HlNl流感病毒的HA表达蛋白、国内分离的HlNl猪流感病毒的HA表达蛋白包被ELISA板对湖北、河南、江西、安徽等地814份送检血清进行了检测。ELISA结果表明(I)国内分离的HlNl猪流感HA-ELISA检测阳性率为27. 5% (224/814)。224份猪流感ELISA检测阳性样品进一步用甲型HlNl流感病毒HA-ELISA检测，结果显示有65份为阴性，说明了其中有159份血清样品为两种HA抗原检测同为阳性，具有71%的抗原交叉反应(159/224)。(2)北美甲型HlNl流感病毒HA-ELISA检测阳性率为23. 7% (193/814)，193份甲型HlNl流感病毒HA-ELISA检测为阳性样品进一步用猪流感HA-ELISA检测，结果有34份为阴性，说明了其中有159份血清样品为两种HA抗原检测同为阳性，具有82. 4%的抗原交叉反应(159/193)。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，制备一株HlNl亚型猪流感病毒的灭活疫苗，本发明还包括该灭活疫苗的制备方法与应用。本发明通过以下方案实现本发明的猪流感灭活疫苗株是从某发病猪场的鼻拭子样品中分离得到，经RT-PCR扩增，连接T载体进行测序检测鉴定该病毒为HlNl亚型猪流感病毒(H1N1 swineinfluenza virus)。申请人将该病毒株命名为猪流感病毒(swine influenza virus)HlNlSIV TJ，该毒株于2011年3月25日送交湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，其保藏号为CCTCC N0:V201107。将所述的病毒株接种鸡胚培养，收获感染鸡胚液，用甲醛溶液灭活、混合和加常规油佐剂乳化制成HlNl亚型猪流感病毒灭活疫苗(技术流程如图I所示)。本发明分离株的微生物鉴定
形态描述流感病毒时负链RNA病毒。基因组是分节段的，每个RNA病毒都由核蛋白包被形成RNP复合体。RNPs由基质蛋白(M1)构成完整的膜包裹。脂类来自宿主细胞膜，而在病毒粒子内部是RNA依赖性聚合酶蛋白(PA、PB1和PB2)，两个重要的跨膜蛋白分别是棒状的HA和蘑菇状的NA。典型的流感病毒在电镜下呈球形(如图2所示)，直径为80 120nm，平均为lOOnm。流感病毒具有囊膜，在囊膜表面有许多放射性排列的纤突，病毒粒子的中心有一直径为40 60nm的电子密度高的锥状核心。本发明的优点是I、本发明提供了一种新的猪流感病毒毒株，由该毒株所制备的灭活疫苗能够有效预防HlNl亚型猪流感病毒的感染。
2、本发明制备的疫苗安全性良好，试验证明具有良好的安全性，免疫保护效果达到80%以上。更详细的技术方案见《具体实施方式
》所述。
序列表SEQ ID NO 1是本发明用于鉴定的猪流感病毒HA和NA基因的部分核苷酸序。图I :是本发明的总体技术流程图。图2 :猪流感病毒的电镜图。图3 :HA、NA基因的凝胶电泳图。图4 pMD-18T 载体图谱。图5 :是本发明登录的HA基因序列和NA基因序列的全长。其中图5a为HA基因的核苷酸序列，图5b为NA基因的核苷酸序列。图6 :本发明的灭活疫苗注射猪的颈部的吸收情况的病理切片。其中图6a、图6b是灭活疫苗中的抗原正在逐渐的刺激机体产生特异性的抵抗力，淋巴细胞正在逐渐的吞噬这些油脂细胞；图6c和图6d是非免疫对照猪的肌肉组织和脂肪组织间未观察到明显的油脂细胞和淋巴细胞聚集。图7 :免疫猪与未免疫对照猪攻毒后剖解的病理变化图。
具体实施方案实施例I制备实施例I病毒株的分离与鉴定从中国某猪场疑似流感感染的猪群中采集鼻拭子，接种鸡胚，收集鸡胚尿囊液，经RT-PCR方法检测后鉴定为猪流感病毒HlNl亚型，将该病毒株命名为猪流感病毒HlNl SIVTJ株。具体操作步骤如下提取鸡胚尿囊液的RNA，RT-PCR扩增反转录用的引物序列Unil2 :其核苷酸序列(单链)如下5’ -AGCAAAAGCAGG-3’猪流感病毒cDNA合成
在20ii L反转录体系中进行，依次加入以下组分AMV Reverse Transcriptase XL (50U/U L) I. 0 U L ；RNase inhibitor (40U/U L)0. 5 U L ；5 X RNA PCR Buffer4. 0 U L ；Unil2prime(IOpmol)rI. 5 u L ；dNTPs(1Ommol)2 U L ；RNA 模板11 U L ;
将上述试剂或酶混匀后置PCR仪上，于42°C下反应60min，95°C下反应5min进行反转录，反应产物直接用于PCR或于4°C下保存备用。扩增HA基因(基因登录号登录号为EU004444. I)部分核苷酸序列。NA基因(基因登录号登录号为EU004442. I)部分核苷酸序列的引物对的核苷酸序列如下扩增HA 基因上游引物 p 15 ’ -AGCAAAAGCAGGGG-3，，下游引物 P25，-AGTAGAAACAAGGGTGTTTT-3 ’ ；扩增片段大小为1778bp。扩增NA 基因上游引物 p 15 ’ -AGCAAAAGCAGGAGT-3 ’，下游引物 P25，-AGTAGAAACAAGGAGTTTTTT-3 ’ ；扩增片段大小为1462bp左右。PCR反应体系在25 ii L PCR体系中(依次加入以下组分):Trans-Taq 聚合酶(2U) 0. 5 U L ；IOXBuffer2. 5 U L ；dNTP (2mmol)2 U L ；上游引物IiiL;下游引物IiiL;cDNA3 u L ;ddH2016 u L ;PCR 反应参数95°C 5min ；94°C 30s，55°C 30s, 72 °C 3min，30 个循环；72°C 延伸IOmin0 HA、NA基因的的扩增结果分别见(图3a，图3b)，将PCR产物纯化后连接pMD18_T载体(载体图谱见图4)，选取阳性病料克隆HA和NA送上海生工生物工程有限公司测序(HA基因序列见图5a，NA基因序列见图5b)，经过比对确定本发明的分离株为猪流感病毒(swineinfluenza virus) HlNl亚型。申请人将这毒株命名为猪流感病毒HlNl SIV TJ，于2011年3月25日送交湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，其保藏号为CCTCC NO V201107o2 HlNl SIV TJ 病毒株特性(I)血凝抑制试验按“中华人民共和国兽药典”第三部(中国兽药典委员会编，中国农业出版社，2005版，以下简称“中国兽药典”)HI试验方法配制4单位HlNl SIV TJ株病毒液，然后用四种阳性血清进行交叉试验。该病毒凝集红细胞的特性能被流感Hl阳性参考血清特异性中和，不能被H3、H9、ND阳性参考血清中和。HlNl SIV TJ株第I代HA效价为51og2,传至第2代HA为81og2。
(2)回归试验将HlNl SIV TJ株病毒用灭菌生理盐水稀释至2. Oml含IO6EID5tl病毒，以气管途径对28日龄的仔猪进行攻毒，每头接种2. 0ml。逐日观测猪只的食欲、精神状态，是否有流感样症状，并每日测其体温，采集攻毒猪鼻拭子，按常规方法进行病毒分离。将病毒接种仔猪后12h时由4头猪开始分别出现包括流鼻涕，咳嗽、厌食、精神萎靡、不愿走动，7天后，猪只症状逐渐消失，趋于康复。在观察的7天里，有4头出现过发烧的现象，鼻拭子的病毒分离结果显示5头猪均能分离到病毒。(3)毒种传代试验将经过鸡胚有限稀释克隆连续传代得到的，具有稳定血凝效价的HlNl SIV TJ病毒液作为原始种子液，以原始种子液HlNl SIV TJ (FO)进行传代，第一代为Fl依次传至F8代，取传代毒种第2代(F2)、第4代(F4)、第6代(F6)、第8代(F8)用I %的鸡红细胞进行病毒血凝滴度测定。其HA效价彡81og2。
(4)纯净性试验I)无菌检验将上述步骤(3)得到的Fl F8代毒种分别按照“中国兽药典”规定的方法进行，利用硫乙酸盐培养基(简称T.G，参见中国兽药典第三部)、酪胨琼脂斜面(简称G. A参见中国兽药典第三部)和葡萄糖蛋白胨汤(简称G. P，参见中国兽药典第三部)进行无菌检验。2)支原体检验将HlNl SIV TJ株的Fl F8代毒种分别接种改良Frey氏培养基(参见中国兽药典第三部)，按“中国兽药典”规定方法进行检验。3)外源病毒检测将HlNl SIV TJ株Fl F8代毒种与猪流感病毒HlNl SIV TJ株高免血清以体积比4 I进行中和，取中和后的病毒液按现行中国兽药典方法进行外源病毒检测。鸡胚检查法选9日龄的SPF鸡胚20个，分成2组，第一组10枚鸡胚，经尿囊腔接种0. 2ml被中和后的病毒，第二组10枚鸡胚，经绒毛尿囊膜接种0. 2ml被中和后的病毒。37°C培养7日未发现鸡胚死亡，鸡胚发育正常，绒毛尿囊膜无病变，取鸡胚尿囊液HA检验均为阴性。应用分子生物学检查法通PCR或者RT-PCR的方法检测本发明的HlNl SIV TJ株Fl F8代毒种中是否存在牛病毒性腹泻病毒(BVDV Oregon C24V株，购自中国兽医药监察所)、伪狂犬病毒(龙晓婷等，伪狂犬病毒在潜伏感染猪体内的组织分布，畜牧兽医学报，2008年，第39卷，第5期645-651)、猪细小病毒(吕建强等，猪细小病毒_伪狂犬病毒二联油乳剂灭活疫苗的研制，中国兽医杂志，2005年，第41卷，第6期17-20)、猪瘟病毒(郭东春等，猪瘟病毒非结构蛋白NS2基因不同片段的克隆及在原核系统中的高效表达，中国预防兽医学报，2006年，第28卷，第I期6-9)、猪圆环病毒的污染(宋云峰等，猪2型圆环病毒Cap蛋白在伪狂犬病病毒中的表达，中国兽医学报，2007年，第27卷，第2期155-158)。结果显示Fl F8代毒种中并没有这些病毒的污染。结果表明HlNl SIV TJ株Fl F8代毒种无细菌、支原体、外源病毒污染。结果见表1，表明本发明所涉及的病毒是纯净的。(5)红细胞凝集试验按“中国兽药典”规定方法进行检验，HA效价为8 91og2。结果见表I。(6) HlNl SIV TJ病毒含量测定将HlNl SIV TJ株Fl F8代毒种用灭菌生理盐水作10倍系列稀释后，取10_4、10_5、10' 10' 10' 10_9、6个稀释度，每个稀释度经尿囊腔分别接种9日龄SPF鸡胚各4枚，每胚0. 2ml，置相对湿度60 65 %，温度33 35 °C继续孵育。定时照胚，弃去24小时内死亡鸡胚，24小时后死胚随时收获，至72小时无论死胚活胚均逐个收获鸡胚尿囊液，分别测定红细胞凝集(HA)效价> 41og2判定为感染,按照Reed-Muench法计算EID500结果(见表I)每0. 2ml猪流感HlNl亚型病毒含量为^ IO6.5EID500试验结果见表I。表I HlNl SIV TJ株Fl F8代毒种纯净、HA效价及病毒含量检测结果
毒种代次无菌检验支原体检验外源病毒HA病毒含量
Fl---81og2IO'744
F2---81og2IO'706
F3---91og2IO'7 50
F4--- . 91og2IO"750
F5---91og2IO'704
F6---81og2IO'717
F7---91og2IO'744
F8---91og2IO'704说明表I中的HA为血凝素缩写。(7)免疫原性试验将F4代毒种用甲醛溶液灭活，按水相油相I : 1.5(V V)的比例制成油乳剂灭活疫苗后，颈部肌肉注射25 30日龄猪流感病毒HlNl血凝抑制抗体阴性(HI ( 31og2)仔猪5头，每头注射剂量为2ml。免疫后28日，连同非免疫对照猪5头，采集血清进行HI效价测定并用HlNl SIV TJ株进行气管内接种，每头猪接种2ml (含IO6 tlEID5tl)，观察10日。
·
发病判定标准出现上呼吸道症状攻毒后I 3日出现咳嗽、流鼻涕、鼻炎、呼吸困难、精神沉郁等流感症状；病毒分离阳性攻毒后第3天采集所有攻毒猪的鼻腔棉拭子，每份拭子样品接种9日龄易感鸡胚各5枚，每份接种样品中有一枚鸡胚液HA效价大于或等于41og2，即判为病毒分尚阳性。出现肺脏病理变化攻毒后第10天剖杀所有攻毒仔猪，逐头观察肺脏变化，肺脏出现斑点状或斑块状实变、肺出血等病理变化。以上3项出现任意2项者，即判定为发病。凡免疫组至少4头获得免疫保护，攻毒对照组至少4头发病的，说明本发明制备疫苗具有良好的免疫效力。
攻毒试验结果见表2所述。表2 HlNl SIV TJ F4代毒种免疫原性检测结果
权利要求
1.一种分离的猪流感HlNl亚型灭活疫苗株，其特征在于该疫苗株是HlNl亚型猪流感病毒(swine influenza virus) HlHl SIV TJ，保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，其保藏号为CCTCC NO V201107o
2.由权利要求I所述的疫苗株制备的猪流感HlNl亚型病毒灭活疫苗。
3.权利要求I所述的疫苗株在制备猪流感HlNl亚型病毒灭活疫苗中的应用。
全文摘要
本发明属于动物病毒学技术领域，具体涉及一种分离的猪流感H1N1亚型灭活疫苗株，其制备方法与应用。所述的疫苗株是H1N1亚型猪流感病毒(swine influenza virus)H1H1 SIVTJ，该病毒株保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，其保藏号为CCTCC NOV201107。本发明制备的灭活疫苗经试验证明具有良好的安全性，免疫保护效果达到80％以上。
文档编号C12N7/00GK102747045SQ20111009788
公开日2012年10月24日 申请日期2011年4月19日 优先权日2011年4月19日
发明者周红波, 张安定, 徐高原, 杨影, 郭学波, 金梅林, 陈焕春, 陈章表 申请人:华中农业大学, 武汉科前动物生物制品有限责任公司