原核来源的泛素样分子的应用的制作方法

文档序号:396143阅读:275来源:国知局
专利名称:原核来源的泛素样分子的应用的制作方法
技术领域
本发明属于生物工程领域,特别涉及重组蛋白的异源表达。
背景技术
通过异源基因在宿主细胞,包括细菌、酵母菌、哺乳动物细胞以及昆虫细胞等中进行表达,是目前生产蛋白和/或多肽产品最为常用的方法。使用异源表达系统获得具有生物学活性的均一蛋白,在功能基因组学的研究中也广泛应用。大肠杆菌等原核系统由于菌体细胞简单,表达蛋白成本低廉,得到了更广泛的应用。然而,不同的异源基因,在同样的宿主细胞,尽管使用相同的表达载体,获得同样的转录和翻译信号,但重组蛋白表达水平可以有很大差别。某些重组蛋白在宿主细胞中不能高效表达有很多原因,包括宿主细胞的密码子偏好引起异源基因转录和翻译水平低下;重组蛋白由于自身不稳定性,易于被宿主蛋白酶切降解;错误折叠的重组蛋白对宿主细胞 酶切降解的易感性提高等等。为提高重组蛋白的表达水平,可以采取一些策略。例如,在蛋白酶缺失的大肠杆菌菌株中进行表达,以增加重组蛋白的稳定性(Gottesman et al. J Bacteriol 1978. 133 844-51);将宿主蛋白片段与目标重组多肽/蛋白融合,也可以增加外源蛋白在宿主细胞中的稳定性(Itakura et al.,Science, 1977. 198 1056-63 ;Shen, Proc Natl Acad SciUSA, 1984. 81 :4627-31);在原核宿主细胞,将分泌前导序列融合至重组蛋白,可以促使基因产物在细胞周质的累积或外排分泌,提高正确折叠的可溶性蛋白的复性,可能提高蛋白产量(Nilsson et al. ,EMBO J, 1985. 4 :1075-80 ;Abrahmsen et al. ,Nucleic Acids Res,1986. 14 :7487-500)。这些策略对某些蛋白来说有效,但对许多其它蛋白却不一定成功。因此,存在多种基因融合系统,使用不同的融合伴侣与异源蛋白连接。常见的原核来源的融合伴侣包括谷胱甘肽硫转移酶GST(Smith,Methods Enzymol, 2000. 326 :254-70),硫氧还原蛋白 TRX (Hammarstrom et al.,Protein Science, 2002. 11 :313-321),以及麦芽糖结合蛋白 MBP (Sachdev et al. , Methods Enzymol, 2000. 326 :312-21)等。真核来源的泛素Ubquitin和小泛素样分子Sumo也是常见的融合伴侣。泛素是一种在所有真核细胞中广泛存在,序列结构高度保守的低分子量蛋白质,能够与靶蛋白形成共价结合,是蛋白翻译后修饰的一个重要方式。同时,真核细胞中还存在一些与泛素结构类似的蛋白质,称为泛素样蛋白(UBLs) (Dye et al. Annu Rev BiophysBiomol Struct. 2007 ;36 :131-50.)。该家族成员具有两个共同的结构特征,P -手握样折叠(0-grasp fold)结构域,和含有双甘氨酸残基的羧基末端柔性结构。他们对祀蛋白的化学修饰方式与泛素相同,既羧基末端的甘氨酸残基与靶蛋白赖氨酸残基侧链氨基形成异肽键连接,但可以产生与泛素化修饰不同的生物效应。已知的UBLs包括SUM01/2/3,ISG15,FAT10, ATG8/12, NEDD8, UFMl, URMl 等。泛素化一个最主要的作用就是将革巴蛋白传递给26S蛋白酶体进行降解(Welchmanet al. Nat Rev Mol Cell Biol. 2005 ;6 :599-609)。另一方面,靶蛋白被 Sumo 化后并不会引起蛋白的降解,而是直接或问接改变蛋白在细胞内的定位。尽管他们在真核细胞对靶蛋白的作用不同,但在原核细胞作为融合伴侣表达系统,他们都可以提高目的重组蛋白的稳定性。(Baker et al. J Biol Chem. 1994 ;269 :25381-6, Butt et al. Protein ExprPurif. 2005 ;43 :1_9.)泛素及Sumo与不表达或低表达蛋白的N-末端进行融合,可以显著提高在真核细胞以及原核细胞内的表达水平。美国专利7820384也把其它真核来源的泛素样分子包括RUB、HUB、APG8、APG12、URMl和ISG15作为融合伴侣,作为提高宿主细胞中目的蛋白表达水平的方法。尽管通常认为原核细胞不存在泛素化修饰系统,但从蛋白高级结构、生化反应等分析发现,原核细胞中广泛存在的硫转运系统,与真核泛素化修饰系统有进化意义上的关联(Rudolph et al. Nat Struct Biol. 2001;8 42-6,Wang et al. Nat Struct Biol. 2001 ;8 :47-51, Xu et al. Proc Natl Acad Sci U S A. 2006 ;103 :11625-30.)。细菌在钥蝶呤molybdopterin和硫胺素thiamine的合成途径中,需要硫原子的掺入,硫原子分别由硫转运分子MoaD和ThiS提供。硫转运分子ThiS和MoaD也含有P手握样折叠结构域及羧基 末端双甘氨酸残基,与泛素,特别是URMl有一定的序列同源性。2008 年,Science 杂志首次报道(Pearce et al. Science. 2008 ;322 :1104-7. ) 了结核菌属发现类泛素化修饰分子Pup,该小蛋白分子与靶蛋白赖氨酸残基侧链氨基形成异肽键连接。Pup修饰可诱导靶蛋白分子被蛋白酶体降解。2010 年,在 Nature 杂志又报道(Humbard et al. Nature. 2010 ;463 54~60) 了古细菌类泛素化修饰分子SAMP1/2。通常认为古细菌是独立于真核系统和原核系统的第三类生命形式。SAMPl and SAMP2含有3手握样折叠结构域及羧基末端双甘氨酸残基,其末端甘氨酸残基可与靶蛋白赖氨酸残基侧链氨基形成异肽键连接,并影响靶蛋白的稳定性。值得注意的是,SAMP1/2在古细菌中分别属于MoaD和ThiS的类似物。然而,目前尚不知道原核细胞中具有泛素样结构的硫转运分子MoaD和ThiS,是否具有泛素化修饰功能,以及他们作为原核来源的泛素样分子,成为融合伴侣表达系统的可行性。

发明内容
本发明涉及原核来源的泛素样分子。这些分子完全或部分具有泛素样结构。他们可以具有泛素样修饰功能。本发明发现,原核细胞广泛存在保守的类泛素化修饰系统。硫转运分子ThiS和MoaD是原始的功能性类泛素分子,他们可对菌体蛋白产生共价修饰(图I)。他们对靶蛋白的化学修饰方式不同=ThiS的靶蛋白共价结合物对还原剂敏感,DTT处理可使其失去大部分共价连接,而MoaD的靶蛋白共价结合物对还原剂不敏感(图2)。本发明发现,具有泛素样结构域的原核硫转运分子MoaD,可作为融合伴侣,显著提高宿主菌中重组蛋白的稳定性和/或表达水平。本发明也发现,具有泛素样结构域的原核硫转运分子ThiS,尽管会促进不稳定蛋白在细菌体内的降解,但可作为融合伴侣,显著提高宿主菌中某些重组蛋白的表达水平。本发明提供了一个用于表达融合多肽的方法,该融合多肽含有原核硫转运分子MoaD或其结构上的类似物、片段或衍生物,同时还含有一个目的蛋白/多肽。
本发明提供了另一个用于表达融合多肽的方法,该融合多肽含有原核硫转运分子ThiS或其结构上的类似物、片段或衍生物,同时还含有一个目的蛋白/多肽。本文使用的“多肽”和“蛋白”为同义词,代表含有两个或两个以上氨基酸残基的序列。本文所述的这些泛素样结构小分子的类似物或衍生物,代表这些蛋白分子,比较真核来源的泛素样分子,与原核来源的泛素样分子具有更高同源性的序列结构。所述的这些泛素样结构小分子的片段,是含有部分泛素样结构域的分子序列,如氨基半分子序列或羧基半分子序列。融合蛋白可以含有信号肽。这可使融合多肽定位于细胞内的一个特定区域或分泌出细胞外。融合多肽还可以含有亲和纯化标签。亲和纯化标签位于或接近融合蛋白的末端。例如,N-末端的n-His标签,n为4,5,6,7,8,9,或10。亲和标签可以提供一种固定融合多 肽的方式,例如在纯化过程中在亲和基质上的固定。宿主细胞可以是细菌(如大肠杆菌),也可以是其它种属的宿主细胞,包括真核细胞。融合多肽中的目的蛋白/多肽可以是人源蛋白或其它种属来源的蛋白。通过融合多肽形式的表达,可以获得大量的目的蛋白。为实施本发明提供的上述方法,以提高宿主细胞目的蛋白表达水平,需首先获得编码原核来源的泛素样分子,如硫转运分子ThiS或MoaD的基因克隆。ThiS和MoaD在各种原核细胞中广泛存在,且高度保守。由于原核细胞基因组没有内含子,可以按照已知的全基因序列或相应多肽序列,用PCR直接获得DNA克隆。DNA克隆也可通过基因组DNA文库筛选的方法,或人工合成的方法获得。人工合成的基因序列可以与天然DNA序列相同,也可以按照其氨基酸序列,用公知的设计方法合成不同的简并编码。按公知的方法,将编码原核来源的泛素样分子,如硫转运分子ThiS或MoaD的基因或其片段连接到编码目的蛋白的核苷酸序列上,即构建出编码一个融合蛋白的核酸序列。ThiS或MoaD的基因通常位于编码目的蛋白基因的5’端。ThiS或MoaD的基因与编码目的蛋白基因之间可含有一段基因序列,编码合适化学切割或蛋白酶切割的氨基酸序列。将编码融合蛋白的基因序列,连接到表达载体中,是分子生物学领域公知的方法。各种商品化的原核表达载体,可提供选择。如PQE30和pQE80L(Qiagen), pET系列载体(Novogen),可生成带His_6(六组氨酸)标签的多肽融合目的蛋白。将构建的表达载体转入合适的宿主细胞,经过诱导获得目的蛋白的表达,是生物工程领域公知的方法。表达的宿主菌经常规的破碎方法,如冻融法、超声破碎法、其它机械或化学破碎方法,收取含有可溶性表达产物的上清液,或沉淀的包含体表达产物。优选的方案中,产物可通过标签多肽的亲和层析技术,如His-6特异性的金属亲和层析方法,纯化获得。融合蛋白中,作为融合伴侣的编码原核来源的泛素样分子,如硫转运分子ThiS或MoaD,可以用合适的化学切割或蛋白酶切割去除。本发明提供的融合表达方法,能够显著提高一些目的蛋白的表达水平。例如,对一些自身稳定性差的目的蛋白,MoaD融合可以增加其体内稳定性,因而促进其表达;ThiS融合对一些小分子多肽的表达,有明显的稳定和促进作用。本发明的另一个优点,是原核来源的泛素样分子,通常比真核来源的泛素样分子更小,因此融合蛋白产物中目的蛋白的占比提闻,有利于提闻目的蛋白的广量。


图I. MoaD、ThiS在大肠杆菌表达时形成蛋白共价结合物。MoaD 和 ThiS 的表达载体 MoaD/pET28a 和 ThiS/pET28a 在大肠杆菌 BL21 (DE3)PLysS中经IPTG诱导表达。未诱导(-)和诱导(+)的全菌裂解液,以及经Ni+亲和层析纯化的蛋白样品经SDS-PAGE电泳分离(A),箭头所指位置为目的蛋白条带位置。聚组氨酸抗体免疫印迹(B)检测可见除MoaD和ThiS自身表达外,还在全菌裂解液或纯化样品中形成许多高分子量的蛋白共价结合物。图2.还原剂DTT对ThiS、MoaD蛋白与菌体蛋白连接的影响

ThiS、MoaD表达的全菌样品以及蛋白纯化样品经50mM还原剂DTT处理后电泳分离,经聚组氨酸抗体免疫印迹检测,MoaD的蛋白共价结合物未受影响,而ThiS的多数蛋白共价结合物消失。图3.小鼠核糖核酸酶抑制剂mRI与ThiS或MoaD融合表达改变其体内稳定性。泛素及Sumo与小鼠核糖核酸酶抑制剂mRI的融合表达载体Ub_mRI/pVI及Sumo-mRI/pVI,和 MoaD 及 ThiS 与 mRI 的融合表达载体 MoaD-mRI/pVI 及 ThiS-mRI/pVI,在TGl及BL21(DE3)pLysS菌中经IPTG诱导表达,未诱导(-)和诱导(+)的全菌裂解液,以及全菌裂解的上清(丨)及沉淀(丨)经SDS-PAGE电泳(A1、B1、C1、D1)以及聚组氨酸抗体免疫印迹检测(A2、B2、C2、D2)。箭头所指位置为预期目的蛋白条带位置。Ub-mRI和Sumo-mRI表达产物可见许多低分子量降解条带;MoaD-mRI基本不含有降解产物,而ThiS_mRI表达后仅含有微量完整产物,而以低分子量降解条带为主。图4.融合伴侣ThiS及小鼠核糖核酸酶抑制剂mRI片段化对融合产物稳定性的影响。A =ThiS氨基半ThN,羧基半ThC片段,与mRI的融合表达载体ThN_mRI/pET28a和ThC-mRI/pVI在大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中,未诱导(-)和经IPTG诱导(+)的全菌裂解液经SDS-PAGE电泳(Al)以及聚组氨酸抗体免疫印迹检测(A2)。ThiS氨基半或羧基半片段融合产物的降解明显低于ThiS融合产生的降解。B :ThiS或MoaD融合表达的mRI羧基截短变异体AmRI表达载体MoaD-A mRI/pVI及1^5-八!!11 1/^1,在大肠杆菌161和乩21(0£3) 1^85中,未诱导(-)和经IPTG诱导(+)的全菌裂解液经SDS-PAGE电泳(BI)以及聚组氨酸抗体免疫印迹检测(B2)。ThiS-AmRI融合产物的降解明显低于mRI全蛋白与ThiS融合产生的降解。三角所指位置为预期目的蛋白条带位置。图5. ThiS融合促进人胰岛素A链的表达。ThiS及泛素融合的人胰岛素A链表达载体ThiS_A/pET28a和Ub_A/pET28a在BL21(DE3)pLysS菌中,未诱导(-)和经IPTG诱导(+)的全菌裂解液,以及全菌裂解的上清(t )及沉淀(丨)样品,经SDS-PAGE电泳(A)以及聚组氨酸抗体免疫印迹检测(B)。ThiS融合产物的产量明显高于泛素融合产物。箭头所指位置为预期目的蛋白条带位置。图6. ThiS融合促进人胰岛素B链的表达。
ThiS及泛素融合的人胰岛素B链表达载体ThiS_B/pET28a和Ub_B/pET28a在BL21(DE3)pLysS菌中,诱导表达,未诱导(-)和经IPTG诱导(+)的全菌裂解液,以及全菌裂解的上清(丨)及沉淀(丨)样品,经SDS-PAGE电泳(A)以及聚组氨酸抗体免疫印迹检测(B)。ThiS融合产物的产量明显高于泛素融合产物。图7. ThiS片段化融合对人胰岛素A链表达的影响。ThiS氨基半ThN,羧基半ThC片段,和泛素氨基半UbN与人胰岛素A链融合表达载体 ThN-A/pET28a、ThC-A/pET28a 和 UbN_A/pET28a 在 BL21 (DE3) pLysS 菌中,经 IPTG 诱导后的全菌裂解液,以及全菌裂解的上清(t )及沉淀(I )样品,经SDS-PAGE电泳(A)以及聚组氨酸抗体免疫印迹检测(B)。几种融合产物的产量基本相当。三角所指位置为预期目的蛋白条带位置。图8. ThiS片段化融合对人胰岛素B链表达的影响。
ThiS氨基半ThN,羧基半ThC片段,和泛素氨基半UbN与人胰岛素B链融合表达载体 ThN-B/pET28a、ThC-B/pET28a 和 UbN_B/pET28a 在 BL21 (DE3) pLysS 菌中,经 IPTG 诱导后的全菌裂解液,以及全菌裂解的上清(t )及沉淀(I )样品,经SDS-PAGE电泳(A)以及聚组氨酸抗体免疫印迹检测(B)。除ThC-B表达较低外,融合产物的产量基本相当。三角所指位置为目的蛋白条带位置。
具体实施例方式实验方法I.基因克隆与表达载体构建MoaD和ThiS基因是从大肠杆菌TGl基因组DNA中PCR扩增获得。人泛素cDNA是依照其蛋白序列,按照大肠杆菌的密码偏好,通过寡核苷酸片段合成并PCR扩增获得。人Sumol cDNA是通过人乳腺癌MCF-7反转录产物PCR扩增获得。小鼠核糖核酸酶抑制剂mRI (含456个氨基酸残基)的cDNA(mRNH)如文献所述(葛莹,等.中国生物工程杂志2010,30 17-23);其PCR自然突变产物AmRI在340位密码子产生突变,编码蛋白在此处中止翻译,因此产物为羧基端截短的变异体。人胰岛素A链和B链编码基因均通过寡核苷酸片段合成并PCR扩增获得。通过PCR扩增获得编码ThiS氨基半(含50%氨基酸残基)ThN,羧基半(含50%氨基酸残基)ThC的基因片段,和泛素氨基半(含50%氨基酸残基)UbN的基因片段。基因融合序列产物通过酶切后连接直接获得,或连接后PCR扩增获得。上述基因及其融合片段,分别插入表达载体pQE80L (Qiagen),pET28a(Invitrogen)和pVI载体(威格拉斯生物技术有限公司)。其表达产物的5'端均融合有编码包含聚组氨酸的额外载体序列。所有载体的目的基因片段均经核酸序列测定验证其正确性。2.蛋白的诱导表达表达载体的质粒DNA分别转化TGl和BL21 (DE3) pLysS感受态细胞。从LB固体培养基上挑取含有目的基因的大肠杆菌菌落,接种至3ml LB (含有相应抗生素)培养液中,37°C振摇活化16h后,转接于3ml或大体积LB培养液中,振荡培养至浓度0D600测量值为0.3-0. 8,使用0. I-ImM IPTG诱导表达目的蛋白,4h_16h后停止培养。7000rpm离心5min收集菌体。经诱导表达的宿主菌,离心收取菌体,重悬于含I %Triton-XlOO的PBS中。经冻融和超声破碎,上清为可溶性蛋白,沉淀为不溶性蛋白部分。3.蛋白电泳与定量样品进行SDS-PAGE,蛋白可被考马斯亮蓝染色。考马斯亮蓝染色的凝胶使用凝胶扫描显像密度计扫描后,融合蛋白相应的条带像素密度可以直接获得。分别用5 yl,10 yl,20ul浓度为0. 2mg/ml牛血清白蛋白(BSA)作为标准品对照,依据BSA标准曲线计算目的
蛋白含量。4.免疫印迹检测SDS-PAGE电泳结束后,将蛋白经电转(100mA,Ih,冰浴)至NC膜上,丽春红染色观察转膜情况。电转后的NC膜用含5%脱脂奶粉的PBST室温封闭非特异性结合位点2h。然后用PBST洗膜3次。将膜与稀释的小鼠抗His-标签单克隆抗体(I 2000)于4°C孵育过夜。 然后PBST洗膜3次,15min/次,将膜转入稀释的辣根酶标记的山羊抗小鼠IgG (I 5000),室温孵育I. 5h。然后PBST洗膜3次。最后ECL显影,拍照。5.质谱分析蛋白样品经过S印hadex G_10离心柱脱盐,或直接稀释得到的样品,与质谱基质FA I I混合点样。经基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS) (MALDI-T0F/TOF Analyzer 4800 plus, Applied Biosystem)对样品蛋白进行定性分析。实施例I.融合伴侣ThiS或MoaD对小鼠核糖核酸酶抑制剂mRI表达的影响。为观察ThiS和MoaD的融合伴侣作用,并与泛素及Sumo进行比较,构建了泛素及Sumo与小鼠核糖核酸酶抑制剂mRI的融合表达载体Ub_mRI/pVI及Sumo-mRI/pVI,和MoaD及ThiS与mRI的融合表达载体MoaD-mRI/pVI及ThiS-mRI/pVI。其融合表达产物均含有氨基端聚组氨酸标签。mRI是一个易于发生体内降解的蛋白质(葛莹,等.中国生物工程杂志2010,30 :17-23),便于观察融合伴侣的效应。在TGl及BL21 (DE3) pLysS菌中经IPTG诱导表达,Ub-mRI和Sumo-mRI除主要含有完整的融合表达产物外,均可见许多低分子量降解条带;在Lon蛋白酶缺失的BL21 (DE3)pLysS菌中,产物降解有所减轻(图3A-B)。MoaDiRI在两个菌株的表达未见降解产物。ThiS-mRI表达后仅含有微量完整产物,而以低分子量降解产物为主(图3C-D)。进一步观察了 ThiS氨基半ThN,羧基半ThC片段,与mRI的融合表达。构建的载体ThN-mRI/pET28a和ThC-mRI/pVI,在大肠杆菌BL21 (DE3) pLysS中诱导表达,其融合产物的降解明显低于ThiS全分子融合产生的降解(图4A)。而MoaD或ThiS与mRI羧基截短变异体AmRI融合时,表达载体MoaD-A mRI/pVI在大肠杆菌TGl和BL21(DE3)pLysS中的表达产物仍无明显降解;ThiS_ AmRI/PVI的表达产物的降解,则明显低于mRI全蛋白与ThiS融合产生的降解(图4B)。说明目的蛋白的自身特性,决定其ThiS融合产物的体内可降解性。实施例2.融合伴侣ThiS与人胰岛素A链的融合表达。人胰岛素A链是含有21个氨基酸残基的小分子多肽,需要以融合蛋白形式进行异源表达。构建了 ThiS和泛素融合的A链蛋白表达载体ThiS-A/pET28a和Ub_A/pET28a,以促进人胰岛素A链表达并比较ThiS和泛素的融合伴侣作用。ThiS-A和Ub-A融合蛋白的理论计算分子量分别为13438和14561。在BL21 (DE3)pLysS菌IPTG诱导后,二者均产生预期大小的蛋白条带,无明显降解产物。但ThiS融合产物的产量明显高于泛素融合产物(图6)。实施例3.融合伴侣ThiS与人胰岛素B链的融合表达。人胰岛素B链是含有30个氨基酸残基的小分子多肽,也需要以融合蛋白形式进行异源表达。构建了 ThiS和泛素融合的B链蛋白表达载体ThiS-B/pET28a和Ub_B/pET28a,以促进人胰岛素B链表达并比较ThiS和泛素的融合伴侣作用。ThiS-B和Ub-B融合蛋白的理论计算分子量分别为14484和15607。在BL21 (DE3) pLysS菌IPTG诱导后,二者均产生预期大小的蛋白条带,无明显降解产物。但ThiS融合产物的产量明显高于泛素融合产物(图7)。实施例4.融合伴侣ThiS片段与人胰岛素A链的融合表达。泛素片段有时也作为融合表达伴侣(Lehming. Brief Funct GenomicProteomic. 2002 ; I :230-8)。构建了 ThiS氨基半ThN,羧基半ThC片段,和泛素氨基半UbN 与人胰岛素A链融合表达载体ThN-A/pET28a、ThC-A/pET28a和UbN_A/pET28a,他们表达产物的理论计算分子量分别为9814,9816和10268。在BL21 (DE3) pLysS菌IPTG诱导后,他们均产生预期大小的蛋白条带,无明显降解产物。几种融合产物的产量基本相当(图8)。实施例5.融合伴侣ThiS片段与人胰岛素B链的融合表达。构建了 ThiS氨基半ThN,羧基半ThC片段,和泛素氨基半UbN与人胰岛素B链融合表达载体ThN-B/pET28a、ThC-B/pET28a和UbN_B/pET28a,他们表达产物的理论计算分子量分别为 10860,10872 和 11313。在 BL21 (DE3)pLysS 菌 IPTG 诱导后,ThN-B/和 ThC-B 产生预期大小的蛋白条带,UbN-B产物似低于分子量预期(图9)。表达样品经质谱分子量测定验证,ThN-B和ThC-B的分子量符合理论计算,而UbN-B的分子量明显低于理论计算,说明其为降解产物。
权利要求
1.一个在宿主细胞中提高重组目的蛋白表达水平的方法,包括I)将编码一种原核来源的泛素样分子,或其结构上的类似物或衍生物、或其部分片段的核苷酸序列,连接到所述目的蛋白的核苷酸序列上,由此构建出编码一个融合蛋白的核酸序列;2)将该核酸序列连接在合适的表达载体内;3)将含所述核酸序列的表达载体转入所述的宿主细胞,通过所述的融合蛋白中出现所述的原核来源的泛素样分子,或其结构上的类似物或衍生物、或其部分片段,来提高所述的目的蛋白在所述宿主细胞中的表达水平。
2.权利要求I所述原核来源的泛素样分子,是硫转运分子MoaD。
3.权利要求I所述原核来源的泛素样分子,是硫转运分子ThiS。
4.权利要求I所述原核来源的泛素样分子,是大肠杆菌来源。
5.权利要求I所述的宿主细胞包括原核细胞和真核细胞。
6.权利要求5所述原核宿主细胞是大肠杆菌。
全文摘要
原核来源的泛素样分子的应用,技术领域生物工程。本发明公开了一种提高重组目的蛋白表达水平的有效方法。通过将原核来源的泛素样分子,特别是硫转运分子MoaD或ThiS与目的蛋白的重组融合表达,可获得较高水平的目的蛋白产物。
文档编号C12N15/62GK102796752SQ20111013793
公开日2012年11月28日 申请日期2011年5月26日 优先权日2011年5月26日
发明者王楠, 许建, 葛莹 申请人:威志兰斯医学科技(北京)有限公司
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