专利名称：一种用蛋白类荧光探针对细胞进行标记的方法
技术领域：
本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种具有自发荧光的蛋白质分子探针在生物标记方面的应用，这种探针可以在紫外光谱激发下，在细胞体内出现蓝色荧光。
背景技术：
蛋白类荧光蛋白的发展始于1962年科学家下村修在实验中提取美国西海岸近海的水母的体内的水母素时，发现的会发绿色荧光的蛋白质，这是首次发现绿色荧光蛋白(GFP)。随后，于1994年，马丁 沙尔菲将绿色荧光蛋白用在了原核生物(大肠杆菌)和真核生物(线虫)体内，并且发现这些生物体可以发光，由于研究中外源性物质和辅助因子不需要这种荧光，GFP实现了在基因表达和蛋白质定位研究领域的应用，展示了绿色荧光蛋白作为发光的遗传标签的作用，这一技术随后被广泛运用于生理学和医学等领域。钱永健 在下村修与马丁 沙尔菲研究的基础上进一步搞清楚了绿色荧光蛋白的发光机理及发光特性。同时，他改造了绿色荧光蛋白，通过改变其氨基酸排序，制造出了能吸收、发出不同颜色光的荧光蛋白，其中包括蓝色、青色和黄色，并且使它们发出的光更持久、更强烈，这些成就将荧光蛋白的在生物学、遗传学领域里的应用进一步加以扩展。钱永健利用这些发现开发出各种荧光染料，广泛应用于生物和医学实验。使用这些荧光材料作出的最具代表性实验莫过于2007年的“脑虹”。将红、黄、青3种荧光色素嵌入老鼠基因组，随着老鼠胚胎的生长而分裂生长。研究人员随后用来自细菌的重组基因激活这些色素基因。通过在老鼠不同部位或不同发育阶段使用色素基因，他们成功为老鼠的不同细胞涂上不同颜色。他的课题组还研制出一种神奇的荧光液体，这种液体可以注射到患者体内，使患者体内的神经发光，从而让通常不可见的神经现形。研究发现，用肉眼就可以识别出神经与其他组织之间的颜色差异，而且这种差异比利用其他方式产生的差异要大10倍。实验表明，这种液体的荧光效应通常在两个小时后开始消失，且至多持续8个小时，但对受测目标没有明显的副作用。此外，研究人员还发现，只要有血液流通，这种缩氨酸还可以让受损的神经现形。以上是蛋白荧光探针在生物领域里的特异性标记检测研究及应用，由于此类探针属于标记探针，它具有标记探针的所有优势，但同时其无法避免的缺点，如受染料影响细胞易失活、荧光稳定性差等等。正是这些限制了它的长远的研究与应用。在目前生物分析检测领域里，主要有标记检测和无标记检测两个检测大类。标记检测主要是与荧光分子结合实现检测。荧光团，酶，放射性同位素标记可以用来作为分子探针。利用时间荧光分辨手段，可以实现染料标记进行生物分析，这些染料具有相似的激发和发射光谱，但具有不同的荧光弛豫时间，这些标记实验主要是接收灵敏检测限，甚至可以做到单分子水平，但标记的附加实验费时，昂贵，在标记位置的洗脱过程里，容易造成样品材料的损伤，更确切的说，蛋白质的化学标记容易改变样品的表面化学特性并影响到其活性。总之，在研究过程中，标记的过程中会影响分子的生物活性，特别是对含有大量抗原表位的小分子蛋白质或者肽类。
而无标记检测确实可以克服上述问题，分子或粒子的无标记检测是紫外光激发自发荧光团发出荧光实现的，它在生命科学的分子分析中有很大的潜在应用价值，为自然状态下检测重要生物成分提供了一种简单，价廉，快速灵敏的检测方法。标记检测经过科研工作者的不断努力，无标记自发荧光检测在分析化学和生物化学领域里逐渐被人们开始重视。分子的自发荧光信号来自于分子内部的结构，如蛋白质，胶原蛋白，弹力蛋白和辅酶烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)和黄素类等均可以作为生色团。在蛋白质里，三种芳香族氨基酸残基-色氨酸(Trp)，酪氨酸(Tyr)和苯基丙氨酸(Phe)均是其内部发光团。在蛋白质中，氨基酸残基的紫外吸收来源和荧光发射光谱主要取决于其本身的光谱特性。尽管氨基酸吸收系数和量子产率与常用的荧光标记物相比相差很多，而且光学稳定性很差，但蛋白质的资源丰富，可以抵消这些不足，从而使蛋白质的自发荧光的灵敏检测成为可能。从蛋白质中提取的含巯基化合物如半胱氨酸(Cys)，同型半胱氨酸(HCys)，谷胱 甘肽(GSH)等在保持细胞内的生物氧化还原平衡中起到重要作用。由于其荧光特性，越来越受到人们的重视，目前，巯基在生物检测领域里的研究主要集中在检测活体内氧化还原反应中的巯基以及以巯基为活性基团与有机染料结合对细胞进行标记。然而，这些研究均属于标记检测领域，研究比较成熟，成本高，对细胞损伤大的缺点限制了它的进一步发展与研究。在无标记检测领域里，半胱氨酸本身的荧光团-巯基却很少有人研究，主要可能是与巯基的活性太高且较高温度下稳定性差有关，在常温下利用半胱氨酸中巯基的自发荧光实现对活体细胞的标记，将有望成为一种新型自发荧光探针。
发明内容
根据本发明的一个方面，提供了一种用蛋白类荧光探针对细胞进行标记的方法，其特征在于包括配制氨基酸-壳聚糖多肽类接枝共聚物悬液；将配制好的接枝共聚物悬液分散于DMEM培养液中；用乙二胺四乙酸(EDTA)-胰蛋白酶把CHL(中国仓鼠肺成纤维细胞)细胞消化为单细胞悬液；孵育所述CHL细胞；弃掉原液；加入分散有接枝共聚物悬液的所述DMEM培养液；继续培养预定的时间。
图I显示了不同接枝度的接枝共聚物其荧光光谱位置偏移情况。图2显示了紫外照射下在灭菌水中接枝聚合物的荧光现象。图3-5是荧光显微镜下采用紫外激发接枝共聚物与高糖培养液组成的悬液在与中国仓鼠肺成纤维细胞共培养后的细胞内荧光情况。
具体实施例方式本发明的目的提供一种无标记检测蛋白荧光探针，弥补目前细胞标记领域里费时、成本高、细胞损伤大的缺点，提供一种简便、细胞损伤小、生物相容性好的氨基酸-壳聚糖多肽类接枝共聚物，利用其中巯基的自发荧光作为标记细胞的类蛋白荧光探针，这类探针可以对活细胞的细胞质进行标记与检测，在医学诊断里，可以通过信号传导和细胞的迁移来诊断疾病。根据本发明的一个方面，提供了一种用蛋白类荧光探针对细胞进行标记的方法，其特征在于包括配制氨基酸-壳聚糖多肽类接枝共聚物悬液；将配制好的接枝共聚物悬液分散于DMHM培养液中；
用EDTA-胰蛋白酶把CHL(中国仓鼠肺成纤维细胞)细胞消化为单细胞悬液；孵育所述CHL细胞；弃掉原液；加入分散有接枝共聚物悬液的所述DMEM培养液；继续培养预定的时间。根据本发明的更具体的方面，为了实现上述目的，本发明采用以下措施这类蛋白类自发荧光探针主要通过半胱氨酸的巯基的保护、半胱氨酸环内酸酐的合成、半胱氨酸环内酸酐开环聚合与壳聚糖发生接枝共聚反应制备氨基酸-壳聚糖多肽类接枝共聚物粉末-荧光探针，紫外照射约IOmin后将其分散于灭菌水中，利用其特性制备此探针的悬液，并与DMEM培养液混合，与中国仓鼠肺成纤维细胞(CHL)在37°C、5%体积分数的CO2培养箱中共同孵育，荧光探针通过微粒扩散、细胞内吞等方式进入细胞质，实现对细胞的标记目的。一种氨基酸-壳聚糖多肽类接枝共聚物荧光探针标记细胞的方法，其具体实施步骤如下I、配制0. 126mol/mL和I. 031mol/mL的氨基酸-壳聚糖多肽类接枝共聚物悬液。将氨基酸-壳聚糖多肽类接枝共聚物固体粉末紫外照射约IOmin后加入适量灭菌水，并用超声器超声分散，时间为7h，保持超声器每工作20min停歇lOmin。将分散好的接枝共聚物水溶液分散于DMEM高糖培养液中，保存于4°C冰箱中备用；2、将CHL细胞与DMEM培养液培养至培养瓶铺满80%以上时，用体积比为0. 05%的乙二胺四乙酸(EDTA)-胰蛋白酶消化为单细胞悬液，并用计数器计数后，将其配为I. 0 X IO4个/mL、2. 5 X IO4个/mL、4. 5 X IO4个/mL的细胞悬液，分装至底部铺有盖玻片的六孔板，在37°C、5%体积分数的CO2培养箱中孵育，使细胞正常贴壁生长，得到实验所需的细胞生长状态；3、待上一步的CHL细胞继续孵育24h后，弃掉原液，加入第一步配好的溶有荧光探针(接枝共聚物)的DMEM培养液，继续培养6-48h。4、选择预设时间点，每隔6h、12h、24h取出六孔板，弃掉原液，用PBS (磷酸缓冲液)冲洗3次，约5min/次，用紫外光照射CHL细胞，在荧光显微镜下观察荧光探针对CHL细胞标记的情况。
所述的荧光探针通过半胱氨酸的巯基的保护、半胱氨酸环内酸酐的合成、半胱氨酸环内酸酐开环聚合与壳聚糖发生接枝共聚反应制备而成。所述的细胞为中国仓鼠肺成纤维细胞。本发明与现有荧光探针标记技术相比有以下优点和作用本发明所用的荧光探针对细胞标记效果良好，操作简单易行，与细胞的生物相容性好；无需引入其他有机染料，对细胞损伤度低，且几乎在48h内无毒。细胞被标记后稳定性好，这类探针可以对活细胞的细胞质进行标记与检测，在医学诊断里，可以通过信号传导和细胞的迁移来诊断疾病。I、提供自发荧光探针的应用途径。本发明的技术方案为I、自发荧光探针的结构本发明的自发荧光探针的结构式为
权利要求
1.一种用蛋白类荧光探针对细胞进行标记的方法，其特征在于包括 配制氨基酸-壳聚糖多肽类接枝共聚物悬液； 将配制好的接枝共聚物悬液分散于DMEM培养液中； 用乙二胺四乙酸-胰蛋白酶把中国仓鼠肺成纤维细胞细胞消化为单细胞悬液； 孵育所述中国仓鼠肺成纤维细胞细胞； 弃掉原液； 加入分散有接枝共聚物悬液的所述DMEM培养液； 继续培养预定的时间。
2.根据权利要求I的方法，其特征在于进一步包括 在所述继续培养预定的时间的步骤之后，用紫外光激发中国仓鼠肺成纤维细胞细胞。
3.根据权利要求I的方法，其特征在于 所述配制氨基酸-壳聚糖多肽类接枝共聚物悬液的步骤包括 将氨基酸-壳聚糖多肽类接枝共聚物固体粉末紫外照射后加入适量灭菌水， 所述将配制好的接枝共聚物悬液分散于DMEM培养液中的步骤包括 用超声器超声分散， 将分散好的接枝共聚物水溶液分散于DMEM高糖培养液中。
4.根据权利要求3的方法，其特征在于 在所述用超声器超声分散的步骤中，保持超声器每工作一定时间后停歇一个预定时间。
5.根据权利要求I的方法，其特征在于 所述用乙二胺四乙酸-胰蛋白酶把中国仓鼠肺成纤维细胞细胞消化为单细胞悬液的步骤包括 将中国仓鼠肺成纤维细胞细胞与DMEM培养液培养至培养瓶铺满一个预定比例以上时，用乙二胺四乙酸-胰蛋白酶消化为单细胞悬液， 所述孵育所述中国仓鼠肺成纤维细胞细胞的步骤包括 在培养箱中孵育，使细胞正常贴壁生长，得到所需的细胞生长状态。
6.根据权利要求2的方法，其特征在于进一步包括 在所述用紫外光激发中国仓鼠肺成纤维细胞细胞的步骤之前，用磷酸缓冲液冲洗。
7.根据权利要求5的方法，其特征在于 所述乙二胺四乙酸-胰蛋白酶的体积比为O. 25%, 所述在培养箱中孵育的步骤是在37°C、5%体积分数的CO2环境下进行。
全文摘要
本发明提供了一种用蛋白类荧光探针对细胞进行标记的方法，其特征在于包括配制氨基酸-壳聚糖多肽类接枝共聚物悬液；将配制好的接枝共聚物悬液分散于DMEM培养液中；用乙二胺四乙酸(EDTA)-胰蛋白酶把CHL(中国仓鼠肺成纤维细胞)细胞消化为单细胞悬液；孵育所述CHL细胞；弃掉原液；加入分散有接枝共聚物悬液的所述DMEM培养液；继续培养预定的时间。
文档编号C12N5/071GK102796695SQ201110137829
公开日2012年11月28日 申请日期2011年5月25日 优先权日2011年5月25日
发明者相艳, 武素芳, 司江菊 申请人:北京航空航天大学