专利名称：一种重组沃氏菌的天门冬酰胺酶的制备法的制作方法
一种重组沃氏菌的天门冬酰胺酶的制备法本发明涉及生物医药的基因重组领域，具体地说是ー种重组沃氏菌的天门冬酰胺酶的制备法。天门冬酰胺酶是一类能将L-天门冬酰胺(L-asparagine)转化为天门冬氨酸(aspartic acid)的酶；此外该酶还通常具有较低的谷氨酰胺酶的活性(glutaminaseactivity;。 天门冬酰胺酶主要用于治疗急性淋巴细胞白血病(Acute lymphocyticleukemia)等血癌疾病，是急性淋巴细胞白血病治疗中的重要药物。此外对恶性淋巴瘤也有较好的疗效。其主要机理是癌细胞不能产生天门冬酰胺，但正常细胞可以；天门冬酰胺酶能降解天门冬酰胺成天门冬氨酸，从而使癌细胞因缺乏必须的天门冬酰胺而死亡。目前临床上使用的产品大多数是大肠杆菌(E. coli)来源的天门冬酰胺酶，也有采用欧氏菌(Erwinia chrysanthemi)来源的天门冬酰胺酶；这两个品种均已列入中国药典(中国药典二部，2010年)。但沃氏菌的天门冬酰胺酶尚未开发成新药，已有研究表明与其它来源的天门冬酰胺酶相比，该酶底物专ー性更佳，稳定性也较好，并和临床上已有的产品无免疫交叉性，因而具有潜在的临床使用价值。传统的天门冬酰胺酶的制备法多为从菌体中直接提取，但目的酶在菌体中的比例不高，而且该方法涉及有机溶剂的使用，エ艺步骤多，质量控制困难。沃氏菌的天门冬酰胺酶最初也由菌体中直接提取，但该菌为厌氧菌，培养较之需氧菌更为困难，同样也有产率低的缺陷。本发明的目的是利用基因重组的方法获得重组沃氏菌的天门冬酰胺酶。为了实现上述目的，本发明设计ー种重组沃氏菌的天门冬酰胺酶的制备法，其特征在于包括以下步骤a、采用PCR技术从沃氏菌的基因组DNA中扩增出天门冬酰胺酶的全长或部分片段的DNA，该DNA片段的5'和3'端各带有至少ー个特定的限制性内切酶点；b、将上述天门冬酰胺酶的全长或部分片段的DNA用DNA连接酶连接到克隆质粒中；C、利用特定的限制性内切酶从克隆质粒中切割出天门冬酰胺酶的全长或部分片段的DNA，再连接到已用同样的限制性内切酶消化后的原核细胞表达质粒中；d、将上述的含有天门冬酰胺酶的全长或部分片段的DNA的表达质粒转染到大肠杆菌中，在抗生素选择培养基中培养此转染的细菌以扩增含有天门冬酰胺酶的全长或部分片段的DNA的表达质粒，在培养基中加入诱导物诱导重组天门冬酰胺酶的合成；e、收集转染的菌体，离心分离出菌体；破碎细菌，释放重组天门冬酰胺酶；
f、用ニ步柱层析法分离精制重组沃氏菌天门冬酰胺酶；g、用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测鉴定重组沃氏菌天门冬酰胺酶，用考马斯亮蓝染色后可见ー个35kDa的蛋白质条带与计算值一致。所述质粒所含的抗菌素的抗性基因，抗菌素可选为氨苄青霉素或羧苄青霉素或卡那霉素，质粒所含的启动子为T7，T71ac, T71acUV5或其他含T7的杂合启动子。所述ニ步柱层析法包括以下步骤
I)、用阴离子交換柱层析法吸附杂志蛋白，收集不被吸附的重组天门酰胺酶，并进行超滤浓缩；2)、经过上述分离步骤得到的重组天门冬酰胺酶再用疏水色谱层析进行精制。所述制备重组沃氏菌天门冬酰胺酶的表达菌体，包括在合适细菌培养基下的表达菌体的培养，离心收集细胞，接着将细胞重新混悬于含50-150mM Tris, pH7. 5，50_100mMNaCl，O. I-ImM DTT，ImM EDTA 的缓冲液中。所述表达菌体混悬液采用溶菌酶处理，再进行破碎；或直接破碎；破碎方法可以使超声波破碎，French Press压カ破碎或用非离子表面活性剂直接溶解细胞膜，释放出胞内蛋白。所述制备重组沃氏菌天门冬酰胺酶与标签多肽/蛋白结合成融合蛋白，以方便纯化，所述标签多肽/蛋白采用多聚His或GST或Flag或MBP或S tag或Streptag或T7tag。本发明与现有技术相比，其优点在于エ艺步骤少，易控制产品质量且能大量制备。图I为本发明用于扩增沃氏菌天门冬酰胺酶的DNA的PCR引物序列；图2为本发明的沃氏菌天门冬酰胺酶的PCR扩增DNA片段；图3为本发明的表达载体；图4为本发明的含沃氏菌天门冬酰胺酶DNA的表达载体；图5为本发明用SDS-PAGE检测重组沃氏菌天门冬酰胺酶在大肠杆菌中的表达和ニ步柱层析法提纯目的蛋白的结果；图6为本发明的重组沃氏菌天门冬酰胺酶的酶活性；參见图2，I为PCR产物，2为空白，3为无模板的PCR反应物；4为空白，5为DNA标准(箭头所指位置为Ikb的DNA标准条带)。以下结合附图
，对本发明做进ー步说明。实施例一PCR扩增沃氏菌天门冬酰胺酶的DNA如图I所示，用于PCR扩增的引物核苷酸序列如下5， -GGTACCATATGAATGCATGGAAAAAAAC-3>Nde I位点以下划线标出。5’ -GAATTCGTCGACTTAATAGGTGGAGAAGATCT-3，
Sal I位点以下划线标出。如图2所示，PCR扩增反应物设置如下在200 μ I的PCR试管中，加入32. 5 μ I的/Κ,ΙΟμ I的5倍缓冲液，1μ I dNTP(lOmM)，上述引物(10 μ M)各2. 5 μ 1，250ng的沃氏菌基因组DNA，O. 5u的PCR聚合酶。扩增反应进行30个循环，取25 μ I的反应液在O. 9%的琼脂糖上进行电泳，在紫外灯下检测扩增出的约为Ikb的单一条帯。如图2所示，用干净的刀片切取相应的Ikb的DNA片段，用DNA琼脂糖回收试剂盒(上海捷瑞生物工程有限公司)回收目的DNA片段。实施例ニ沃氏菌天门冬酰胺酶的DNA的克隆利用pJETI. 2试剂盒(Fermentas)克隆沃氏菌的天门冬酰胺酶基因。取回收后的沃氏菌天门冬酰胺酶的DNA片段I μ 1，加入2倍反应缓冲10 μ 1，PJETI. 2平端载体50ng，水7 μ 1，T4DNA连接酶I μ I。在室温放置30min，取2 μ I的反应物转化到大肠杆菌中。 挑取转化子细菌，在约5ml的LB培养基(含100 μ g/ml的氨苄青霉素)中37°C培养过夜，提取质粒，用Nde I和Sal I进行酶切，含有lkb DNA插入片段的质粒进行DNA测序。实施例三重组沃氏菌天门冬酰胺酶的表达參见图3和图4，经上述例ニ中验证，确定含有Ikb的沃氏菌天门冬酰胺酶DNA片段的质粒，再用Nde I和Sal I消化(37°C，lhr)，切取Ikb的DNA片段，用DNA琼脂糖回收试剂盒(上海捷瑞生物工程有限公司)提纯目的DNA片段。该提纯后的DNA片段插入到表达质粒PET21的相应的Nde I和Sal I之间，用T4 DNA连接酶连接。连接产物转化到大肠杆菌中。挑取转化子，在含有100 μ g/ml的氨苄青霉素的培养基中培养(37°C )，在0D_达到O. 4-0. 8后，加入ImM IPTG诱导天门冬酰胺酶的表达，继续培养2_4hr。收取培养物，在 6000g 离心 20min，弃上清，沉淀重新悬浮于 50mM Tris, pH 7. 5,50mM NaCl, ImM DTT, ImMEDTA的缓冲液中。实施例四重组沃氏菌天门冬酰胺酶的提纯取上述例三所述的菌体混悬液，用超声波细胞破碎仪破碎，再次离心，取上清液上样于装填有DEAE琼脂糖凝胶树脂的层析柱上，用50mM Tris, pH 7. 5,50mM NaCl的缓冲液洗脱天门冬酰胺酶。收集含有天门冬酰胺酶的洗脱液，用超滤浓縮。浓缩液再用疏水柱层析进一歩精制，用含IM硫酸铵到OM硫酸铵的磷酸盐缓冲液进行梯度洗脱，收集含有天门冬酰胺酶的组份，超滤浓缩，浓缩液经过透析，最終重组天门冬酰胺酶保存于O. IM磷酸缓冲液(pH 8.0)中。如图5所示，自左到右次序为蛋白质标准(自上到下97.4,66. 2、43、31、20kDa)不含外源基因的质粒在大肠杆菌表达后的菌体蛋白(15yg)重组沃氏菌天门冬酰胺酶在大肠杆菌表达后的菌体蛋白(IOyg)可溶性的含重组沃氏菌天门冬酰胺酶的菌体蛋白(10 μ g)经过DEAE琼脂糖凝胶提纯后的重组沃氏菌天门冬酰胺酶(2 μ g)
经过疏水层析提纯后的重组沃氏菌天门冬酰胺酶(2 μ g)重组沃氏菌天门冬酰胺酶的条带在43和31kDa之间。实施例五重组沃氏菌天门冬酰胺酶的酶活性測定如图6所示，天门冬酰胺酶能转化天门冬酰胺为天门冬氨酸和氨气。通过奈氏试剂与氨反应，可通过测定吸光度测定氨的含量以达到測定天门冬酰胺酶活性的目的。取样品适量，用O. IM磷酸盐缓冲液(pH 8. O)配制成浓度约为O. 8 μ g/ml。加入I. 9ml的天门冬酰胺溶液(O. 33% )，在37°C水浴中反应15min ;加入25%三氯こ酸O. 5ml以终止反应。取上述反应液O. 5ml，加水7. Oml和奈氏试剂I. 0ml，在室温放置15min，在450nm 处测定吸光度。
权利要求
1.一种重组沃氏菌的天门冬酰胺酶的制备法，其特征在于包括以下步骤 a、采用PCR技术从沃氏菌的基因组DNA中扩增出天门冬酰胺酶的全长或部分片段的DNA，该DNA片段的5'和3'端各带有至少ー个特定的限制性内切酶点； b、将上述天门冬酰胺酶的全长或部分片段的DNA用DNA连接酶连接到克隆质粒中； C、利用特定的限制性内切酶从克隆质粒中切割出天门冬酰胺酶的全长或部分片段的DNA，再连接到已用同样的限制性内切酶消化后的原核细胞表达质粒中； d、将上述的含有天门冬酰胺酶的全长或部分片段的DNA的表达质粒转染到大肠杆菌中，在抗生素选择培养基中培养此转染的细菌以扩增含有天门冬酰胺酶的全长或部分片段的DNA的表达质粒，在培养基中加入诱导物诱导重组天门冬酰胺酶的合成； e、收集转染的菌体，离心分离出菌体；破碎细菌，释放重组天门冬酰胺酶； f、用ニ步柱层析法分离精制重组沃氏菌天门冬酰胺酶； g、用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测鉴定重组沃氏菌天门冬酰胺酶，用考马斯亮蓝染色后可见ー个35kDa的蛋白质条带与计算值一致。
2.如权利要求I所述的ー种重组沃氏菌的天门冬酰胺酶的制备法，其特征在于所述质粒所含的抗菌素的抗性基因，抗菌素可选为氨苄青霉素或羧苄青霉素或卡那霉素，质粒所含的启动子为T7，T71ac, T71acUV5或其他含T7的杂合启动子。
3.如权利要求I所述的ー种重组沃氏菌的天门冬酰胺酶的制备法，其特征在于所述ニ步柱层析法包括以下步骤 1)、用阴离子交換柱层析法吸附杂志蛋白，收集不被吸附的重组天门酰胺酶，并进行超滤浓缩； 2)、经过上述分离步骤得到的重组天门冬酰胺酶再用疏水色谱层析进行精制。
4.如权利要求I所述的ー种重组沃氏菌的天门冬酰胺酶的制备法，其特征在于所述制备重组沃氏菌天门冬酰胺酶的表达菌体，包括在合适细菌培养基下的表达菌体的培养，离心收集细胞，接着将细胞重新混悬于含50-150mMTris，pH 7. 5,50-100mM NaCl，0. I-ImMDTT, ImM EDTA的缓冲液中。
5.如权利要求I或4所述的ー种重组沃氏菌的天门冬酰胺酶的制备法，其特征在于所述表达菌体混悬液采用溶菌酶处理，再进行破碎；或直接破碎；破碎方法可以使超声波破碎，French Press压カ破碎或用非离子表面活性剂直接溶解细胞膜，释放出胞内蛋白。
6.如权利要求I所述的ー种重组沃氏菌的天门冬酰胺酶的制备法，其特征在于所述制备重组沃氏菌天门冬酰胺酶与标签多肽/蛋白结合成融合蛋白，以方便純化，所述标签多肽/蛋白采用多聚His或GST或Flag或MBP或S tag或Strep tag或T7tag。
全文摘要
本发明涉及生物医药的基因重组领域，具体地说是一种重组沃氏菌的天门冬酰胺酶的制备法；其特征在于包括以下步骤采用PCR技术从沃氏菌的基因组DNA中扩增出天门冬酰胺酶的全长或部分片段的DNA，将上述DNA用DNA连接酶连接到克隆质粒中，从克隆质粒中切割出天门冬酰胺酶的全长或部分片段的DNA，再连接到原核细胞表达质粒中，表达质粒转染到大肠杆菌中，在抗生素选择培养基中培养此转染的细菌以扩增含有天门冬酰胺酶的全长或部分片段的DNA的表达质粒，收集转染的菌体，离心分离出菌体；破碎细菌，释放重组天门冬酰胺酶；用二步柱层析法分离精制重组沃氏菌天门冬酰胺酶；本发明具有工艺步骤少，可控制质量且大量制备的优点。
文档编号C12N15/55GK102851302SQ20111017845
公开日2013年1月2日 申请日期2011年6月29日 优先权日2011年6月29日
发明者范铭琦 申请人:范铭琦