专利名称：三维细胞动态培养反应器的制作方法
技术领域：
本发明属于细胞培养设备或装置技术领域，具体涉及到在二氧化碳环境中使用流动的细胞培养液的培养设备。
背景技术：
传统的细胞培养方法，即二维细胞培养会导致细胞失去其与组织相关的功能，无法准确地反映细胞在体内的生长情况。动物模型和体内试验虽然可以反映细胞生长的真实内环境，但是成本太高、过程复杂，而且受到伦理学方面的制约。在体内环境下，所有的细胞都是在一种三维空间中。三维细胞培养可以重现细胞-细胞和细胞-基质之间的相互作用， 与二维细胞培养相比，更能真实地反映细胞生长的内环境。因此，三维细胞培养可以架起二维细胞培养和动物试验之间的桥梁。三维细胞培养已在细胞生物学方面的研究中得到了应用。在常规的三维细胞接种和培养的方法中，主要采用静态接种和静态培养的方法。 这一方法具有接种率低、接种不均勻，生长情况不均勻等缺点。动态接种和灌流培养在肝细胞的高密度培养中和静态培养相比显示出了其独特的优势，如细胞在支架上的粘附性好、 分散更均勻、细胞存活率更高等。为了实现动态接种和灌流培养方法，目前国内外已研制出一些细胞反应器。目前，临床使用的生物反应器大致分为四种类型中空纤维型、单层平板型、灌注床型、包被悬浮型。这些生物反应器的功能单一，有一些仪器用于细胞的分离或收集，一些仪器用于细胞悬液的配制，一些仪器用于细胞与材料的参杂，一些仪器用于细胞和组织的培养，这些生物反应器的主要缺点是操作复杂性、易于污染。专利号为ZL 031106701. 2、发明名称为《细胞反应器》的发明专利，专利申请号为 200910229109. 1、发明名称为《药物肝毒性评价用多糖复合支架灌流式肝细胞反应器系统》 的发明专利，专利申请号为20091(^^907. 8、发明名称为《一种细胞反应器及包括该反应器的人工肝支持系统》的发明专利，这三种细胞反应器都不能提供细胞生长所需的温度、湿度以及气体条件，必须将细胞反应器置于二氧化碳培养箱中才可以使用，而且细胞反应器和一种细胞反应器及包括该反应器的人工肝支持系统不能实现细胞动态接种、动态培养。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于克服上述生物反应器的缺点，提供一种细胞动态接种、灌流培养、不需要将细胞反应器置于二氧化碳培养箱中的三维细胞动态培养反应器。解决上述技术问题所采用的技术方案是在反应器外壳体内设置有反应器内壳体，反应器外壳体与反应器内壳体保持有间隙，形成水流通道，反应器外壳体的左侧下部设置伸入到反应器内壳体内下部的进气管，反应器内壳体的上端设置安装有出气单向阀门的密封上盖，反应器内壳体的侧壁上设置有出液管，反应器内壳体内的下部设置加工有通气孔的支撑板，支撑板与反应器内壳体内底部之间形成与进气管相联通的气室，支撑板上设置有下防水透气膜，下防水透气膜上部设置有细胞培养支架，细胞培养支架的上表面设置有上防水透气膜，进液管的下端插入到反应器内壳体内穿过细胞培养支架至下防水透气膜的上表面，进液管通过导管与蠕动泵的出口相联通，蠕动泵的进口通过安装在导管上的细胞悬液出液阀门与细胞悬液瓶相联通、通过安装在导管上的细胞培养液出液阀门与细胞培养液瓶相联通、通过安装在导管上的缓冲液阀门与缓冲液瓶相联通，出液管通过安装在导管上的细胞悬液进液阀门与细胞悬液瓶相联通、通过安装在导管上的细胞培养液进液阀门与细胞培养液瓶相联通、通过安装在导管上的废液阀门与废液瓶相联通。本发明的细胞培养支架为多孔细胞培养支架。本发明的多孔细胞培养支架为丝素蛋白/羟基磷灰石/胶原蛋白复合多孔支架、 壳聚糖/羟基磷灰石三维多孔支架、聚乳酸-聚乙醇酸共聚物/羟基磷灰石/胶原蛋白复合多孔支架中的任意一种。本发明采用丝素蛋白/羟基磷灰石/胶原蛋白复合多孔支架制备成细胞培养支架，在二氧化碳环境中，细胞粘附在细胞支架上，细胞培养液在细胞培养支架上循环流动， 不需要将粘附有细胞的细胞培养支架放置在二氧化碳培养箱内进行培养，实现细胞动态接种、细胞动态培养，简化了工艺，减少了设备，缩短了细胞培养时间，降低了细胞培养费用， 本发明可用于贴壁细胞的培养。
图1是本发明一个实施例的结构示意图。图2是人骨肉瘤细胞MG-63在支架上动态培养48小时后放大1500倍的环境扫描电子显微镜图。图3是人骨肉瘤细胞MG-63在支架上动态培养48小时后放大1000倍的环境扫描电子显微镜图。图4是人结肠癌细胞Lovo在支架上动态培养48小时后放大4000倍的环境扫描电子显微镜图。图5是人结肠癌细胞Lovo在支架上动态培养48小时后放大1000倍的环境扫描电子显微镜图。
具体实施例方式下面结合附图和实施例对本发明进一步详细说明，但本发明不限于这些实施例。实施例1在图1中，本实施例的三维细胞动态培养反应器是由反应器外壳体1、反应器内壳体2、进液管3、上防水透气膜4、出液管5、蠕动泵6、缓冲液阀门7、细胞培养液出液阀门8、 细胞悬液出液阀门9、细胞悬液进液阀门10、细胞悬液瓶11、细胞培养液进液阀门12、细胞培养液瓶13、缓冲液瓶14、废液阀门15、废液瓶16、细胞培养支架17、下防水透气膜18、支撑板19、进气管20、密封上盖21、出气单向阀门22联接构成。在反应器外壳体1内安装有反应器内壳体2，反应器外壳体1和反应器内壳体2的形状为圆柱形，反应器外壳体1和反应器内壳体2采用有机玻璃制成，反应器外壳体1与反应器内壳体2保持有间隙，形成水流通道，反应器外壳体1与反应器内壳体2之间左端形成进水口 a、右端形成出水口 b，37°C的循环水从进水口 a进入，流经反应器外壳体1与反应器内壳体2之间的水流通道，从出水口 b流出。反应器外壳体1的左侧下部安装有进气管20， 进气管20插入到反应器外壳体1内，进气管20的内端伸入到反应器内壳体2内的下部。在反应器内壳体2的上端通过螺纹联接安装有密封上盖21，密封上盖21上通过螺纹联接安装有出气单向阀门22。反应器内壳体2的右侧有出液管5，出液管5的外端部为加工有孔的封闭管，出液管5与反应器内壳体2连为一体相联通。反应器内壳体2内的下部安装有支撑板19，支撑板19上加工有通气孔，支撑板19与反应器内壳体2内底部之间保持有距离，形成气室，气室与进气管20相联通，气室内底部装有25°C电阻率为18. 2MQ-cm 的超纯水，超纯水用于提供湿度，无菌的二氧化碳与空气的混合气可进入到气室内，从密封上盖21上的出气单向阀门22流出，二氧化碳与空气的混合气中，二氧化碳与空气的体积比为5 95。支撑板19上放置有下防水透气膜18，下防水透气膜18为市场上销售的商品， 由美国Sigma Technonologies htl. LLC公司销售，下防水透气膜18用于通气和防止下防水透气膜18上的水流下。反应器内壳体2下防水透气膜18上部装有细胞培养支架17，本实施例的细胞培养支架17采用多孔支架，具体采用丝素蛋白/羟基磷灰石/胶原蛋白复合多孔支架，细胞培养支架17用于粘附细胞和容纳细胞培养液，细胞培养液采用(ibico公司生产的DMEM高糖培养液和胎牛血清的混合溶液，在混合溶液中，DMEM细胞培养液与牛血清溶液的体积比为9 1。细胞培养支架17的上表面放置有上防水透气膜4，上防水透气膜 4和下防水透气膜18为相同的商品，上防水透气膜4用于保湿通气。进液管3的下端插入到反应器内壳体2内穿过细胞培养支架17至下防水透气膜18的上表面，进液管3通过导管与蠕动泵6的出口相联通，蠕动泵6的进口通过安装在导管上的细胞悬液出液阀门9与细胞悬液瓶11相联通，细胞悬液瓶11通过安装在导管上的细胞悬液进液阀门10与出液管 5相联通，蠕动泵6可将细胞悬液注入到细胞培养支架17上并循环流动；蠕动泵6的进口通过安装在导管上的细胞培养液出液阀门8与细胞培养液瓶13相联通，细胞培养液瓶13 通过安装在导管上的细胞培养液进液阀门12与出液管5相联通，蠕动泵6可将细胞培养液注入到细胞培养支架17上并循环流动；蠕动泵6的进口通过安装在导管上的缓冲液阀门7 与缓冲液瓶14相联通，蠕动泵6可将磷酸缓冲溶液注入到细胞培养支架17上，磷酸缓冲溶液用于漂洗粘附在细胞培养支架17上的细胞；废液瓶16通过安装在导管上的废液阀门15 与出液管5相联通，漂洗后的磷酸缓冲溶液经安装在导管上的废液阀门15流入到废液瓶16 内。这种结构的三维细胞动态培养反应器，不需要将粘附有细胞的细胞培养支架17 放置在二氧化碳培养箱内进行培养，实现细胞动态接种、细胞动态培养，简化了工艺，减少了设备，缩短了细胞培养时间，降低了细胞培养费用。本实施例的丝素蛋白/羟基磷灰石/胶原蛋白复合多孔支架由发明人制备，其制备方法如下1、制备丝素蛋白溶液取去蛹的蚕茧20g，加入0. 02mol/L Na2CO3水溶液2000g，煮沸30分钟，取出拧干， 用蒸馏水冲洗干净；再重复上述操作2次，50°C真空干燥，得到脱胶蚕丝；将5g脱胶蚕丝置于50g 9. 3mo 1/L LiBr溶液中，50°C保温至脱胶蚕丝完全溶解，装入截流分子量为3500道尔顿的透析袋中，在lml/min流速的蒸馏水中透析5天，离心分离，所得上清液为丝素蛋白溶液，用考马斯亮蓝法测定丝素蛋白溶液的质量浓度，用蒸馏水稀释至丝素蛋白溶液的质量浓度为6%，5°C储存备用。2、制备支架将4g粒径为180 250 μ m的NaCl、0. 16g羟基磷灰石混合均勻，NaCl与羟基磷灰石的质量比为1 0.04，装填入体积为IOmL的注射器中，加入4mL质量分数为6%的胶原蛋白溶液与质量分数为6%的丝素蛋白溶液的体积比为1 3的混合液，推动注射器的活塞柄，使混合液通过NaCl与羟基磷灰石的混合物，室温放置M小时，从注射器出粘结块，用体积分数为70%的乙醇溶液浸泡30分钟，用超纯水彻底清洗，制备成丝素蛋白/羟基磷灰石/胶原蛋白复合多孔支架。实施例2在本实施例中，反应器内壳体2内的支撑板19上放置有下防水透气膜18，反应器内壳体2下防水透气膜18上部装有细胞培养支架17，本实施例的细胞培养支架17采用壳聚糖/羟基磷灰石三维多孔支架，壳聚糖/羟基磷灰石三维多孔支架由发明人制备。其它零部件以及零部件的联接关系与实施例1相同。壳聚糖/羟基磷灰石三维多孔支架的制备方法如下1、溶解壳聚糖和羟基磷灰石将Ig壳聚糖(脱乙酰度为80^-95^),0. Ig羟基磷灰石溶解于IOOmL 20g/L 的乙酸水溶液中，搅拌6小时，离心去气泡，得到壳聚糖与羟基磷灰石的混合液。2、制备壳聚糖/羟基磷灰石三维多孔复合支架以SW2微球为致孔剂，将粒径为100 150 μ m的SW2微球加入20mL带针头的注射器中，用杵挤压、夯实SiO2微球，直至其在注射器中的位置不发生改变为止，SiO2微球的加入量为注射器容积的0. 25，再向注射器中加入壳聚糖与羟基磷灰石的混合液，混合液的加入量与SiA微球的体积相同，推动注射器的活塞柄，使混合液流过紧密排列的SiA微球，将注射器置于真空干燥箱中60°C干燥M小时，从注射器中取出粘结块，用刀切去粘结块上、下表面层，将切去上、下表面层的粘结块置于0. 05g/mL的NaOH水溶液中煮沸3小时， 用水冲洗至中性，在冰箱中-20°C预冻12 M小时，用液氮预冻30分钟，-50°C冷冻干燥 24小时，制备成壳聚糖/羟基磷灰石三维多孔复合支架材料。实施例3在本实施例中，反应器内壳体2内的支撑板19上放置有下防水透气膜18，反应器内壳体2下防水透气膜18上部装有细胞培养支架17，本实施例的细胞培养支架17采用聚乳酸-聚乙醇酸共聚物/羟基磷灰石/胶原蛋白复合多孔支架，聚乳酸-聚乙醇酸共聚物 /羟基磷灰石/胶原蛋白复合多孔支架由发明人制备。其它零部件以及零部件的联接关系与实施例1相同。以制备聚乳酸-聚乙醇酸共聚物/羟基磷灰石/胶原蛋白复合多孔支架IOOg为例，所用的原料及其配比为聚乳酸-聚乙醇酸共聚物95g羟基磷灰石2. 5g胶原蛋白2.5g其制备方法如下
取聚乳酸-聚乙醇酸共聚物95g、羟基磷灰石2. 5g、胶原蛋白2. 5g，混合均勻，用压片机冷压成直径为3cm、厚度为1. 5cm的圆片，圆片的具体尺寸可在直径为2 5cm、厚度为1 2cm的范围内按照反应釜的大小确定。将压片放入模具中，模具置于超临界(X)2反应釜中，关闭(X)2放气阀，设定反应压力为18MPa、反应温度为45°C、0)2流速为IOmL/分钟， 打开(X)2钢瓶阀、高压泵和温度控制阀，使压力和温度达到设定值，反应45分钟，打开(X)2放气阀，关闭CO2钢瓶阀、高压泵和反应釜的开关，压力降至常压后从反应釜中取出模具，制备成复合多孔支架材料。本发明的使用方法和操作步骤如下1、动态接种先将三维细胞动态培养反应器(除蠕动泵外)灭菌处理，进气管20通过管道与二氧化碳气瓶联通，将二氧化碳气体与空气的无菌混合气输入到反应器内壳体2内，用蠕动泵6将细胞悬液以5ml/min的流速经进液管3泵入反应器内壳体2内进入细胞培养支架17 循环流动，持续1小时进行动态接种，动态接种完成后，关闭蠕动泵6，静置3小时，使细胞粘附在细胞培养支架17上，用蠕动泵6将磷酸缓冲液淋以lml/min的流速洗掉在细胞培养支架17上未粘附的细胞和粘附不牢固的细胞，直至反应器内壳体2流出液中无细胞流出止， 使细胞完全粘附在细胞培养支架17上，冲洗后的磷酸缓冲液流入废液瓶16。2、动态培养用蠕动泵6将细胞培养液以lml/min的流速经进液管3泵入反应器内壳体2内进入细胞培养支架17循环流动，持续48小时，完成细胞的动态培养。为了验证本发明的有益效果，发明人采用本发明实施例1制备的三维细胞动态培养反应器对人骨肉瘤细胞MG-63、人结肠癌细胞Lovo进行动态培养，各种实验情况如下培养方法与上述动态培养方法相同。动态培养48小时后，用Quanta200环境扫描电子显微镜观察，结果见图2 图5。由图2 图5表明，细胞均勻地分布在支架中，在支架的孔中和孔边缘都均勻的分布着细胞。细胞表面的伪足和微绒毛显示细胞生长状态良好。因此，利用该细胞动态培养反应器可以使细胞更均勻地生长在细胞培养支架17上。
权利要求
1.一种三维细胞动态培养反应器，其特征在于在反应器外壳体(1)内设置有反应器内壳体O)，反应器外壳体(1)与反应器内壳体( 保持有间隙，形成水流通道，反应器外壳体(1)的左侧下部设置伸入到反应器内壳体O)内下部的进气管(20)，反应器内壳体(2) 的上端设置安装有出气单向阀门0 的密封上盖(21)，反应器内壳体( 的侧壁上设置有出液管(5)，反应器内壳体O)内的下部设置加工有通气孔的支撑板(19)，支撑板(19)与反应器内壳体O)内底部之间形成与进气管00)相联通的气室，支撑板(19)上设置有下防水透气膜(18)，下防水透气膜(18)上部设置有细胞培养支架(17)，细胞培养支架(17) 的上表面设置有上防水透气膜G)，进液管C3)的下端插入到反应器内壳体( 内穿过细胞培养支架(17)至下防水透气膜(18)的上表面，进液管C3)通过导管与蠕动泵(6)的出口相联通，蠕动泵(6)的进口通过安装在导管上的细胞悬液出液阀门(9)与细胞悬液瓶(11) 相联通、通过安装在导管上的细胞培养液出液阀门(8)与细胞培养液瓶(1 相联通、通过安装在导管上的缓冲液阀门(7)与缓冲液瓶(14)相联通，出液管( 通过安装在导管上的细胞悬液进液阀门(10)与细胞悬液瓶(11)相联通、通过安装在导管上的细胞培养液进液阀门(12)与细胞培养液瓶(13)相联通、通过安装在导管上的废液阀门(15)与废液瓶(16) 相联通。
2.按照权利要求1所述的三维细胞动态培养反应器，其特征在于所述的细胞培养支架(17)为多孔细胞培养支架。
3.按照权利要求2所述的三维细胞动态培养反应器，其特征在于所述的多孔细胞培养支架为丝素蛋白/羟基磷灰石/胶原蛋白复合多孔支架、壳聚糖/羟基磷灰石三维多孔支架、聚乳酸-聚乙醇酸共聚物/羟基磷灰石/胶原蛋白复合多孔支架中的任意一种。
全文摘要
一种三维细胞动态培养反应器，在反应器外壳体内设相互之间保持有间隙的反应器内壳体，反应器外壳体的左侧下部设伸入到反应器内壳体内下部的进气管，反应器内壳体的上端设装有出气单向阀门的密封上盖，反应器内壳体侧壁上设出液管，反应器内壳体内下部设加工有通气孔的支撑板，支撑板上设上部装有细胞培养支架的下防水透气膜，细胞培养支架上表面设上防水透气膜，进液管的下端插入到下防水透气膜上表面，进液管与蠕动泵出口相联通，蠕动泵进口与细胞悬液瓶、细胞培养液瓶、缓冲液瓶相联通，出液管与细胞悬液瓶、细胞培养液瓶、废液瓶相联通。本发明实现细胞动态接种、细胞动态培养，减少了设备，缩短了细胞培养时间，可用于贴壁细胞的培养。
文档编号C12M1/04GK102304476SQ20111024227
公开日2012年1月4日 申请日期2011年8月22日 优先权日2011年8月22日
发明者张志琪, 牟朝丽, 祁小妮 申请人:陕西师范大学