专利名称：纳米金荧光定量pcr检测基孔肯雅病毒核酸的非诊断性方法
技术领域：
本发明涉及一种利用纳米金荧光定量PCR检测基孔肯雅病毒核酸的非诊断性方法。
背景技术：
随着纳米技术在生命科学领域中不断应用，越来越多的具有独特性质的纳米材料逐渐被人们发现。纳米金(AuNPS)是纳米技术中应用较为广泛的一种的微小金颗粒，其直径在1 lOOnm，具有高电子密度、介电特性和催化作用，能与多种生物大分子结合，且不影响其生物活性。由于这种特殊的物理、化学性质和生物相容性，胶状的金纳米粒子在生物电化学、材料学及生物医学等领域有很广泛的应用。近年来，有学者发现纳米金能提高PCR体系的扩增效率。台湾成功大学LiM等报导了纳米金能提高PCR体系的扩增效率，随后一系列关于纳米金优化PCR的研究应用和机理探索很快展开；李海阔等(2009)利用纳米金粒子扩增人类基因组的低拷贝基因模板，实现了对复杂体系中低拷贝基因的扩增，提高了特异性扩增的产率；沈鹤柏等(2005)将引物连接在纳米金粒子表面，研究基于纳米金粒子的PCR，将均相体系中的PCR技术扩展到纳米粒子表面。同时，Li等(2005)利用10 nm的纳米金粒子显著提高了 PCR的特异性和改善非特异扩增。纳米金应用于荧光定量PCR反应中也有了初步的研究。Huang等(2008)在日本脑炎病毒RNA的实时定量反转录PCR反应体系中加入13 nm的纳米金粒子后，不但可以提高了反转录PCR产量，减少了扩增时间，而且提高了低拷贝病毒RNA基因的检测灵敏度。
发明内容
本发明的目的在于提供一种提高扩增效率，增加检测灵敏度，为病毒性疾病的准确快速检测提供技术支持的纳米金荧光定量PCR检测基孔肯雅病毒核酸的非诊断性方法。为实现上述目的，本发明纳米金荧光定量PCR检测基孔肯雅病毒核酸的非诊断性方法，在反应体系中加入适量的纳米金，来对实时荧光定量PCR反应体系进行催化和优化。进一步，所述纳米金为IOnm纳米金。进一步，所述方法的具体步骤包括1)提取病毒的核酸；2)确定反应体系中纳米金溶液浓度，建立纳米金荧光定量PCR反应体系；3)通过检测未知样品，检测黄热病毒、登革热病毒、日本脑炎病毒来验证该反应体系的有效性。进一步，所述实时荧光定量PCR反应体系扩增具体为配制设定组分浓度的25 μ L PCR反应体系。进一步，在所述实时荧光定量PCR反应体系中，其探针上连接的荧光基团包括 FAM-BHQ、FAM-TAMARA。进一步，所述实时荧光定量PCR反应体系适用于ABI实时PCR系统、BioRad实时PCR检测系统、Stratagene定量多聚酶链反应仪。本发明利用纳米金对实时荧光定量PCR的催化作用，在其反应体系中加入适量的 IOnm纳米金，针对已有的引物和探针，优化PCR反应体系，对病毒样本进行实时定量检测。 该法相较于一般的荧光定量PCR方法在灵敏度检测上有一定的提高、提高扩增效率，增加检测灵敏度，为病毒性疾病的准确快速检测提供技术支持。
图1为荧光定量PCR反应中加入不同浓度的纳米金后，病毒RNA扩增荧光强度随反应循环数变化的曲线图2为纳米金荧光定量PCR(A表示)与未加纳米金荧光定量PCR (B表示)灵敏度的检测结果的曲线图3为用本发明建立的方法对未知样本的RNA进行检测的曲线图； 图4为用本发明建立的方法对黄热病毒、登革热病毒、日本脑炎病毒的样本RNA进行交叉反应检测的曲线图。
具体实施例方式下面，参考附图，对本发明进行更全面的说明，附图中示出了本发明的示例性实施例。然而，本发明可以体现为多种不同形式，并不应理解为局限于这里叙述的示例性实施例。而是，提供这些实施例，从而使本发明全面和完整，并将本发明的范围完全地传达给本领域的普通技术人员。本发明中的基本方法荧光定量PCR检测基孔肯雅病毒核酸的方法，其中公开了相应的基本方法步骤和引物、探针，本发明中仍然可以采用上述的引物、探针。所述探针上连接的荧光基团包括FAM-BHQ、FAM-TAMARA等
本发明检测方法其次包括检测基孔肯雅病毒核酸的步骤，该步骤具体为
(1)核酸提取
病毒RNA提取选用QIAamp Mini kit 52906病毒RNA提取试剂盒；
(2)确定反应体系中纳米金溶液浓度
选用的扩增试剂盒为ABI公司AgPath-ID One-step RT-PCR Kit, 反应体系组分及其体积见表1。注X表示胶体金的不同浓度。表权利要求
1.纳米金荧光定量PCR检测基孔肯雅病毒核酸的非诊断性方法，其特征在于，该非诊断性方法在反应体系中加入适量的纳米金，来对实时荧光定量PCR反应体系进行催化和优化。
2.如权利要求1所述的非诊断性方法，其特征在于，所述纳米金为IOnm纳米金。
3.如权利要求1所述的非诊断性方法，其特征在于，所述方法的具体步骤包括1)提取病毒的核酸；2)确定反应体系中纳米金溶液浓度，建立纳米金荧光定量PCR反应体系；3)通过检测未知样品，检测黄热病毒、登革热病毒、日本脑炎病毒来验证该反应体系的有效性。
4.如权利要求3所述的非诊断性方法，其特征在于，所述实时荧光定量PCR反应体系扩增具体为配制设定组分浓度的25 μ L PCR反应体系。
5.如权利要求4所述的非诊断性方法，其特征在于，在所述实时荧光定量PCR反应体系中，其探针上连接的荧光基团包括FAM-BHQ、FAM-TAMARA。
6.如权利要求1所述的非诊断性方法，其特征在于，所述实时荧光定量PCR反应体系适用于ABI实时PCR系统、BioRad实时PCR检测系统、Stratagene定量多聚酶链反应仪。
全文摘要
本发明公开了一种纳米金荧光定量PCR检测基孔肯雅病毒核酸的非诊断性方法，该方法包括反应体系中添加的纳米金浓度的确定，纳米金添加前与添加后检测基孔肯雅病毒核酸的能力比较，以及该发明与其他病毒无交叉反应。
文档编号C12R1/93GK102268489SQ20111024228
公开日2011年12月7日 申请日期2011年8月23日 优先权日2011年8月23日
发明者姚李四, 张晓龙, 曹晓梅, 杨鹏飞, 燕清丽 申请人:中国检验检疫科学研究院