专利名称：一种提高球孢白僵菌孢子抗热性的糖类保护剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种提高球孢白僵菌孢子抗热性的糖类保护剂，可用于白僵菌孢子制剂制备、保藏和田间应用等领域。
背景技术：
随着人类对环境保护和自身健康的日益关注，大力推广生物农药已成为全球农药产业发展的新趋势。白僵菌作为一种广谱性病原真菌，因其具有易于生产、寄主范围广、侵染期长、不伤害人和其他脊椎动物及可贵的流行潜力等优点而成为目前世界上研究和应用最多的为微生物农药之一。本发明中所用的菌株(球孢白僵菌CCTCC No :M209238)对目前茶树头号害虫—— “假眼单胞小绿叶蝉”有显著防治效果。然而，白僵菌孢子制剂在制备、保藏和使用过程中， 都会因受到热损伤而导致孢子活性降低甚至死亡。其中，制备过程中的热来自干燥，保藏过程中的热来自保藏环境，使用(田间应用)过程中的热来自阳光照射或寄主的行为发热。因此，提高白僵菌孢子的抗热性，对提高其杀虫率和生物防治效果至关重要。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种提高球孢白僵菌孢子抗热性的糖类保护剂。为解决上述技术问题，所述保护剂组成如下5 % -13 %的二糖，终浓度为 0.01% -0. 的吐温-80，其余为水。所述球孢白僵菌(Beauveria bassiana)保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No :M209238，该菌株信息已在中国专利200910264664. 8中公开，公布日2010年 6 月 9 日，公布号 CN101724571A。所述球孢白僵菌的孢子保护剂的使用方法为将所述二糖保护剂按质量体积比为 5 % -13 %的比例添加到球孢白僵菌的孢子悬液中。所述二糖为蔗糖、麦芽糖、海藻糖或乳糖中任一一种。球孢白僵菌孢子悬浮液优选制备方法如下取适量二糖于25mL试管中，加入9. 5mL 0. 05%的吐温-80溶液，沸水浴并搅拌至糖类完全溶解，冰水浴冷却后，加入0. 5mL 2 X IO9孢子/mL的孢子悬浮液，并用振荡器将其混勻。孢子抗热性的检测方法1)将上述孢子悬浮液均勻混合液置于45°C恒温水浴锅中，水浴10min(同时震荡)后，立即取出，置于冰水混合物中冰浴冷却；2)将冷却后的混合液转移到250mL三角瓶中，再加入40mL 2. 5%麸皮浸出液，混勻，置于25°C，180r/min摇床中培养12h ；3)用胶头吸管吸取一滴培养液，滴到血球计数板上，并于电子显微镜下检测并计算其孢子萌发率(当芽管长度不小于孢子直径时，该孢子视为已萌发)。本发明的有益效果如下球孢白僵菌孢子可用于防治茶叶小绿叶蝉，其孢子抗热性的提高，降低了孢子在制剂制备和保藏过程中的热损伤，也增加了球孢白僵菌孢子在田间应用时对环境中高温的抵抗能力，从而提高了白僵菌孢子的存活率和侵染率，进而提高其生物防治的效果。
具体实施例方式实施例1 孢子悬浮液以及营养液的制备孢子悬浮液的制备1)洗脱。本发明所用的菌种为球孢白僵菌Beauveria bassiana(保藏编号为 CCTCC No :M209238)，取适量新鲜发酵培养物于250mL的三角瓶中，加入适量0. 05%的吐温-80溶液和适量玻璃珠，用玻璃棒将培养物捣碎，用振荡器高速振荡至少lOmin。2)过滤。振荡后，用2-4层纱布过滤，收集滤液。3)离心。将滤液离心，条件为8000r/min、5min、4°C，弃去上清。4)复溶。将离心后的沉淀物转移到50mL离心管中，加入40mL 0. 05%的吐温-80 溶液和适量玻璃珠，用振荡器高速震荡至少20min。5)计数。取ImL上述复溶后的孢子悬浮液，用0. 05%的吐温-80溶液稀释50-100 倍后，用血球计数板计数。6)稀释。计数后，将原孢子悬浮液用0.05%的吐温-80溶液稀释到2X109孢子/ mL，待用。麸皮浸出液(营养液)的制备称取25g麸皮于锅中，添加IOOOmL蒸馏水中，煮沸并搅拌，维持沸腾30min(以上)，冷却后用2-4层纱布过滤，收集滤液，再用蒸馏水将滤液补足至IOOOmL,所得溶液即为浓度为2. 5%的麸皮浸出液，也是培养孢子悬浮液所用的营养液。115°C，15min灭菌，待用。对比例对照1 将IOmL 1 X IO8孢子/mL孢子悬浮液置于250mL三角瓶中，再加入40mL 2.5%麸皮浸出液，混勻，置于251，180171^11摇床中培养12h ；用胶头吸管吸取一滴培养液，滴到血球计数板上，并于电子显微镜下检测并计算其孢子萌发率(当芽管长度不小于孢子直径时，该孢子视为已萌发)。对照2 将IOmL 1 X IO8孢子/mL孢子悬浮液置于250mL三角瓶中，再加入40mL 2. 5%麸皮浸出液并将5g蔗糖溶解于混合液中，混勻，置于25°C，180r/min摇床中培养12h ； 用胶头吸管吸取一滴培养液，滴到血球计数板上，并于电子显微镜下检测并计算其孢子萌发率(当芽管长度不小于孢子直径时，该孢子视为已萌发)。对照3 将IOmL 1 X IO8孢子/mL孢子悬浮液置于250mL三角瓶中，再加入40mL 2.5%麸皮浸出液并将58麦芽糖溶解于混合液中，混勻，置于251，180171^11摇床中培养 12h;用胶头吸管吸取一滴培养液，滴到血球计数板上，并于电子显微镜下检测并计算其孢子萌发率(当芽管长度不小于孢子直径时，该孢子视为已萌发)。对照4 将IOmL 1 X IO8孢子/mL孢子悬浮液置于250mL三角瓶中，再加入40mL 2.5%麸皮浸出液并将58海藻糖溶解于混合液中，混勻，置于251，180171^11摇床中培养 12h;用胶头吸管吸取一滴培养液，滴到血球计数板上，并于电子显微镜下检测并计算其孢子萌发率(当芽管长度不小于孢子直径时，该孢子视为已萌发)。对照5 将IOmL 1 X IO8孢子/mL孢子悬浮液置于250mL三角瓶中，再加入40mL2.5%麸皮浸出液并将58乳糖溶解于混合液中，混勻，置于251，18017^11摇床中培养1211 ； 用胶头吸管吸取一滴培养液，滴到血球计数板上，并于电子显微镜下检测并计算其孢子萌发率(当芽管长度不小于孢子直径时，该孢子视为已萌发)。结果见表1表 权利要求
1.一种提高球孢白僵菌孢子抗热性的糖类保护剂，其特征在于，具体组成如下 5% -13%的二糖，终浓度为0.01% -0. 的吐温-80，其余为水。
2.根据权利要求1所述保护剂，其特征在于，所述二糖为蔗糖、麦芽糖、海藻糖或乳糖中任--种。
3.根据权利要求3所述保护剂，其特征在于，球孢白僵菌孢子悬浮液中保护剂的添加方法如下取适量二糖于25mL试管中，加入9. 5mL 0. 05%的吐温-80溶液，沸水浴并搅拌至糖类完全溶解，冰水浴冷却后，加入0. 5mL 2 X IO9孢子/mL的孢子悬浮液，并用振荡器将其混勻。
全文摘要
本发明公开了一种提高球孢白僵菌孢子抗热性的糖类保护剂，可用于白僵菌孢子制剂制备、保藏和田间应用等领域，保护剂具体组成如下5％-13％的二糖，终浓度为0.01％-0.1％的吐温-80，其余为水。球孢白僵菌孢子可用于防治茶叶小绿叶蝉，其孢子抗热性的提高，降低了孢子在制剂制备和保藏过程中的热损伤，也增加了球孢白僵菌孢子在田间应用时对环境中高温的抵抗能力，从而提高了白僵菌孢子的存活率和侵染率，进而提高其生物防治的效果。
文档编号C12R1/645GK102321543SQ20111025292
公开日2012年1月18日 申请日期2011年8月30日 优先权日2011年8月30日
发明者刘龙, 堵国成, 李华祥, 李江华, 杨海泉, 陈坚 申请人:江南大学