专利名称：小分子脂肪酸化学修饰提高氯过氧化物酶催化活性的方法
技术领域：
本发明属于酶工程技术领域，具体涉及一种通过小分子化学修饰提高酶的催化活性的方法。
背景技术：
酶催化反应由于其具有条件温和、高效定向、环境友好等特点，如今已被广泛应用于有机合成、药物制备等领域，被视为今后大宗化学品绿色合成的重要手段，对实现可持续发展战略具有重要意义。氯过氧化物酶(CPO)是自海洋真菌Caldariomyces fumago中分离出的一种血红素糖蛋白酶，CPO因其独特的活性位点结构而兼具过氧化物酶、过氧化氢酶以及细胞色素 P-450的催化功能，目前被认为是已知的血红素过氧化物酶家族中应用最广泛的酶，并且具有广泛的底物适应性，因此CPO在环境生物催化、医药工业和现代合成化学中具有很大的应用潜力。如何改善天然酶的催化活性，提高酶促反应的效率，一直以来是人们坚持不懈的努力目标。然而由于酶蛋白是分子量很大的生物大分子，结构复杂，影响因素众多，是一项难度很大的挑战，有效手段还比较缺乏；同时目前普遍存在的酶的稳定性与工业生产所需的苛刻条件之间的矛盾也是制约酶的大规模产业化应用的一个瓶颈。对CPO而言，反应体系中经常会使用酸、碱、有机溶剂或反应温度较高等相对极端的条件，都会引起CPO变性失活。因此，提高CPO对温度、有机溶剂等导致失活因素的抵抗能力、增强其在极端反应环境中的适应性对提升酶的产业化应用潜能是很有意义的。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于克服上述氯过氧化物酶存在的缺点，提供一种能够有效提高氯过氧化物酶的催化活性，改善其高温热稳定性及对有机溶剂的抗失活性能的小分子脂肪酸化学修饰氯过氧化物酶的方法。解决上述技术问题所采用的技术方案是由下述步骤组成1、配制溶液将小分子脂肪酸溶于质量分数为4%的二甲基亚砜水溶液中，配制浓度为 0. 5mmol/L的小分子脂肪酸溶液；将氯过氧化物酶溶于pH值为5. 0的磷酸缓冲液中，配制浓度为5X 10_6mol/L的氯过氧化物酶溶液。上述的小分子脂肪酸为十二酸、十四酸、十八酸、二十酸、二十二酸中的任意一种。2、预处理透析袋将透析袋用体积分数为50%的乙醇水溶液煮沸1小时，冷却，依次用体积分数为 50%的乙醇水溶液、0. 01mol/L的NaHCOjK溶液、0. 001mol/L的乙二胺四乙酸水溶液、蒸馏水洗涤，再浸泡于蒸馏水中，放置在4°C冰箱中待用。3、修饰反应
将浓度为5X 10_6mOl/L氯过氧化物酶溶液与浓度为0. 5mmol/L的小分子脂肪酸溶液混合，氯过氧化物酶与小分子脂肪酸的摩尔比为1 15 30，置于冰浴中，密封搅拌 30 60分钟。4、后处理将修饰反应后的溶液转入步骤2预处理的透析袋中，放在4°C冰箱中，用pH值为 5. 0的磷酸缓冲液透析48小时，得到小分子脂肪酸修饰的氯过氧化物酶。本发明的小分子脂肪酸优选为十八酸或二十酸或二十二酸，最佳为十八酸。本发明的修饰反应步骤3中，氯过氧化物酶与小分子脂肪酸溶液的最佳摩尔比为 1 20。本发明采用十二酸、十四酸、十八酸、二十酸、二十二酸等小分子脂肪酸对氯过氧化物酶进行化学修饰后，不仅有效提高了氯过氧化物酶的催化活性，而且改善了其高温热稳定性及对有机溶剂的抗失活能力。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明进一步详细说明，但本发明不限于这些实施例。实施例11、配制溶液将0. 142g十八酸溶于质量分数为4%的二甲基亚砜的磷酸缓冲液中，配制浓度为 0. 5mmol/L的十八酸溶液IOOmL ；将100 μ L5X 10_4mol/L的氯过氧化物酶溶液用pH值为5. 0 的磷酸缓冲液稀释至IOOmL,配制成浓度为5X10_6mol/L的氯过氧化物酶溶液。2、预处理透析袋将透析袋用150mL体积分数为50%的乙醇水溶液煮沸1小时，冷却，依次用体积分数为50%的乙醇水溶液、0. 01mol/L的NaHCO3水溶液、0. 001mol/L的乙二胺四乙酸水溶液洗涤，再用蒸馏水洗涤，然后浸泡于蒸馏水中，放置在4°C冰箱中待用。3、修饰反应将;3mL 5 X lO—mol/L的氯过氧化物酶溶液、0. 6mL 0. 5mmol/L的十八酸溶液在5mL 冻存管里混合均勻，氯过氧化物酶与十八酸的摩尔比为1 20，置于冰浴中搅拌60分钟。4、后处理将修饰反应后的溶液转入步骤2预处理的透析袋中，放在4°C冰箱中，用pH值为 5. 0的磷酸缓冲液透析48小时，得到十八酸修饰的氯过氧化物酶。实施例2在实施例1的配制溶液步骤1中，将0. Ig十二酸溶于质量分数为4%的二甲基亚砜的磷酸缓冲液中，配制浓度为0. 5mmol/L的十二酸溶液IOOmL,该步骤的其他步骤与实施例1相同。在修饰反应步骤3中，将3mL 5X 10_6mol/L的氯过氧化物酶溶液、0. 6mL 0. 5mmol/L的十二酸溶液在5mL冻存管里混合均勻，置于冰浴中搅拌60分钟。其他步骤与实施例1相同，制备成十二酸修饰的氯过氧化物酶。实施例3在实施例1的配制溶液步骤1中，将0. 114g十四酸溶于质量分数为4%的二甲基亚砜的磷酸缓冲液中，配制浓度为0. 5mmol/L的十四酸溶液IOOmL,该步骤的其他步骤与实施例1相同。在修饰反应步骤3中，将;3mL 5X 10_6mol/L的氯过氧化物酶溶液、0. 6mL 0. 5mmol/L的十四酸溶液在5mL冻存管里混合均勻，置于冰浴中搅拌60分钟。其他步骤与实施例1相同，制备成十四酸修饰的氯过氧化物酶。实施例4在实施例1的配制溶液步骤1中，将0. 156g 二十酸溶于质量分数为4%的二甲基亚砜的磷酸缓冲液中，配制浓度为0. 5mmol/L的二十酸溶液IOOmL,该步骤的其他步骤与实施例1相同。在修饰反应步骤3中，将3mL 5X 10_6mol/L的氯过氧化物酶溶液、0. 6mL 0. 5mmol/L的二十酸溶液在5mL冻存管里混合均勻，置于冰浴中搅拌60分钟。其他步骤与实施例1相同，制备成二十酸修饰的氯过氧化物酶。实施例5在实施例1的配制溶液步骤1中，将0. 171g 二十二酸溶于质量分数为4%的二甲基亚砜的磷酸缓冲液中，配制浓度为0. 5mmol/L的二十二酸溶液IOOmL,该步骤的其他步骤与实施例1相同。在修饰反应步骤3中，将3mL 5X 10_6mol/L的氯过氧化物酶溶液、0. 6mL 0. 5mmol/L的二十二酸溶液在5mL冻存管里混合均勻，置于冰浴中搅拌60分钟。其他步骤与实施例1相同，制备成二十二酸修饰的氯过氧化物酶。实施例6在实施例1的修饰反应步骤3中，将2mL 5X 10_6mol/L的氯过氧化物酶溶液、 0. 3mL 0. 5mmol/L的十八酸溶液在5mL冻存管里混合均勻，氯过氧化物酶与十八酸的摩尔比为1 15，置于冰浴中搅拌45分钟。其他步骤与实施例1相同，制备成十八酸修饰的氯过氧化物酶。本实施例浓度为0. 5mmol/L的十八酸溶液也可用等体积0. 5mmol/L的十二酸溶液替换，还可用等体积0. 5mmol/L的十四酸溶液或0. 5mmol/L的二十酸溶液或0. 5mmol/L的二十二酸溶液替换，制备成十二酸修饰的氯过氧化物酶、十四酸修饰的氯过氧化物酶、二十酸修饰的氯过氧化物酶或二十二酸修饰的氯过氧化物酶。实施例7在实施例1的修饰反应步骤3中，将3mL 5X10_6mol/L的氯过氧化物酶溶液、 0. 9mL 0. 5mmol/L的十八酸溶液在5mL冻存管里混合均勻，氯过氧化物酶与十八酸溶液的摩尔比为1 30，置于冰浴中搅拌30分钟。其他步骤与实施例1相同，制备成十八酸修饰的氯过氧化物酶。本实施例浓度为0. 5mmol/L的十八酸溶液也可用等体积0. 5mmol/L的十二酸溶液替换，还可用0. 5mmol/L的十四酸溶液或0. 5mmol/L的二十酸溶液或0. 5mmol/L的二十二酸溶液替换，制备成十二酸修饰的氯过氧化物酶、十四酸修饰的氯过氧化物酶、二十酸修饰的氯过氧化物酶或二十二酸修饰的氯过氧化物酶。为了证明本发明的有益效果，发明人采用实施例1 5制备的小分子脂肪酸修饰的氯过氧化物酶进行了各种试验，具体试验情况如下1、氯化活性分别以氯过氧化物酶、十二酸修饰的氯过氧化物酶、十四酸修饰的氯过氧化物酶、 十八酸修饰的氯过氧化物酶、二十酸修饰的氯过氧化物酶、二十二酸修饰的氯过氧化物酶为催化剂，催化2-氯-5，5- 二甲基-1，3-环己二酮生成2，2- 二氯-5，5- 二甲基-1，3-环
5己二酮的氯化反应，比较氯过氧化物酶与小分子脂肪酸修饰的氯过氧化物酶的氯化活性， 实验结果见表1。表1氯过氧化物酶及小分子脂肪酸修饰的氯过氧化物酶的氯化活性
权利要求
1.一种小分子脂肪酸化学修饰提高氯过氧化物酶催化活性的方法，其特征在于由下述步骤组成(1)配制溶液将小分子脂肪酸溶于质量分数为4%的二甲基亚砜水溶液中，配制浓度为0. 5mmol/ L的小分子脂肪酸溶液；将氯过氧化物酶溶于PH值为5.0的磷酸缓冲液中，配制浓度为 5X 10_6mol/L的氯过氧化物酶溶液；上述的小分子脂肪酸为十二酸、十四酸、十八酸、二十酸、二十二酸中的任意一种；(2)预处理透析袋将透析袋用体积分数为50%的乙醇水溶液煮沸1小时，冷却，依次用体积分数为50% 的乙醇水溶液、0. 01mol/L的NaHCO3水溶液、0. 001mol/L的乙二胺四乙酸水溶液、蒸馏水洗涤，再浸泡于蒸馏水中，放置在4°C冰箱中待用；(3)修饰反应将浓度为5X 10_6mOl/L氯过氧化物酶溶液与浓度为0. 5mmol/L的小分子脂肪酸溶液混合，氯过氧化物酶与小分子脂肪酸的摩尔比为1 15 30，置于冰浴中，密封搅拌30 60 分钟；(4)后处理将修饰反应后的溶液转入步骤(2)预处理的透析袋中，放在4°C冰箱中，用pH值为5.0 的磷酸缓冲液透析48小时，得到小分子脂肪酸修饰的氯过氧化物酶。
2.根据权利要求1所述的小分子脂肪酸化学修饰提高氯过氧化物酶催化活性的方法， 其特征在于所述的小分子脂肪酸为十八酸或二十酸或二十二酸。
3.根据权利要求1所述的小分子脂肪酸化学修饰提高氯过氧化物酶催化活性的方法， 其特征在于所述的小分子脂肪酸为十八酸。
4.根据权利要求1所述的小分子脂肪酸化学修饰提高氯过氧化物酶催化活性的方法，其特征在于在修饰反应步骤(3)中，所述的氯过氧化物酶与小分子脂肪酸的摩尔比为 1 20。
全文摘要
一种小分子脂肪酸化学修饰提高氯过氧化物酶催化活性的方法，采用十二酸、十四酸、十八酸、二十酸、二十二酸等小分子脂肪酸对氯过氧化物酶进行化学修饰，不仅有效地提高了氯过氧化物酶的催化活性，而且改善了其高温热稳定性及对有机溶剂的抗失活能力。本发明方法简单、成本低，对氯过氧化物酶在有机合成等领域的产业化应用具有重要意义。
文档编号C12N9/96GK102352348SQ201110276948
公开日2012年2月15日 申请日期2011年9月16日 优先权日2011年9月16日
发明者李淑妮, 李超男, 翟全国, 胡满成, 蒋育澄 申请人:陕西师范大学