专利名称：3－氯－1，2－丙二醇及其脂肪酸酯含量的检测方法
技术领域：
本发明属于分析化学领域，具体涉及ー种3-氯-1，2-丙ニ醇及其脂肪酸酷含量的检测方法。
背景技术：
3-氯-1，2-丙ニ醇及其脂肪酸酯是在食品加工过程中产生的、不易引起人们的注意、但会对广大消费者的健康产生危害的物质。其对人体的危害表现在①3-氯-1，2-丙 ニ醇的急、慢性毒性3-氯-1，2-丙ニ醇的大鼠经ロ半数致死量LD5tl为150mg/kg. bw。雄性大鼠连续经ロ染毒3-氯-1，2-丙ニ醇lmg/kg/day以上剂量吋，可以出现精子活动减弱和生殖力降低，剂量大于或等于10-20mg/kg/day，可见大鼠的精子有显著的形态学改变和附睾损伤；②3-氯-1，2-丙ニ醇的遗传毒性目前大多数研究机构和学者认为3-氯-1，2-丙 ニ醇属于非遗传毒性致癌物，暂定每日最大耐受量(TDI)为2yg/kg.bw;③3-氯-1，2-丙 ニ醇的致癌性英国致癌委员会(Committee on carcinoginicity)认为，3-氯-1，2-丙ニ 醇在动物实验中会引起致癌；而英国致变异委员会(Committee on Mutagenicity)认为， 3-氯-1，2-丙ニ醇在体内实验中，是ー个非基因毒性的致癌物质；④3-氯-1，2-丙ニ醇的神经毒性小鼠和大鼠对3-氯-1，2-丙ニ醇的神经毒性作用敏感性相同，尤其是对脑干的対称性损伤。当3-氯-1，2-丙ニ醇染毒剂量大于25mg/kg. bw/day吋，实验动物中枢神经系统损伤呈现显著的剂量效应关系。由于3-氯-1，2-丙ニ醇对人体健康的危害，欧盟在2001年制订了限量标准，规定不得超过每日20yg/kg. W的摄入量；我国也建立了检测酱油中3-氯-1，2-丙ニ醇的国家标准。由于3-氯-1，2-丙ニ醇的危害性较大，在食品中要求的安全限为ppb级，且食品中的含量一般也在此级別，因此目前一般都采用灵敏度高的GC-MS方法检测。虽然3-氯-1， 2-丙ニ醇脂肪酸酷的危害性还无定论，但它在一定条件下很容易水解生成3-氯-1，2-丙 ニ醇，因此油脂样品除需检测游离的3-氯-1，2-丙ニ醇外，还需检测3-氯-1，2-丙ニ醇脂肪酸酷的含量。常用的3-氯-1，2-丙ニ醇检测方法是先将3-氯-1，2-丙ニ醇进行衍生，衍生方法有酮类衍生、硼酸类衍生(苯基硼酸、丁基硼酸)、N，0-双三甲基-三氟乙酰胺(BSTFA)、酸酐类衍生、七氟丁酰咪唑(HFBI)等；衍生后再进行GC-MS检测。3-氯-1， 2-丙ニ醇脂肪酸酷可通过酯交換反应变成3-氯-1，2-丙ニ醇后进行检测。虽然GC-MS是目前采用的最主要的方法，但此方法存在着仪器昂贵、维护使用费用高、需氘代标样作为内标物、对使用者业务能力要求高等缺陷，极大地限制了此检测方法的推广应用，使得相关产品中増加3-氯-1，2-丙ニ醇残留量指标成为空谈。
发明内容
本发明所要解决的ー个技术问题是提供ー种操作方便、成本较低的3-氯-1，2-丙 ニ醇含量的检测方法。为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案包括以下步骤
1)氧化将水溶液中的3-氯-1，2-丙ニ醇氧化为氯乙醛；2)衍生化将氯乙醛与衍生试剂反应生成具有荧光效应的物质；3)检测采用HPLC-FLD方法进行检測，即可得3_氯_1，2_丙ニ醇的含量。所述步骤1)中，可用但不限于用高碘酸钠作为氧化剂。优选地，所述高碘酸钠的浓度为0. 01-0. lmol/L,添加量为所述3-氯-1，2-丙ニ醇水溶液体积的10-80%，反应温度为5-30°C，反应时间为10-120min。所述步骤2)中的衍生试剂包括但不限于鸟嘌呤、腺嘌呤、巯基鸟嘌呤、胞嘧啶，其相应核苷及核苷酸。所述衍生试剂的浓度为0.002-0.02mol/L，反应温度为37-100°C，反应时间为 10-240min。所述步骤3)中HPLC采用反相色谱模式，固定相包括但不限于反相0DS、C12或C8 填料，流动相包括但不限于甲醇-水或乙腈-水体系，比例为5% 95% -100% 0% ；FLD激发波长为260-320nm，检测波长为350_470nm。所述3-氯-1，2-丙ニ醇水溶液可以是经如下步骤处理动植物油脂产品制得a)称取油脂产品质量；b)加入己烷和含NaCl的乙酸溶液进行萃取，弃去上层有机相；c)用己烷重复萃取一次，弃去上层有机相。所述3-氯-1，2-丙ニ醇水溶液也可以是经如下步骤处理固态含油脂产品制得，所述固态含油脂产品包括但不限于油炸方便面、薯片、油条或油饼a)称取固态含油脂产品的质量并粉碎；b)加入己烷进行萃取2次以上，合并萃取液；c)加水于合并的萃取液中进行萃取，弃去上层有机相。所述3-氯-1，2-丙ニ醇水溶液还可以是经固相萃取非油脂类产品制得，所述非油脂类产品包括但不限于酱油、水解植物蛋白。本发明所要解决的另ー技术问题是提供ー种3-氯-1，2-丙ニ醇脂肪酸酷含量的检测方法。为解决该技术问题，本发明采用的技术方案包括以下步骤a)酷交換将水溶液中的3-氯-1，2-丙ニ醇脂肪酸酯经酯交換为3_氯_1，2_丙b)氧化将3-氯-1，2-丙ニ醇氧化为氯乙醛；c)衍生化将氯乙醛与衍生试剂反应生成具有荧光效应的物质；d)检测采用HPLC-FLD方法进行检測，可得出3_氯_1，2-丙ニ醇含量；e)折算出3-氯-1，2-丙ニ醇脂肪酸酷的含量。本发明的有益效果在干1)本发明与现有GC-MS方法相比，可在普通的液相色谱-荧光检测器上进行，设备投资大大降低。2)采用的试剂均为常规试剂，无需昂贵的氘代标样，价格低廉，极大地减低了使用费用。3)方法操作简单，对操作者要求较低，容易推广应用。4)本发明既可測定游离态的3-氯-1，2-丙ニ醇的含量，也可測定游离态的和结合态的总3-氯-1，2-丙ニ醇含量，并据此折算出3-氯-1，2-丙ニ醇脂肪酸酷的物质的量。
5) 一般企业均有能力配置和使用检测仪器进行检测，为相关产品中増加3-氯-1， 2-丙ニ醇检测指标扫清了障碍。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明做进ー步说明。实施例一称取2g —级大豆油，溶于IOmL甲基叔丁基醚，加入20mL甲醇钠溶液进行酷交換反应lOmin，然后加入60mL己烷和6OmL含NaCl的乙酸溶液萃取3-氯_1，2_丙 ニ醇，弃去上层有机相；用60mL己烷重复萃取一次，所得水相中加入0. lmol/L的高碘酸钠溶液进行氧化反应，其中高碘酸钠溶液体积为所得水相体积的10%，反应温度为30°C，反应时间为20min ；浓缩至体积为lmL，然后加入2mL的0. 002mol/L的鸟嘌呤进行衍生化反应，在37°C下反应MOmin ；反应完成后定容至5mL，采用HPLC-FLD方法检测固定相为反相ODS填料，流动相为甲醇-水(5 95, ν/ν)；激发波长为^Onm，荧光检测波长为350nm ； 外标法定量。重复测定10次，得到油中游离态的和结合态的总3-氯-1，2-丙ニ醇含量为 532士21 μ g/kg。測定游离态的3-氯-1，2-丙ニ醇的含量则在取样后直接进行3-氯-1，
2-丙ニ醇萃取过程，其它操作与上同，得到測定结果为47士 6μ g/kg。加标试验的測定结果表明回收率在97-102%之间。3-氯-1，2-丙ニ醇脂肪酸酷的含量(物质的量)可通过总
3-氯-1，2-丙ニ醇含量与游离态的3-氯-1，2-丙ニ醇的含量的差值经折算求得(实施例 2-8中可同样通过该方法求得)。实施例ニ 称取2g猪油，溶于IOmL甲基叔丁基醚，加入20mL甲醇钠溶液进行酯交换反应lOmin，然后加入60mL己烷和60mL含NaCl的乙酸溶液萃取3-氯-1，2-丙ニ醇，弃去上层有机相；用60mL己烷重复萃取一次，所得水相中加入0. 05mol/L的高碘酸钠溶液进行氧化反应，其中高碘酸钠溶液体积为所得水相体积的40%，反应温度为20°C，反应时间为 50min ；浓缩至体积为lmL，然后加入0. 8mL的0. 01mol/L的鸟嘌呤进行衍生化反应，在50°C 下反应120min ；反应完成后定容至5mL，采用HPLC-FLD方法检测固定相为反相ODS填料， 流动相为乙腈-水(10 90, ν/ν)；激发波长为^Onm，荧光检测波长为380nm;外标法定量。 重复测定10次，得到油中游离态的和结合态的总3-氯-1，2-丙ニ醇含量为212士 14 μ g/ kg。測定游离态的3-氯-1，2-丙ニ醇的含量则在取样后直接进行3-氯-1，2-丙ニ醇萃取过程，其它操作与上同，得到測定结果为23士4μ g/kg。加标试验的測定结果表明回收率在 98-101%之间。实施例三称取2g —级菜籽油，溶于IOmL甲基叔丁基醚，加入20mL甲醇钠溶液进行酷交換反应lOmin，然后加入60mL己烷和60mL含NaCl的乙酸溶液萃取3-氯-1，2-丙ニ 醇，弃去上层有机相；用60mL己烷重复萃取一次，所得水相中加入O.Olmol/L的高碘酸钠溶液进行氧化反应，其中高碘酸钠溶液体积为所得水相体积的80%，反应温度为5°C，反应时间为120min ；浓缩至体积为lmL，然后加入0. 5mL的0. 02mol/L的腺嘌呤核苷进行衍生化反应，在100°C下反应20min ；反应完成后定容至5mL，采用HPLC-FLD方法检测固定相为反相 C12填料，流动相为甲醇-水(15 85，ν/ν)；激发波长为320nm，荧光检测波长为470nm; 外标法定量。重复测定10次，得到油中游离态的和结合态的总3-氯-1，2-丙ニ醇含量为 485士 18 μ g/kg。測定游离态的3-氯-1，2-丙ニ醇的含量则在取样后直接进行3-氯-1， 2-丙ニ醇萃取过程，其它操作与上同，得到測定结果为36 士 5μ g/kg。加标试验的測定结果表明回收率在95-98%之间。实施例四称取2g—级大豆油，溶于IOmL甲基叔丁基醚，加入20mL甲醇钠溶液进行酷交換反应lOmin，然后加入60mL己烷和6OmL含NaCl的乙酸溶液萃取3-氯_1，2_丙 ニ醇，弃去上层有机相；用60mL己烷重复萃取一次，所得水相中加入0. 05mol/L的高碘酸钠溶液进行氧化反应，其中高碘酸钠溶液体积为所得水相体积的50%，反应温度为15°C，反应时间为40min ；浓缩至体积为lmL，然后加入ImL的0. Olmol/L的巯基鸟嘌呤进行衍生化反应，在50°C下反应HOmin ；反应完成后定容至5mL，采用HPLC-FLD方法检测固定相为反相C8填料，流动相为乙腈-水(50 50, ν/ν)；激发波长为300nm,荧光检测波长为450nm ； 外标法定量。重复测定10次，得到油中游离态的和结合态的总3-氯-1，2-丙ニ醇含量为 547士 191 μ g/kg。測定游离态的3-氯-1，2-丙ニ醇的含量则在取样后直接进行3-氯-1，
2-丙ニ醇萃取过程，其它操作与上同，得到測定结果为53士 4μ g/kg。加标试验的測定结果表明回收率在98-101%之间。实施例五称取2g —级菜籽油，溶于IOmL甲基叔丁基醚，加入20mL甲醇钠溶液进行酷交換反应lOmin，然后加入60mL己烷和6OmL含NaCl的乙酸溶液萃取3-氯_1，2_丙 ニ醇，弃去上层有机相；用60mL己烷重复萃取一次，所得水相中加入0. 05mol/L的高碘酸钠溶液进行氧化反应，其中高碘酸钠溶液体积为所得水相体积的50%，反应温度为25°C， 反应时间为60min ；浓缩至体积为lmL，然后加入0. 5mL的0. 02mol/L的胞嘧啶核苷酸进行衍生化反应，在80°C下反应40min ；反应完成后定容至5mL，采用HPLC-FLD方法检测固定相为反相C8填料，流动相为乙腈；激发波长为310nm，荧光检测波长为410nm ；外标法定量。 重复测定10次，得到油中游离态的和结合态的总3-氯-1，2-丙ニ醇含量为506士22 μ g/ kg。測定游离态的3-氯-1，2-丙ニ醇的含量则在取样后直接进行3-氯-1，2-丙ニ醇萃取过程，其它操作与上同，得到測定结果为45士4μ g/kg。加标试验的測定结果表明回收率在 97-104%之间。实施例六称取8g油炸方便面，粉碎后用己烷萃取3次，毎次50mL，合并萃取液并脱除己烷；然后溶于IOmL甲基叔丁基醚，加入20mL甲醇钠溶液进行酯交換反应lOmin，再加入60mL己烷和60mL含NaCl的乙酸溶液萃取3-氯-1，2-丙ニ醇，弃去上层有机相；用 60mL己烷重复萃取一次，所得水相中加入0. lmol/L的高碘酸钠溶液进行氧化反应，其中高碘酸钠溶液体积为所得水相体积的10%，反应温度为25°C，反应时间为IOOmin ；浓缩至体积为lmL，然后加入ImL的0. 01mol/L的巯基鸟嘌呤核苷进行衍生化反应，在100°C下反应 30min ；反应完成后定容至5mL，采用HPLC-FLD方法检测固定相为反相ODS填料，流动相为乙腈-水(50 50, ν/ν)；激发波长为320nm，荧光检测波长为430nm;外标法定量。重复测定10次，得到油中游离态的和结合态的总3-氯-1，2-丙ニ醇含量为932士四μ g/kg。游离
3-氯-1，2-丙ニ醇的測定己烷萃取出油脂后直接用水进行3-氯-1，2-丙ニ醇萃取，其它操作与上同，得到測定结果为15士2μ g/kg。加标试验的測定结果表明回收率在93-96%之间。实施例七称取8g油炸薯片，粉碎后用己烷萃取3次，毎次50mL，合并萃取液并脱除己烷；然后溶于IOmL甲基叔丁基醚，加入20mL甲醇钠溶液进行酯交換反应lOmin，再加入60mL己烷和60mL含NaCl的乙酸溶液萃取3-氯-1，2-丙ニ醇，弃去上层有机相；用60mL 己烷重复萃取一次，所得水相中加入0. 05mol/L的高碘酸钠溶液进行氧化反应，其中高碘酸钠溶液体积为所得水相体积的80%，反应温度为35°C，反应时间为IOmin ；浓缩至体积为 lmL，然后加入150% (体积比)0. 008mol/L的鸟嘌呤核苷酸进行衍生化反应，在80°C下反应60min ；反应完成后定容至5mL，采用HPLC-FLD方法检测固定相为反相C 12填料，流动相为乙腈-水(10 90, ν/ν)；激发波长为^Onm，荧光检测波长为350nm;外标法定量。重复测定10次，得到油中游离态的和结合态的总3-氯-1，2-丙ニ醇含量为1179士37 μ g/ kg。游离态的3-氯-1，2-丙ニ醇含量的測定己烷萃取出油脂后直接用水萃取3-氯-1， 2-丙ニ醇，其它操作与上同，得到測定结果为^±5yg/kg。加标试验的測定结果表明回收率在94-98%之间。实施例八称取8g油炸方便面，粉碎后用己烷萃取3次，毎次50mL，合并萃取液并脱除己烷；然后溶于IOmL甲基叔丁基醚，加入20mL甲醇钠溶液进行酯交換反应lOmin，再加入60mL己烷和60mL含NaCl的乙酸溶液萃取3-氯-1，2-丙ニ醇，弃去上层有机相；用 60mL己烷重复萃取一次，所得水相中加入0. 03mol/L的高碘酸钠溶液进行氧化反应，其中高碘酸钠溶液体积为所得水相体积的30%，反应温度为5°C，反应时间为120min ；浓缩至体积为lmL，然后加入2mL的0. 009mol/L的腺嘌呤进行衍生化反应，在50°C下反应120min ； 反应完成后定容至5mL，采用HPLC-FLD方法检测固定相为反相C8填料，流动相为甲醇；激发波长为^Onm，荧光检测波长为405nm ；外标法定量。重复测定10次，得到油中游离态的和结合态的总3-氯-1，2-丙ニ醇含量为979 士 32μ g/kg。游离态的3-氯-1，2-丙ニ醇含量的測定己烷萃取出油脂后直接用水萃取3-氯-1，2-丙ニ醇，其它操作与上同，得到測定结果为21 士3 μ g/kg。加标试验的測定结果表明回收率在97-103%之间。实施例九称取8g酿造酱油，用12mL的5mol/LNaCl溶液混合，上样固相萃取柱， 先用SOmL己烷-乙醚(90 10，ν/ν)洗脱，然后改用250mL乙醚洗脱，收集乙醚洗脱液并脱除溶剂；然后溶于60mL水，加入0. 02mol/L的高碘酸钠溶液进行氧化反应，其中高碘酸钠溶液体积为所得水相体积的10%，反应温度为5°C，反应时间为120min ；浓缩至体积为 lmL，然后加入ImL的0. Olmol/L的腺嘌呤核苷进行衍生化反应，在37°C下反应MOmin ；反应完成后定容至5mL，采用HPLC-FLD方法检测固定相为反相C12填料，流动相为甲醇-水 (20 80，ν/ν)；激发波长为300nm，荧光检测波长为410nm;外标法定量。重复测定10次，得到3-氯-1，2-丙ニ醇的含量为42士8 μ g/kg。加标试验的測定结果表明回收率在93-98% 之间。实施例十称取8g配制酱油，用12mL的5mol/LNaCl溶液混合，上样固相萃取柱， 先用SOmL己烷-乙醚(90 10, ν/ν)洗脱，然后改用250mL乙醚洗脱，收集乙醚洗脱液并脱除溶剂；然后溶于60mL水，加入0. lmol/L的高碘酸钠溶液进行氧化反应，其中高碘酸钠溶液体积为所得水相体积的10%，反应温度为30°C，反应时间为IOmin ；浓缩至体积为lmL，然后加入的0. 5mL 0. 02mol/L的腺嘌呤进行衍生化反应，在100°C下反应IOmin ；反应完成后定容5mL，采用HPLC-FLD方法检测固定相为反相ODS填料，流动相为乙腈-水(10 90, ν/ ν)；激发波长为320nm，荧光检测波长为430nm;外标法定量。重复测定10次，得到3-氯-1， 2-丙ニ醇的含量为86士7 μ g/kg。加标试验的測定结果表明回收率在95-104%之间。实施例i^一 称取8g水解植物蛋白，用12mL的5mol/LNaCl溶液混合，上样固相萃取柱，先用80mL己烷-乙醚(90 10，ν/ν)洗脱，然后改用250mL乙醚洗脱，收集乙醚洗脱液并脱除溶剂；然后溶于60mL水，加入0. 05mol/L的高碘酸钠溶液进行氧化反应，其中高碘酸钠溶液体积为所得水相体积的50%，反应温度为20°C，反应时间为50min ；浓缩至体积为lmL，然后加入0. 6mL的0. 02mol/L的巯基鸟嘌呤核苷酸进行衍生化反应，在80°C下反应60min ；反应完成后定容至5mL，采用HPLC-FLD方法检测固定相为反相C8填料，流动相为甲醇；激发波长为260nm，荧光检测波长为400nm ；外标法定量。重复测定10次，得到 3-氯-1，2-丙ニ醇的含量为157士 11 μ g/kg。加标试验的測定结果表明回收率在93-102% 之间。
权利要求
1.ー种3-氯-1，2-丙ニ醇含量的检测方法，其特征在于包括以下步骤1)氧化将水溶液中的3-氯-1，2-丙ニ醇氧化为氯乙醛；2)衍生化将氯乙醛与衍生试剂反应生成具有荧光效应的物质；3)检测采用HPLC-FLD方法进行检測，即可得出3-氯-1，2-丙ニ醇含量。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在干所述步骤1)中，氧化剂为高碘酸钠， 所述高碘酸钠的浓度为0. 01-0. lmol/L,添加量为所述3-氯_1，2_丙ニ醇水溶液体积的 10-80%，反应温度为5-30°C，反应时间为10-120min。
3.根据权利1所述的方法，其特征在干所述步骤幻中的衍生试剂为以下试剂的一种鸟嘌呤、腺嘌呤、巯基鸟嘌呤、胞嘧啶，其相应核苷及核苷酸。
4.根据权利3所述的方法，其特征在于所述衍生试剂的浓度为0.002-0. 02mol/L，反应温度为37-100°C，反应时间为10-240min。
5.根据权利1所述的方法，其特征在干所述步骤4)中HPLC采用反相色谱模式，固定相为反相0DS、C12或C8填料，流动相为甲醇-水或乙腈-水体系，比例为5%:95% -100% 0% ；FLD激发波长为260-320nm，检测波长为350_470nm。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征在于所述3-氯-1，2-丙ニ醇水溶液经如下步骤处理油脂产品制得1)称取油脂产品质量；2)加入己烷和含NaCl的乙酸溶液进行萃取，弃去上层有机相；3)用己烷重复萃取一次，弃去上层有机相。
7.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征在于所述3-氯-1，2-丙ニ醇水溶液经如下步骤处理固态含油脂产品制得1)称取固态含油脂产品的质量并粉碎；2)加入己烷进行萃取2次以上，合并萃取液；3)加水于合并的萃取液中进行萃取，弃去上层有机相。
8.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征在于所述3-氯-1，2-丙ニ醇水溶液经固相萃取非油脂类产品制得。
9.ー种3-氯-1，2-丙ニ醇脂肪酸酷含量的检测方法，其特征在于包括以下步骤1)酷交換将水溶液中的3-氯-1，2-丙ニ醇脂肪酸酯经酯交換为3-氯-1，2-丙ニ醇；2)氧化将3-氯-1，2-丙ニ醇氧化为氯乙醛；3)衍生化将氯乙醛与衍生试剂反应生成具有荧光效应的物质；4)检测采用HPLC-FLD方法进行检測，可得出3-氯_1，2_丙ニ醇含量；5)折算出3-氯-1，2-丙ニ醇脂肪酸酷的含量。
10.根据权利要求9所述3-氯-1，2-丙ニ醇脂肪酸酷含量的检测方法，其特征在于 所述步骤幻中，氧化剂为高碘酸钠，所述步骤幻中的衍生试剂为鸟嘌呤、腺嘌呤、巯基鸟嘌呤、胞嘧啶，其相应核苷，或其相应核苷酸。
全文摘要
本发明公开了一种3-氯-1，2-丙二醇含量的检测方法，包括如下步骤1)氧化将水溶液中的3-氯-1，2-丙二醇氧化为氯乙醛；2)衍生化将氯乙醛与衍生试剂反应生成具有荧光效应的物质；3)检测采用HPLC-FLD方法进行检测，即可得出3-氯-1，2-丙二醇含量。本发明与现有GC-MS方法相比，方法操作简单，设备投资大大降低，且无需昂贵的氘代标样，极大地降低了使用费用，为相关产品中增加3-氯-1，2-丙二醇检测指标扫清了障碍。本发明还可通过将3-氯-1，2-丙二醇脂肪酸酯经酯交换为3-氯-1，2-丙二醇，从而检测出3-氯-1，2-丙二醇脂肪酸酯的含量。
文档编号G01N30/89GK102565270SQ20121000168
公开日2012年7月11日 申请日期2012年1月5日 优先权日2012年1月5日
发明者张维农, 程鹏, 胡志雄, 齐玉堂 申请人:武汉工业学院