专利名称：白沙蒿尿黑酸叶绿基转移酶(AsHPT)基因及用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一新的基因序列，以及这种基因序列的制备方法和用途，确切讲本发明涉及白沙蒿尿黑酸叶绿基转移酶(AsHPT)及其制备与用途。
背景技术：
维生素E，又被称作生育酚。是一种动物正常繁殖所必须的物质，能抗不育和防止早产、流产，参见宋晓燕，杨天奎“天然维生素E的功能及应用”《中国油脂》2002，25(6) 45-48。维生素E作为饲料添加剂，可以提高动物的免疫力、改善肉质、奶质并提高繁殖能力和缓解动物应激反应参见肖雄.“维生素E的研究与应用”《畜禽业》2002，4:2446。维生素E与人体中枢神经系统，心血管系统有着密切的关系，现代医学证明维生素E可以防治冠心病、高血压、心肌梗塞、血栓等疾病参见Ajjawi I. and Shintani D. "Engineered plants with elevated vitamin E -.a nutraceutical success story"((Trends Biotech)) 2004,22(3) :104-107 ；Vertuani S,Angusti A and Manfredini S."The antioxidants and pro-antioxidants network :An overview.，，《Cur Pharmaceutical Design》2004,10(14) 1677-1694。维生素E还有美容、护肤、防衰老、抗癌等功效，参见雷炳福“我国天然维生素 E产业化前景初探”《中国油脂》2003，28 (4) :49_51。维生素E存在于植物的不同组织包括绿色光合组织和种子等。不同植物中维生素E的组成、含量及总量有着十分大的差异(参见表一)。尿黑酸叶绿基转移酶(HPT)基因是介导维生素E合成的关键酶基因，控制着生育酚总量的合成。GenBank中已公布了拟南芥、木薯、玉米、小麦、葱、芫荽等植物的尿黑酸叶绿基转移酶(HPT)基因的核苷酸序列和氨基酸序列。表1沙蒿油与其他植物油VE含量(单位mg/kg)
权利要求
1.白沙蒿尿黑酸叶绿基转移酶(AsHPT)基因，其特征是其基因序列为SEQ1。
2.权利要求1所述的白沙蒿尿黑酸叶绿基转移酶(AsHPT)基因制备方法，其特征是首先提取白沙蒿的RNA，再反转录为cDNA ；利用GenBank中已公布的其它植物的HPT基因的核苷酸序列和氨基酸序列进行同源性分析，根据保守区设计合成一对简并引物PI、P2 ；以得到的白沙蒿cDNA为模板扩增得到白沙蒿HPT核心片段核苷酸序列；根据测序得到的HPT 基因核心片段序列分别设计白沙蒿HPT基因特异引物5’端外侧引物P3和巢式引物P4， 分别与GeneRacer 试剂盒中自带的5，P和5，NP配对，以白沙蒿cDNA为模板，进行5，外侧和巢式PCR扩增反应，得到5’末端核苷酸序列；同样根据测序得到的白沙蒿HPT基因核心片段序列分别设计白沙蒿HPT基因特异引物3’端外侧引物P5和巢式引物P6，分别与 GeneRacer 试剂盒中自带的3，P和3，NP配对，以白沙蒿cDNA为模板，进行3，外侧和巢式PCR扩增，得到3’末端核苷酸序列；将所得到的三段序列，白沙蒿HPT核心片段核苷酸序列、5’末端核苷酸序列和3’末端核苷酸序列，进行拼接，得到目标基因。
3.权利要求1所述的白沙蒿尿黑酸叶绿基转移酶(AsHPT)基因制备方法，其特征是采用白沙蒿的叶片提取RNA。
4.权利要求2或3所述的白沙蒿尿黑酸叶绿基转移酶(AsHPT)基因制备方法中所用的相关引物，其特征是上游引物Pl为5’ -CACACRRTffATWGGMACWGC-3‘ -3，， 下游引物P2:5’ -YTCWGCRTARAAKAGCTTCC-3‘；P3 为5’ -TACTGCAAATCCTAACACCAAAAACC-3’P4 为5’ TCAGAGCAATGAGACCGGATAACGCC-3，，5’ P 为5’ -CGACTGGAGCACGAGGACACTGA-3’，5’ NP 为5’ -GGACACTGACATGGACTGAAGGAGTA-3’ ；P5 为HPT P3 5' -ATGGTACCGGTACACACAGTCTTGGC-3，，P6 为5’ -AGGGTACTACCGATTTGTATGGAAGC-3’ -3，，3’ P 为5’ -GCTGTCAACGATACGCTACGTAACG-3’，3’ NP 为5’ -CGCTACGTAACGGCATGACAGTG-3，。P7 :5’ -CGTCTAGAATGCTAAACTCAGATGAAAGG-3’P8 :5’ -CGCTCGAGTCAGATGAAAGGAAAAATG-3’其中R = A or G ;Y = C or T ;K = G or T = A or T ;M = A or C。
5.权利要求1所述的白沙蒿尿黑酸叶绿基转移酶(AsHPT)基因在油料作物的转基因工作中的应用。
6.权利要求1所述的白沙蒿尿黑酸叶绿基转移酶(AsHPT)基因在牧草作物的转基因工作中的应用。
7.权利要求1所述的白沙蒿尿黑酸叶绿基转移酶(AsHPT)基因在在除权利要求4或5 所述的植物外的植物中的转基因工作中的应用。
8.权利要求1所述的白沙蒿尿黑酸叶绿基转移酶(AsHPT)基因在在除植物外的其它生物的转基因工作中的应用。
全文摘要
本发明公开白沙蒿尿黑酸叶绿基转移酶(AsHPT)基因的序列，以及这种基因序列的制备方法和用途。白沙蒿尿黑酸叶绿基转移酶(AsHPT)基因的制备是用白沙蒿的RNA反转录为cDNA，再根据其它植物的(AsHPT)基因保守区设计相应的简并引物与巢式引物进行扩增得到白沙蒿尿黑酸叶绿基转移酶(AsHPT)基因的全长翻译区核苷酸序列；利用转基因技术进行的功能验证证明该基因表达可以使烟草叶片和种子维生素E含量分别升高7.6倍和9.8倍。本发明的白沙蒿尿黑酸叶绿基转移酶(AsHPT)基因可用在油料作物、牧草作物以及其它的植物或非植物的转基因工作中。
文档编号C12N15/84GK102367446SQ20111028103
公开日2012年3月7日 申请日期2011年9月10日 优先权日2010年9月10日
发明者傅华, 张一弓, 张丽静, 赵亚民 申请人:兰州大学