专利名称：一种控制水稻籽粒粒长和粒重的半显性基因qGL3的克隆与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及植物基因工程技术领域，涉及一种控制水稻籽粒粒长和粒重的半显性基因qGL3的克隆与应用，具体涉及到一个位于水稻第三染色体长臂上的控制籽粒粒长和粒重的主效半显性基因qGL3的基因克隆和作物改良应用。
背景技术：
随着世界人口的增长，水稻作为主要的粮食作物面临着提高产量的迫切需要。估计到2030年，水稻产量需要提高40%以上才能满足人类的需要。同时，随着人类生活水平的提高，对于水稻的外观品质也提出了越来越高的要求。中国南部、美洲和欧洲国家的人偏向于喜好细长粒型，而中国北部、日本和韩国偏向于喜好短圆粒型(Urmevehr et al., 1992)。为了满足人类的需要，水稻遗传育种学家对水稻的产量和粒型进行了越来越深入的研究。水稻的产量性状是由多基因控制的数量性状，表现为连续变异，受环境的影响较大。在水稻错综复杂的产量因子中，直接构成因子包括粒重、每穗颖花数、有效穗数和结实率。此外，植株高度、分蘖数、穗型、叶型等性状也能间接影响水稻群体的产量。产量的形成是这些众多性状在特定环境条件下共同作用的结果。尽管粒重是受多基因控制的数量性状，但其较高的遗传力说明该性状可以分离出某些主效基因位点。粒重可以分解为粒长、粒宽、粒厚和灌浆密度等多个组分。早在1980 年，Takeda和saito就报道了水稻籽粒长度受单基因LK_f控制；Mckenziedeng (198 报道认为粒长由2-3个或者更多的基因控制。随着计算机技术为基础的数量遗传分析方法的改进和分子标记的大量开发，人们越来越多的借助于QTLs分析方法来研究水稻粒重和粒形。 众多研究者采用不同的遗传群体定位到了有关粒重和粒形的QTL位点约315个(http:// www. gramene. org/，截止2011年9月)，几乎分布于水稻的所有12条染色体上，而对粒重贡献大的QTL集中分布在第2、3、5、6、8等染色体。这其中有的位点很可能有大量的重复，如关于粒长的QTL LK-4(t)、gl-3、gw3. 1、GW3与克隆的GS3处于相同的染色体区间。近十多年来，由于水稻基因组计划的完成，一些水稻粒重、穗粒数、分蘖、株高、株型等水稻产量相关基因得到分离。有多个粒重相关基因被克隆，包括第3染色体上的控制粒长的基因GS3，SRS3和位于第5染色体的Dl ；位于第2染色体上控制粒宽的GW2和第5染色体上的粒宽基因qSW5/GW5。GS3是由范楚川等于2006年利用长粒水稻材料明恢63与短粒材料川7构建的BC3F2群体定位得到的。它是一个位于水稻第三染色体着丝粒附近的跨膜蛋白。GS3存在三种不同截断部位的等位变异，来自于明恢63的位点(截掉所有功能域， 蛋白完全失活)控制长粒型籽粒(9. 91 士0. 10mm，mean士SD)，来自于珍汕97的位点(完整功能的蛋白)形成中等粒(8. 08士0.07mm)，来自于川7的位点(截掉C端TNFR和VWFC功能域，仅保留N端的OSR功能域)形成短粒(6. 30士0. 09mm) (Mao et al.，2010)。GS3对于籽粒长度的调节是通过控制细胞分裂来调节颖壳纵向的细胞数目来调节的(Mao et al.,2010)。Dl是Ashikari等和Fujisawa等(1999)发现的，此基因的功能缺失突变dl会形成不正常的短籽粒，它编码一个G蛋白的a亚基，此类蛋白被认为是激素调控途径处于受体下游的分子开关。SRS3基因是由Kitagawa等Q010)通过突变体的研究发现的。突变基因srs3通过减少颖壳纵向的细胞数目降低谷粒的长度形成不正常的谷粒，它是一个驱动蛋白-13 家族中的一员。GW2(Song et al.，2007)和 GW5/qSW5 (Wan et al.，2008 ；Shomura et al. ,2008)是两个控制水稻籽粒宽度的QTL位点，这两个基因均是功能缺失型突变导致籽粒颖壳横向细胞分离增多，进而导致横向细胞数目的增加形成较宽的籽粒。初步研究证明GW2是一个RING型的E3泛素连接酶，而qSW5/GW5是一个未知功能的蛋白，酵母双杂发现它的一个互作蛋白也是一种多聚泛素，是否两个位点通过同一个泛素蛋白酶体分子途径调节了籽粒的宽度还有待进一步研究。另外一些控制水稻粒重或粒型的QTL位点也到了精细定位可以通过分子标记辅助选择的程度，例如 gw8. l(Xie et al. ,2006), gw9. 1 (Xie et al.，2008)和 GW6 (Guo et al.，2009)，但是还没有获得克隆和进一步的功能验证。在其他粮食作物中关于粒重或者粒型的研究也取得了一定的进展(Gegas et al.，2010)。
发明内容
本发明的目的是从水稻中分离克隆一个同时控制水稻籽粒粒长和粒重的主效QTL 及其优势功能的半显性等位基因的完整编码区段DNA片度，利用这个基因改良水稻的产量和外观品质的能力。同时克隆并证明了此基因在水稻中的两个同源基因同样具有对水稻籽粒长度的调节作用。一种控制水稻籽粒长度和粒重的半显性基因qGL3，核苷酸序列如SEQ ID NO 1所
7J\ ο所述的基因qGL3编码的蛋白，即SEQ ID NO 1中第219 3230位翻译所对应的氨基酸多肽，氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。所述的基因qGL3的优势等位基因qGL3_D，核苷酸序列如SEQ ID NO 3所示。所述的优势等位基因qGL3_D编码的蛋白，由SEQ ID NO 3中第219 3230位翻译所对应的氨基酸多肽，氨基酸序列如SEQ ID N0:4所示。所述基因qGL3在水稻中的同源基因qGL3_Ll，核苷酸序列如SEQ ID NO :5所示， 其编码的蛋白序列如SEQ ID NO 6所示，即SEQ ID NO :5中99 2774位翻译所对应的氨
基酸多肽。所述基因qGL3在水稻中的同源基因qGL3_L2，核苷酸序列如SEQ ID NO :7所示， 其编码的蛋白序列如SEQ ID NO 8所示，即SEQ ID NO :7中78 3107位翻译所对应的氨
基酸多肽所述的基因qGL3在作物遗传改良中的应用，优选在改良作物粒长和/或粒重中的应用。所述的基因qGL3_D在作物遗传改良中的应用，优选在改良作物粒长和/或粒重中的应用。所述的基因qGL3_Ll在作物遗传改良中的应用，优选在改良作物粒长和/或粒重中的应用。
所述的基因qGL3_L2在作物遗传改良中的应用，优选在改良作物粒长和/或粒重中的应用。本发明的有益效果 (1)申请者于2005年从水稻地方品种资源材料中发现一份大粒粳稻种质N411，其千粒重达71. 1 士0. 22克。随后分别与小粒籼稻家系05-643、中粒型品种93-11正反杂交以及回交，对粒重及其相关性状展开研究。初步的研究表明，粒重相关性状没有细胞质效应。 通过N411/05-643 F2群体的QTL分析，在SSR分子标记冊6沈6_冊3350区间检测到1个贡献率达52. 5%的主效粒长QTL :qGL3,该位点同时对粒重贡献率达31 %，此位点物理位置位于已经报道的粒长控制基因GS3的下游8. 5Mb左右，序列分析表明N411、05-643、93-ll与明恢63具有相同的GS3突变位点。从F2选择携有冊6沈6-冊3350大粒亲本标记型的个体与05-643、93-11分别回交，进一步通过对93-11回交产生的BC2F2群体的QTL分析确认了这一位点对于粒长和粒重的单因子遗传效应。在此基础上利用籽粒长度出现单因子分离的四个回交BC2F3群体，将qGL3定位在Indel标记xj39和xj26之间约46. 6kb的区间内(图 4)。对此区段内的两个预测表达基因在两个亲本中进行克隆测序比较发现，其中一个基因的cDNA序列在两亲本间没有差异。而另外的一个基因在大粒亲本N411和小粒亲本 93-11间存在两处突变。具体为来自于大粒亲本N411的位点(SEQ ID NO 3)与来自于小粒亲本93-11的位点(SEQ ID No. 1)相比一处位于cDNA序列的5、UTR区域的-72位置存在一个单碱基G的缺失；另一处位于第10个外显子上的编码区+1092位置的一个单核苷酸替换C — A，进而导致蛋白质一个氨基酸的替换364位的天冬氨酸(Asp，D)转变成了谷氨酸(Glu，E)，D364E;将该发生两处突变的基因命名为qGL3_D。对两个基因在背景亲本和近等基因系间的表达比较发现，两个基因在亲本和近等基因系间不存在表达差异。将存在序列差异的基因定为qGL3的候选基因。对此基因的结构和编码蛋白产物的预测和分析，发现该基因由21个外显子和20个内含子构成。编码区长度为3012bp，编码1003个氨基酸的多肽。根据蛋白质功能域预测发现其编码的多肽是一个含有2个kelch重复结构域的丝氨酸 /苏氨酸磷酸(酯)酶。在水稻中，此基因是由三个同源基因构成的小家族，申请人将其分别命名为 qGL3(SEQ ID NO 1)、qGL3_Ll (SEQ ID NO :5)和 qGL3_L2 (SEQ ID NO :7)。对来自两个亲本的等位基因进一步分析发现，其优势等位基因qGL3_D位于蛋白364位的天冬氨酸(Asp，D)转变成了谷氨酸(Glu，Ε)，D364E，此突变恰好发生在结构域kelch的保守基序 AVLDT的D位置上(图5)。对qGL3及其另外两个同源基因qGL3_Ll和qGL3_L2的Real-Time PCR表达分析发现，该家族基因在水稻的根、茎、叶片、叶鞘、穗子的不同发育时期组织中表达，优势表达在穗发育的中后期(图6)。通过将此基因的启动子(SEQ ID NO 9)连接⑶S 基因进行的转基因启动子⑶S表达活性分析，同样印证了 Real-Time PCR的结果，同时可以发现qGL3在根尖、茎的维管组织、叶片的中脉、叶鞘的外围、顶点生长点、未成熟颖壳的基部、成熟的颖壳中，以及雌蕊的基部优势表达，而不再成熟的花药中表达(图7)。通过对此基因编码蛋白的在洋葱表皮中的亚细胞定位发现野生型的蛋白(如SEQ ID N0:2所示) 分布于整个细胞质中，在细胞核中未有优势分布，而突变后的蛋白(如SEQ ID N0:4所示) 分布于细胞质中，同时优势分布于细胞核中(图8)。推断此基因编码的蛋白的亚细胞定位的改变是其发挥不同作用的关键。将野生型基因qGL3(序列如SEQ ID NO :1所示)完整
5阅读框连接到过表达载体PCAMBIA-1300S中，转化水稻品种中花11中，转基因Ttl代和转基因T1代超表达阳性单株均表现出变短的粒型，而对穗型和株型没有显著影响(图10)。同时将此基因编码的两个预测的功能域分别截断，如图12，两个截断后多肽存在中间连接区 296个氨基酸的跨叠，构建过表达载体转化水稻品种中花11，OX-Kelch转基因Ttl代阳性过表达植株表现出变短的粒型而0X-PP2AC转基因Ttl代阳性过表达植株的粒型没有发生变化 (图12)。这说明在对水稻籽粒长度的调节功能主要来自于kelch结构域，而与PP2Ac结构域关系不大。在水稻品种中花11中对目标基因的RNAi干涉Ttl代转基因阳性单株及其1\ 代转基因阳性单株分析发现，表达抑制植株的籽粒都发生了变小(图10)。同时对其中一个同源基因qGL3_Ll的插入敲除突变体的表型分析发现qGL3_Ll 的功能完全缺失导致籽粒明显变小，同时对qGL3_Ll和qGL3_L2的过表达转基因Ttl代表型分析发现过表达qGL3的同源基因qGL3_Ll和qGL3_L2可以微弱使水稻的籽粒增长，图13D。 这说明qGL3及其同源基因qGL3_Ll和qGL3_L2在调节水稻籽粒长度上具有类似的功能。通过分子标记选择获得的以93-11为背景导入来自大粒亲本N411的等位基因 qGL3-D的近等基因系93-llNIL-qGL3_D分析发现基因qGL3的优势等位变异qGL3_D (如 SEQ ID N0:3所示)对于水稻除了使籽粒变长，粒重增加之外，对于其他的农艺表型没有统计学上的改变(如表2 ；图13)。同时利用此近等基因系93-llNIL-qGL3-D与93-11杂交和作为两系杂交稻恢复系与两系不育系广占63S构建的杂交组合的获得F1的粒型分析发现， 来自于大粒亲本的等位变异在杂合状态下同样可以使籽粒长度增加(图14)。同时对水稻品种热研背景的近等基因系(GS3的短粒等位背景gU)和水稻品种龙里黑糯的近等基因系 (Dl的短粒等位背景dl)分析发现，qGL3可以掩盖gs3和dl使籽粒长度缩短的效果(图 15)。综上结果说明野生型粒长控制基因qGL3(SEQ ID NO 1)在中花11背景下，无论发生上调还是下调都会使籽粒变短变小。而qGL3的优势等位变异基因qGL3_D (SEQ ID NO 3)发生在kelch结构域中的保守基序AVLDT的D位置上的天冬氨酸(Asp，D)转变成了谷氨酸(Glu，E)，引起了此基因编码的蛋白从胞质大量的进入细胞核中，进而发挥了使水稻籽粒变长的功能，这是一种功能获得性的突变。同时证明了 qGL3在水稻中的两个同源基因 qGL3-Ll和qGL3_L2同样具有对水稻籽粒粒长和粒重的调节功能。并且qGL3的优势等位基因qGL3_D(SEQ ID NO 3)作为一个控制水稻籽粒长度的遗传学下游基因，可以很好的拯救上游基因如gs3，dl等的负调控作用，同时半显性特性使其可以用于恢复系的改良进而用于杂交稻育种。(2)本发明中克隆的上述基因为水稻等谷类作物的高产优质育种提供了新的基因资源，也为其他作物中克隆相关基因提供了技术借鉴，也可以为水稻、小麦、玉米、高梁等禾谷类作物以及大豆、油菜等双子叶作物的分子进化研究提供证据。
图1 本发明使用的总体技术路线图。图2 利用N411和05-643构建的分子标记遗传图谱及定位的QTLs。图3 :N411与93_11构建的精细定位群体BC2F3中随机206株籽粒表型次数分布图，填充样式显示qGL3位点的基因型。
6
图4 :qGL3的精细定位过程图，A.所示四68个个体中标记间的重组个体数目； B.所示进一步更小区间的重组个体数目；C.所示表型与基因型间的高精度连锁分析；D.所示根据日本晴基因组注释所示标记xj39和间的物理距离。图5 禾本科代表植物和拟南芥中qGL3同源基因家族的kelch结构域部分蛋白比对，箭头表示大粒亲本N411中qGL3_D的等位变异D364E。图6 :qGL3及其同源基因qGL3_Ll和qGL3_L2的半定量表达分析和实时定量 Real-Time PCR 表达分析。A.所示半定量表达分析，B.所示实时定量表达分析；其中R:根，C:茎，LB:叶片， LS 叶鞘、PP :2cm-3cm的初级穗，YP :8cm-10cm幼穗，MP 刚要抽出的成熟穗子，YL 未抽出的幼叶。图7 :qGL3基因启动子⑶S表达活性分析。图8 :qGL3基因野生型和优势等位蛋白的亚细胞定位。93-1 l-qGL3-GFP表示qGL3基因野生型蛋白的亚细胞定位图，N41 l_qGL3-D_GFP表示qGL3基因突变后的优势等位蛋白的亚细胞定位。图 9 过表达转基因载体 pCAMBIA-1304、pCAMBIA_1300S 和 RNA 干涉载体 pCK303 的结构酶切位点图。其中，A为pCAMBIA-1304的结构酶切位点图，B为pCAMBIA_1300S的结构酶切位点图，C为pCK303的结构酶切位点图。图10 过表达和RNAi干涉转基因株系的表达情况检测。其中，A为半定量表达分析结果图，B为实时定量表达分析结果统计图。图11 野生型基因过表达和RNAi干涉转基因株系农艺表型及穗子、籽粒表型。其中，A为野生型基因过表达和RNAi干涉转基因株系农艺表型；B为野生型基因过表达和RNAi干涉转基因株系穗子表型；C为野生型基因过表达和RNAi干涉转基因株系籽粒表型。图12 截断功能域的过表达转基因载体构建所对应的多肽，以及转基因植株对应的籽粒表型。A为截断功能域的过表达转基因载体构建所对应的多肽示意图；B为转基因植株对应的籽粒表型；其中0X_qGL3表示qGL3的过表达转基因载体构建所对应的多肽示意图，OX-kelch表示qGL3中的kelch功能域过表达转基因载体构建所对应的多肽示意图， 0X-PP2AC表示qGL3中的PP2Ac功能域过表达转基因载体构建所对应的多肽示意图。图13 :qGL3-Ll插入敲除突变体的植株和籽粒表型，以及同源基因qGL3_Ll和 qGL3-L2过表达转基因植株的籽粒表型。其中，A为野生型东津DJ和突变体qgl3_ll的植株表型，B为野生型东津DJ和突变体qgl3_ll的穗子表型，C为野生型东津DJ和突变体qgl3_ll的籽粒表型，D为qGL3的同源基因qGL3_Ll和qGL3_L2过表达转基因植株的籽粒表型；中花11为受体亲本。图14 :qGL3处于水稻品种热研B背景下的近等基因系(GS3的短粒等位背景gs3) 和水稻品种龙里黑糯的近等基因系(Dl的短粒等位背景dl)籽粒。图15 背景亲本93-11和近等基因系93-llNIL-qGL3_D的株型、穗子、及籽粒表型对照图。A为背景亲本93-11和近等基因系93-llNIL-qGL3-D的株型对照图，B为背景亲本93-11和近等基因系93-1 lNIL-qGL3-D的穗子对照图，C为背景亲本93_11和近等基因系93-llNIL-qGL3_D的籽粒表型对照图。图16 :93-11及近等基因系93-llNIL-qGL3_D以及它们与两系不育系广占63S配置的杂交稻穗子和籽粒的比较。其中A为93-11及近等基因系93-llNIL-qGL3_D以及它们与两系不育系广占63S 配置的杂交稻穗子的比较图；B为93-11及近等基因系93_1 lNIL_qGL3_D以及它们与两系不育系广占63S配置的杂交稻籽粒的比较图。
具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解为，这些具体的实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未标明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆实验室指南(New York =Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照各公司销售产品所建议的条件。其中用到的SSR分子标记RM系列除特殊说明外，都按照gramene (http://www. gramene. org/)网站公布的序列合成。实施例1水稻粒长基因qGL3的分离与获得(一 )材料与方法1.大粒种质N411与05-643、93-11杂交群体的构建(具体流程参见图1)(1)利用水稻大粒种质N411 (由南京农业大学水稻所种质库保存，其优势等位基因可以从南农籼5号中获得，品种申请受理号20110730.0)作为有利基因的供体材料，与 05-643(由水稻品种粤丰B和龙特普B杂交选育而成)、93-11杂交，种植杂交种，自交获得 K。将&自交获得的种子种植成单株构成F2群体，用于定位粒长、粒重QTL。(2) F2群体中选择籽粒较长的单株连续回交给05-643或93_11，回交高代BCF2群体用于精细定位主效粒长、粒重QTL。2.主效粒长QTL分子定位与标记开发方法(1)用SDS法提取群体各株系DNA(具体方法参见分子克隆实验室指南(New York :Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989))。(2)首先用 976 对 SSR 引物(根据 gramene :http://www. gramene. org/,网站公布的序列合成)对大粒种质N411和品种05-643、93-11亲本的DNA多态性进行初步分析。获得亲本间有多态的标记用于构建遗传连锁图谱。(3) PCR 反应体积为 10 微升，其中 10 Xbufferl 微升，带有 2. 5mM MgCl2Wbufferl 微升，2. 5mMdNTPs 0. 1微升，Taq酶(5单位/微升)0. 1微升，模板DNA 1微升，加水至10 微升。SSR反应程序为95 V预变性5min后，95 °C变性30s，50-58 V退火30s，72 V延伸展 30s，循环35次，最后72°C延伸10min，4度保存。在PCR扩增仪上进行PCR扩增，扩增产物在8%非变性聚丙烯酰胺凝胶(100ml聚丙烯酰胺溶液中含7. 6克丙烯酰胺和0. 4克甲叉双丙烯酰胺)上进行电泳分离，然后银染，照相，统计结果。利用多态性标记通过F2分离群体建立连锁图，分析谷粒的粒型和粒重QTLs。(4)标记开发在初定位目标区域内设计新的InDel标记从水稻基因组数据库网站下载目标基因所在定位区间的水稻基因组公布序列，根据日本晴和93-11的基因组序列比对差异，设计InDel标记(见表1)。
表1.初定位目标区域内设计新的InDel标记
权利要求
1.一种控制水稻籽粒长度和粒重的半显性基因qGL3，核苷酸序列如SEQ ID N0:1所
2.权利要求1所述的基因qGL3编码的蛋白，氨基酸序列如SEQID N0:2所示。
3.权利要求1所述的基因qGL3的优势等位基因qGL3_D，核苷酸序列如SEQID NO 3 所不。
4.权利要求3所述的优势等位基因编码的蛋白，序列如SEQID N0:4所示。
5.权利要求1所述基因qGL3在水稻中的同源基因qGL3_Ll，序列如SEQID NO 5所示，其编码的蛋白序列如SEQ ID NO 6所示。
6.权利要求1所述基因qGL3在水稻中的同源基因qGL3_L2，序列如SEQID NO :7所示，其编码的蛋白序列如SEQ ID N0:8所示。
7.权利要求1所述的基因qGL3在作物遗传改良中的应用，优选在改良作物粒长和/或粒重中的应用。
8.权利要求3所述的基因qGL3_D在作物遗传改良中的应用，优选在改良作物粒长和/ 或粒重中的应用。
9.权利要求5所述的基因qGL3_Ll在作物遗传改良中的应用，优选在改良作物粒长和/或粒重中的应用。
10.权利要求6所述的基因qGL3_L2在作物遗传改良中的应用，优选在改良作物粒长和/或粒重中的应用。
全文摘要
本发明涉及植物基因工程技术领域，公开了一种控制水稻籽粒粒长和粒重的半显性基因qGL3的克隆与应用。本发明从水稻中分离克隆一个同时控制水稻籽粒粒长和粒重的主效QTL SEQ ID NO1及其优势功能的半显性等位基因SEQ ID NO3，这两个基因具有改良水稻的产量和外观品质的能力。同时克隆并证明了此基因在水稻中的两个同源基因同样具有对水稻籽粒长度的调节作用。因此基因qGL3、其优势等位基因qGL3-D以及基因qGL3的两个同源基因qGL3-L1、qGL3-L2均可在作物遗传改良中应用。
文档编号C12N9/16GK102352367SQ201110325278
公开日2012年2月15日 申请日期2011年10月24日 优先权日2011年10月24日
发明者唐海娟, 张晓军, 张红生, 王建飞, 王才林, 蓝虹霞 申请人:南京农业大学