专利名称：新型脂肪酶的制作方法
技术领域：
本发明涉及新型脂肪酶。本脂肪酶由Tetrasphaera属的新株的菌体产生。本脂肪酶可将中链脂肪酸及/或长链脂肪酸作为底物识别。本脂肪酶可通过阴离子交换树脂、 疏水性树脂吸附固定，可作为固定化酶使用。本脂肪酶在消化药、芳香剂制造、临床检验试剂、洗涤剂用酶、油脂制造、农药·医药品的光学活性中间体制造等领域中有利用价值。
背景技术：
已证明脂肪酶是在各种酯的合成和分解、酯交换、外消旋体的光学拆分时优异的生物催化剂，实际上已在消化药、芳香剂制造、临床检验试剂、洗涤剂用酶、油脂制造、农药·医药品的光学活性中间体制造上使用。脂肪酶中众所周知的是动物的胰脂肪酶，而工业上经常使用的是主要来自微生物的脂肪酶。这些脂肪酶的大多数的基因已被克隆，氨基酸序列也已知(Candida rugosa 非专利文献1。Rhizopus delemar 非专利文献2。Bacillus subtilis 非专利文献3。 Staphylococcus aureus 专禾文■ 4。 Pseudomonas aeruginosa 专禾文■ 5)。丝状菌、芽孢杆菌属(Bacillus)、葡萄球菌属(Mapylococcus)、假单胞菌属 (Pseudomonas)等产生的脂肪酶已在工业上使用。这些脂肪酶基本上以高级脂肪酸(碳数为16以上的脂肪酸)作为底物，以短链脂肪酸(碳数6以下)作为底物的是酯酶。可充分识别中链脂肪酸，不仅显示水解活性，还显示酯化活性的脂肪酶还不为人所知。中链脂肪酸结合的甘油三酯不仅被胰脂肪酶水解，还被胃脂肪酶水解，在甘油三酯的消化·吸收上也显示优势(非专利文献6)。且中链脂肪酸被吸收后，在小肠的肠道细胞中很少再合成甘油三酯，而是从门静脉运送到肝脏，作为能量燃烧。另一方面，高级脂肪酸在肠道细胞中再合成，由淋巴吸收运送到肝脏，有时作为脂肪积累。即，高级脂肪酸有体内积累性，中链脂肪酸无积累性。这样，通过中链脂肪酸甘油三酯和通常的食用油脂之间的酯交换来制造有益于健康的油旨。非专利文献1 Kawaguchi et al.，Nature，341，164-166 (1989)非专利文献2 Haas et al.，Gene，109，107-113 (1991)非专利文献3 Dartois et al.，B. B. A.，1131，253-260 (1992)非专利文献4 Lee et al.，J. Bacteriol.，164，288-293 (1985)非专利文献5 Wohlfarth et al. , J. General Microbiology, 138,1325-1335, (1992)非专利文献6 I. Ikeda, Y. Tomari,M. Sugano, S. ffatanabe, and J. Nagata :Lipids, 26,369-373(1991)
发明内容
但是，至今为止在工业上用脂肪酶还未制造出非甘油三酯的中链脂肪酸酯。因中链脂肪酸无脂肪积累性，所以，用中链脂肪酸酯化的食品材料成为不易产生肥胖等问题的材料。本发明者对脂肪酶进行了锐意研究，且从Tetrasphaera属新株的菌体培养上清中分离·精制出分子量约为32kDa及约为40kDa的新型脂肪酶，且进一步发现这些脂肪酶是以中链脂肪酸作为底物充分识别的新型物质，从而完成了本发明。I.新型脂肪酶本发明提供如下多核苷酸，其是编码属于Tetrasphaera属(优选与"Tetrasphaera属NITE P-IM菌株属于同种，更优选为Tetrasphaera属NITEP-IM菌株)的菌产生的、分子量约为32kDa的脂肪酶的多核苷酸或其同源物，即含有下述(A1)、(B1)、(C1)、(D1)、(E1)、(F1)或(G1)的多核苷酸(A1)多核苷酸，其由序列号10中记载的碱基序列的全部或至少包含25 801位的碱基序列的部分组成；(B1)多核苷酸，其与(A1)中记载的多核苷酸碱基序列的互补碱基序列组成的多核苷酸在严谨条件下杂交，且编码具有脂肪酶活性的蛋白质；(C1)多核苷酸，其由(A1)中记载的多核苷酸的碱基序列中1个或多个碱基发生取代、缺失、插入及/或附加的碱基序列组成，且编码具有脂肪酶活性的蛋白质；(D1)多核苷酸，其与(A1)中记载的多核苷酸的碱基序列有至少80%以上的同一性，且编码具有脂肪酶活性的蛋白质；(E1)多核苷酸，其编码由序列号11中记载的氨基酸序列组成的蛋白质；(F1)多核苷酸，其编码由序列号11中记载的氨基酸序列中1个或多个氨基酸发生取代、缺失、插入及/或附加的氨基酸序列组成，且具有脂肪酶活性的蛋白质；(G1)多核苷酸，其编码由与序列号11中记载的氨基酸序列有至少80%以上同一性的氨基酸序列组成，且具有脂肪酶活性的蛋白质。序列号10表示编码iTetrasphaera属NITE P-154菌株产生的分子量约为32kDa的脂肪酶的多核苷酸的碱基序列，序列号11表示同一脂肪酶的氨基酸序列。且序列号15表示含有编码同一脂肪酶的多核苷酸的基因组DNA的碱基序列，序列号16表示包含序列号11的上游序列的氨基酸序列。本说明书中，序列号10中“25 801位的碱基序列”，除特殊情况外，可与序列号15中“388 1164位的碱基序列”互换，本说明书中，“序列号11的氨基酸序列”，除特殊情况夕卜，可与“序列号16的48 306位的氨基酸序列”互换。本发明中，由序列号10中记载的至少包含25 801位的碱基序列的部分组成的多核苷酸，可用由序列号15的碱基序列中至少包含388 1164位的碱基序列的部分组成的多核苷酸(例如，由序列号15的碱基序列的247 1167位的碱基序列组成的部分组成的多核苷酸)代替；且由序列号11中记载的氨基酸序列组成的蛋白质(或编码该蛋白质的多核苷酸)，可用序列号16的氨基酸序列的全部或一部分组成的蛋白质(优选32 306位的氨基酸序列，更优选48 306位的氨基酸序列组成的蛋白质)所组成的蛋白质(或编码该蛋白质的多核苷酸)代替。此种情况也包含在本发明的范围内。序列号16的第1 47位的氨基酸序列可认为是前原序列。推测第1 31位作为分泌信号即前序列起作用，第32 47位是在分泌后，大概是通过其它蛋白质的作用被切断的原序列。因此，为作为脂肪酶起作用，必须的成熟蛋白质应是第48位以后的序列，在大肠杆菌等异种表达系统中使同一脂肪酶表达时，除去前原序列使其表达更为适合。编码本发明的分子量约为32kDa的脂肪酶的多核苷酸或其同源物的优选例如下·多核苷酸，其是下述(A/ )、(B/ )、(C/ )、(D1，)、(E1，)、(F/ )或(G1，)，(A/ )多核苷酸，其是序列号10中记载的碱基序列的全部或25 801位的碱基序列组成的部分；(B/ )多核苷酸，其与(A/ )中记载的多核苷酸碱基序列的互补碱基序列组成的多核苷酸在严谨条件下杂交，且编码具有脂肪酶活性的蛋白质；(C/ )多核苷酸，其由(A/ )中记载的多核苷酸的碱基序列中1个或多个碱基发生取代、缺失、插入及/或附加的碱基序列组成，且编码具有脂肪酶活性的蛋白质；(D/ )多核苷酸，其与(A/ )中记载的多核苷酸的碱基序列有至少80%以上的同一性，且编码具有脂肪酶活性的蛋白质；(E/ )多核苷酸，其编码由序列号11中记载的氨基酸序列组成的蛋白质；(F/)多核苷酸，其编码由序列号11中记载的氨基酸序列中1个或多个氨基酸发生取代、缺失、插入及/或附加的氨基酸序列组成，且具有脂肪酶活性的蛋白质；(G/ )多核苷酸，其编码由与序列号11中记载的氨基酸序列有至少80%以上同一性的氨基酸序列组成，且具有脂肪酶活性的蛋白质。·多核苷酸，其含有下述(A2)、(B2)、(C2)、(D2)、(E2)、(F2)或(G2)(A2)多核苷酸，其由序列号15中记载的碱基序列的全部或至少包含247 1167位的碱基序列或388 1164位的碱基序列的部分组成；(B2)多核苷酸，其与(A2)中记载的多核苷酸碱基序列的互补碱基序列组成的多核苷酸在严谨条件下杂交，且编码具有脂肪酶活性的蛋白质；(C2)多核苷酸，其由(A2)中记载的多核苷酸的碱基序列中1个或多个碱基发生取代、缺失、插入及/或附加的碱基序列组成，且编码具有脂肪酶活性的蛋白质；(D2)多核苷酸，其与(A2)中记载的多核苷酸的碱基序列有至少80%以上的同一性，且编码具有脂肪酶活性的蛋白质；(E2)多核苷酸，其编码由序列号16中记载的氨基酸序列的全部或至少包含48 306位的氨基酸序列的部分组成的蛋白质；(F2)多核苷酸，其编码由(E2)中记载的蛋白质的氨基酸序列中1个或多个氨基酸发生取代、缺失、插入及/或附加的氨基酸序列组成，且具有脂肪酶活性的蛋白质；(G2)多核苷酸，其编码由与(E2)中记载的蛋白质的氨基酸序列有至少80%以上同一性的氨基酸序列组成，且具有脂肪酶活性的蛋白质。·多核苷酸，其是下述(A/ )、(B2' )、(C2，)、(D2，)、(E2' )、(F2，)或(G2')(A2')多核苷酸，其是序列号15中记载的碱基序列的全部或247 1167位的碱基序列或388 1164位的碱基序列组成的部分。(B2')多核苷酸，其与(A2’ )中记载的多核苷酸碱基序列的互补碱基序列组成的多核苷酸在严谨条件下杂交，且编码具有脂肪酶活性的蛋白质；
(C2')多核苷酸，其由(A2’ )中记载的多核苷酸的碱基序列中1个或多个碱基发生取代、缺失、插入及/或附加的碱基序列组成，且编码具有脂肪酶活性的蛋白质；(D2’ )多核苷酸，其与(A2，)中记载的多核苷酸的碱基序列有至少80%以上的同一性，且编码具有脂肪酶活性的蛋白质；(E2’ )多核苷酸，其编码序列号16中记载的氨基酸序列的全部或至少包含48 306位的氨基酸序列的部分组成的蛋白质；(F2')多核苷酸，其编码由(E2’ )中记载的蛋白质的氨基酸序列中1个或多个氨基酸发生取代、缺失、插入及/或附加的氨基酸序列组成，且具有脂肪酶活性的蛋白质；(G2')多核苷酸，其编码由与(E2’ )中记载的蛋白质的氨基酸序列有至少80%以上同一性的氨基酸序列组成，且具有脂肪酶活性的蛋白质。本发明还提供如下多核苷酸，其是编码属于Tetrasphaera属(优选与Tetrasphaera属NITE P-154菌株属于同种,更优选Tetrasphaera属NITEP-154菌株)的菌产生的、分子量约为40kDa的脂肪酶的基因或其同源物，即含有下述(H2)、(I2)、(J2)、(K2)、(L2)、(M2)或(N2)的多核苷酸(H2)多核苷酸，其由序列号28中记载的碱基序列的全部或至少包含414 1688位的碱基序列或498 1685位的碱基序列的部分组成；(I2)多核苷酸，其与(H2)中记载的多核苷酸碱基序列的互补碱基序列组成的多核苷酸在严谨条件下杂交，且编码具有脂肪酶活性的蛋白质；(J2)多核苷酸，其由(H2)中记载的多核苷酸的碱基序列中1个或多个碱基发生取代、缺失、插入及/或附加的碱基序列组成，且编码具有脂肪酶活性的蛋白质；(K2)多核苷酸，其与(H2)中记载的多核苷酸的碱基序列有至少80%以上的同一性，且编码具有脂肪酶活性的蛋白质；(L2)多核苷酸，其编码由序列号29中记载的氨基酸序列的全部或至少包含四 4M位的氨基酸序列的部分组成的蛋白质；(M2)多核苷酸，其编码由(L2)中记载的蛋白质的氨基酸序列中1个或多个氨基酸发生取代、缺失、插入及/或附加的氨基酸序列组成，且具有脂肪酶活性的蛋白质；(N2)多核苷酸，其编码由与(L2)中记载的蛋白质的氨基酸序列有至少80%以上同一性的氨基酸序列组成，且具有脂肪酶活性的蛋白质。序列号J8表示编码iTetrasphaera属NITE P-154菌株产生的分子量约为40kDa的脂肪酶的基因的碱基序列，序列号 表示同一脂肪酶的氨基酸序列。编码本发明的分子量约为40kDa的脂肪酶的多核苷酸或其同源物的优选例如下·多核苷酸，其是下述(H2，)、(I/ )、(J2，)、OV )、(V )、(M2，)或(N2，)(H2')多核苷酸，其是由序列号28中记载的碱基序列的全部或414 1688位的碱基序列或498 1685位的碱基序列组成的部分；(I2')多核苷酸，其与(H/ )中记载的多核苷酸碱基序列的互补碱基序列组成的多核苷酸在严谨条件下杂交，且编码具有脂肪酶活性的蛋白质；(J2')多核苷酸，其由(H/ )中记载的多核苷酸的碱基序列中1个或多个碱基发生取代、缺失、插入及/或附加的碱基序列组成，且编码具有脂肪酶活性的蛋白质；(K2')多核苷酸，其与(H/ )中记载的多核苷酸的碱基序列有至少80%以上的同一性，且编码具有脂肪酶活性的蛋白质；(L2')多核苷酸，其编码的是序列号29中记载的氨基酸序列的全部或四 4 位的氨基酸序列组成的部分的蛋白质；(M2')多核苷酸，其编码由(L2’ )中记载的蛋白质的氨基酸序列中1个或多个氨基酸发生取代、缺失、插入及/或附加的氨基酸序列组成，且具有脂肪酶活性的蛋白质；(N2')多核苷酸，其编码由与(L2’ )中记载的蛋白质的氨基酸序列有至少80%以上同一性的氨基酸序列组成，且具有脂肪酶活性的蛋白质。本说明书所述的“脂肪酶”，除特殊情况外，指水解甘油酯，使脂肪酸游离的酶。本说明书中，称某种蛋白质“具有脂肪酶活性”时(或称为“脂肪酶”时)，除特殊情况外，该蛋白质(或脂肪酶)至少具有水解甘油和脂肪酸形成的酯的活性，优选具有水解与中链脂肪酸形成的酯及/或与长链脂肪酸形成的酯的活性，更优选具有与中链脂肪酸形成的酯及与长链脂肪酸形成的酯的活性。具有脂肪酶活性的蛋白质(或脂肪酶)优选具有催化脂肪酸的转移反应(酯化反应或酯交换反应)的活性，优选具有催化中链脂肪酸的转移反应的活性。某种蛋白质是否具有水解甘油与中链脂肪酸或长链脂肪酸形成的酯的活性，例如，可通过供给测定如本说明书实施例中所述的4-甲基伞形酮辛酯(MU-C8)或4-甲基伞形酮基油酸酯(MU-C18)的分解活性的试验来进行评价。且某种蛋白质是否具有催化中链脂肪酸的转移反应的活性，例如，可通过供给如本说明书实施例中所述的3-苯基-1-丙醇或1-苯基-2-丙醇与三辛酸甘油酯(MCT)的酯化反应实验来进行评价。本说明书中，除特殊情况外，某种蛋白质(或脂肪酶)具有水解某种脂肪酸的酯的活性时或具有催化某种脂肪酸的转移反应的活性时，也将其脂肪酸称为“可作为底物识别”。证实了本发明的属于iTetrasphaera属(优选与iTetrasphaera属NITEP-1M菌株属于同种，更优选ktrasphaera属NITE P-IM菌株)的菌产生的、分子量约为32kDa的蛋白质及分子量约为40kDa的蛋白质，至少具有4-甲基伞形酮辛酯(MU-C8)的分解活性，后者进一步具有4-甲基伞形酮基油酸酯(MU-C18)的分解活性，且可由三辛酸甘油酯及3-苯基-1-丙醇或1-苯基-2-丙醇分别生成正辛酸酯(参照实施例1)。因此，两者均可具有脂肪酶活性，更加详细地说，可以说前者具有水解与中链脂肪酸形成的酯的活性(可将中链脂肪酸作为底物识别)，后者具有水解与中链脂肪酸及长链脂肪酸形成的酯的活性(可将中链脂肪酸及长链脂肪酸作为底物识别)，且具有催化中链脂肪酸的转移反应(特别是酯化反应)的活性。本说明书中的“中链脂肪酸”，除特殊情况外，指碳数为7 15的饱和脂肪酸或不饱和脂肪酸。中链脂肪酸中包含正辛酸、癸酸及十二烷酸。本说明书中的“长链脂肪酸”，除特殊情况外，指碳数为16以上的饱和脂肪酸或不饱和脂肪酸。长链脂肪酸中包含棕榈酸、硬脂酸、棕榈烯酸、油酸、亚油酸、α-亚麻酸及Y-亚麻酸。本说明书中涉及甘油和脂肪酸，为“酯”时，除特殊情况外，不只是三酰甘油，还可以是二酰甘油或单酰甘油(有时也将后二者合起来称为部分酰基甘油。本发明中所述的“严谨条件”，除特殊情况外，指6Μ尿素、0.4%SDS、0.5XSSC的条件或与其同等的杂交条件，且根据需要，本发明中也可适用严谨性更高的条件，例如6M尿素、0.4% SDS,0. IXSSC或与其同等的杂交条件。在各种条件中，温度可约为40°C以上，如需要严谨性更高的条件时，例如可约为50°C，进一步可约为65°C。且本发明中，进行“1个或多个碱基发生取代、缺失、插入及/或附加的碱基序列”时的取代等的核苷酸的个数，只要其碱基序列组成的多核苷酸编码的蛋白质具有所需功能，无特别限定，可以是1 9个或1 4个的程度，如是编码同一或性质相似的氨基酸序列的取代等，也可有更多个数的取代等。且本发明中，进行“1个或多个氨基酸发生取代、缺失、插入及/或附加的氨基酸序列”时被取代等的氨基酸的个数，只要具有该氨基酸序列的蛋白质具有所需功能，无特别限定，可为1 9个或1 4个的程度，如是对性质相似的氨基酸取代等，也可有更多个数的取代等。用于制备与此种碱基序列或氨基酸序列有关的多核苷酸的方法，为本领域技术人员所周知。对于碱基序列，高的同一性是指至少50%以上、优选70%以上、更优选80%以上、进一步优选90%以上、最优选95%以上的序列同一性。对于氨基酸序列，高的同一性是指至少50%以上、优选70%以上、更优选80%以上、进一步优选90%以上、最优选95%以上的序列同一性。序列号11中记载的氨基酸序列与公知脂肪酶的氨基酸序列之间的同一性，如实施例的表4所示。此外，序列号28中记载的氨基酸序列与公知序列之间的同一性，如实施例8所述。对于多核苷酸序列或氨基酸序列同一性的检索·分析，可根据本领域技术人员周知的算法或程序(例如，BLASTN、BLASTP, BLASTX, Clustalff)进行。使用程序时的参数，只要是本领域技术人员均可适当设定，也可使用各程序的默认参数。这些分析方法的具体方法，为本领域技术人员所周知。本说明书中表示蛋白质或脂肪酶的分子量时，除特殊情况外，为使用SDS-PAGE确定的值(参照实施例1、图2)。本发明的多核苷酸，可从天然物中使用杂交技术、聚合酶链式反应(PCR)技术等获得。具体地说，从属于iTetrasphaera属(优选与iTetrasphaera属NITE P-154菌株属于同种，更优选iTetrasphaera属NITE P-1M菌株)的菌中，通过常法[例如，DNeasy TissueKit(QIAGEN)]制备基因组DNA(gDNA)，或从同一菌体中通过常法[例如，RNeasy Plantisolation Kit(QIAGEN)]制备全RNA，且以全RNA为模板，通过常法[例如，SuperScriptII Reverse Transcriptase (Invitrogen)]进行逆转录反应(1st strand cDNA合成)来制备。为获得目的多核苷酸，以32kDa脂肪酶蛋白质的N-末端序列为基础，设计5’端的引物。进一步以与上述N末端氨基酸残基显示同一性的来自比较近缘的链霉菌属(Streptomyces)菌等的推测蛋白质的保守序列为基础，设计3’端的引物。将lip32基因片段以#375株cDNA为模板，通过使用上述引物组(Primer Set)的简并PCR进行扩增，确定部分碱基序列。进一步用适合的限制酶酶切后，以环化#375株gDNA为模板，通过使用了在同序列上外向设计的引物的反向PCR，获得旁侧区域的碱基序列信息。这样，确定了共计约900bp的lip32区域gDNA的碱基序列。本发明的多核苷酸中包含DNA，DNA中包含基因组DNA、cDNA及化学合成DNA。DNA可以是单链DNA及双链DNA。本发明的多核苷酸的优选例为来自Tetrasphaera属的多核苷酸。本发明还提供包含本发明的多核苷酸的重组载体、通过其重组载体转化的转化体(例如转化大肠杆菌、转化酵母、转化昆虫细胞)。本发明还进一步提供包括使用本发明的多核苷酸转化宿主(例如大肠杆菌、酵母、昆虫细胞)的工序(例如，通过本发明的重组载体转化的工序)的转化方法。插入本发明的多核苷酸的载体，只要可使在宿主内的插入物表达无特别限制，载体通常具有启动子序列、终止子序列、用于通过外界刺激诱导性地使插入物表达的序列、通过用于插入靶基因的限制酶识别的序列、及编码用于选择转化体的标记的序列。重组载体的制备、通过重组载体的转化方法，可适用本领域技术人员周知的方法。本发明还提供如下蛋白质，其为属于Tetrasphaera属(优选与"Tetrasphaera属NITE P-IM菌株属于同种，更优选Tetrasphaera属NITEP-IM菌株)的菌产生的分子量约为32kDa的脂肪酶或其同源物，即含有下述(θι)、(f\)或(gl)的蛋白质(θι)蛋白质，其由序列号11中记载的氨基酸序列组成；(f,)蛋白质，其由序列号11中记载的氨基酸序列中1个或多个氨基酸发生取代、缺失、插入及/或附加的氨基酸序列组成，且具有脂肪酶活性；(gl)蛋白质，其由与序列号11中记载的氨基酸序列有至少80%以上同一性的氨基酸序列组成，且具有脂肪酶活性。本发明的分子量约为32kDa的脂肪酶或其同源物的优选例为下述蛋白质·蛋白质，其是下述(e/ )、(f/ )或(g/ )(e/ )蛋白质，其由序列号11中记载的氨基酸序列组成；(f/ )蛋白质，其由序列号11中记载的氨基酸序列中1个或多个氨基酸发生取代、缺失、插入及/或附加的氨基酸序列组成，且具有脂肪酶活性；(g/ )蛋白质，其由与序列号11中记载的氨基酸序列有至少80%以上同一性的氨基酸序列组成，且具有脂肪酶活性。·蛋白质，其含有下述(e2)、(f2)或(g2)(e2)蛋白质，其由序列号16中记载的氨基酸序列的全部或至少包含48 306位的氨基酸序列的部分组成；(f2)蛋白质，其由(e2)中记载的蛋白质的氨基酸序列中1个或多个氨基酸发生取代、缺失、插入及/或附加的氨基酸序列组成，且具有脂肪酶活性；(g2)蛋白质，其由与(e2)中记载的蛋白质的氨基酸序列有至少80%以上同一性的氨基酸序列组成，且具有脂肪酶活性。·蛋白质，其为下述( ，)、(f2，)或(g2')(e2')蛋白质，其为序列号16中记载的氨基酸序列的全部或48 306位的氨基酸序列组成的部分；(f2’ )蛋白质，其由(e2’ )中记载的蛋白质的氨基酸序列中1个或多个氨基酸发生取代、缺失、插入及/或附加的氨基酸序列组成，且具有脂肪酶活性；(g2’ )蛋白质，其由与(e2’ )中记载的蛋白质的氨基酸序列有至少80%以上同一性的氨基酸序列组成，且具有脂肪酶活性。
此分子量约为32kDa的脂肪酶可将中链脂肪酸作为底物识别，如实施例11中所示的条件中，最适温度约为40°C，最适pH值为7. 0左右。本发明还提供如下蛋白质，其为属于Tetrasphaera属(优选与"Tetrasphaera属NITE P-IM菌株属于同种，更优选Tetrasphaera属NITEP-IM菌株)的菌产生的分子量约为40kDa的脂肪酶或其同源物，即含有下述(I1)、(Hi1)或(Ii1)的蛋白质。(I1)蛋白质，其由序列号35中记载的氨基酸序列组成；(Hi1)蛋白质，其由序列号35中记载的氨基酸序列中1个或多个氨基酸发生取代、缺失、插入及/或附加的氨基酸序列组成，且具有脂肪酶活性；(H1)蛋白质，其由与序列号35中记载的氨基酸序列有至少80%以上同一性的氨基酸序列组成，且具有脂肪酶活性。序列号35及图16中，表示Tetrasphaera属NITE菌株产生的分子量约为40kDa的脂肪酶的、成熟蛋白质的氨基酸序列。本发明的分子量约为40kDa的脂肪酶或其同源物的优选例，如下述蛋白质·蛋白质，其是上述(I1)、(Hi1)或(Ii1)。·蛋白质，其含有下述(I2)、(m2)或(n2)(I2)蛋白质，其由序列号29中记载的氨基酸序列的全部或至少包含四 4 位的氨基酸序列的部分组成；(m2)蛋白质，其由(I2)中记载的蛋白质的氨基酸序列中1个或多个氨基酸发生取代、缺失、插入及/或附加的氨基酸序列组成，且具有脂肪酶活性；(n2)蛋白质，其由与(I2)中记载的蛋白质的氨基酸序列有至少80%以上同一性的氨基酸序列组成，且具有脂肪酶活性。·蛋白质，其是下述(12，)、(m2，)或(n2’)，(I2')蛋白质，其由序列号29中记载的氨基酸序列的全部或四 4 位的氨基酸序列组成的部分组成；(m2’ )蛋白质，其由(12’ )中记载的蛋白质的氨基酸序列中1个或多个氨基酸发生取代、缺失、插入及/或附加的氨基酸序列组成，且具有脂肪酶活性；(n2’ )蛋白质，其由与(12’ )中记载的蛋白质的氨基酸序列有至少80%以上同一性的氨基酸序列组成，且具有脂肪酶活性。此分子量约为40kDa的脂肪酶可将中链脂肪酸及长链脂肪酸作为底物识别，实施例11所示条件中，最适温度约为45 50°C，最适PH值为7. 0左右。上述蛋白质或脂肪酶，可从将属于Tetrasphaera属(优选与Tetrasphaera属NITE P-154菌株属于同种，更优选Tetrasphaera属NITE P-154菌株)的菌用市售培养基[例如，使用Marine broth 2216 (Difco公司制)。Marine broth是液体培养基，其特征在于约含有2%食盐]培养后获得的培养上清中分离·精制。具体如下所示。首先接种菌液，使菌液相对于培养基为0. 1 5%，10 40°C下培养2日 10日。使用经含有氯化钙及氯化镁的三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)缓冲液平衡后的疏水性凝胶(例如(t-S^)harose)0. 01 1份，将培养上清用于柱色谱法。用上述缓冲液液洗涤后，通过用含有非离子表面活性剂[例如，曲拉通X-100 (TritonX-IOO)]的上述缓冲液液洗脱，可获得具有脂肪酶活性的组分。将本脂肪酶组分用10份上述缓冲液液稀释后，吸附于0. 001 1份阴离子交换凝胶(例如，Q-Sepharose)上，用含有0. 1%的两性表面活性剂(例如，3-[(3_胆酰胺丙基)二甲氨基]-1-丙磺酸内盐(CHAPS)；3-[ (3-Cholamidop ropyl) dimethylammonio] -1-propanesulfonate (CHAPS))的上述缓冲液洗涤后，用氯化钠水溶液的浓度梯度洗脱，获得脂肪酶活性组分。将本脂肪酶组分使用阴离子交换柱(例如HiTrapQ)进行高效液相色谱法(HPLC)，通过氯化钠水溶液进行浓度梯度洗脱，获得可确认出具有脂肪酶活性且分子量约为32kDa或约为40kDa的蛋白质的存在的组分。更具体的方法，可参照本说明书的实施例1。上述的蛋白质或脂肪酶，可通过用插入了本发明的多核苷酸的重组载体转化的转化体(例如，转化大肠杆菌)，获得重组蛋白质。具体如下所示。首先，用于大肠杆菌表达系统的基因的碱基序列，通过使用适合的引物组(Primer kt)的PCR进行扩增，克隆后，通过测序确认碱基序列。克隆后的DNA片段，通过适合的限制酶酶切提取后，整合进蛋白质的大肠杆菌表达用载体中，使用此载体转化到大肠杆菌中，使蛋白质表达。破碎表达靶基因的大肠杆菌，将上清用色谱柱精制，获得约32kDa或约40kDa的目标蛋白质。更具体的方法可参照本说明书的实施例3或8。本发明还可提供如下脂肪酶，其为属于Tetrasphaera属(优选与"Tetrasphaera属NITE P-IM菌株属于同种，更优选Tetrasphaera属NITE P-IM菌株)的菌产生的、可将中链脂肪酸及长链脂肪酸作为底物识别的、分子量约为40kDa的脂肪酶、或可通过包含下述工序的制造方法分离的分子量约为40kDa的脂肪酶。将属于Tetrasphaera属的菌的培养上清液加入到疏水性树脂色谱柱，将疏水性树脂吸附物用含有非离子表面活性剂的缓冲液洗脱；将洗脱物加入到阴离子交换树脂中，将阴离子交换树脂吸附物用0. 5M NaCl溶液洗脱；将洗脱物透析后加入到阴离子交换柱，用NaCl梯度溶剂洗脱。该制造方法更详细地说包括下述1) 幻的工序1)将属于 Tetrasphaera 属(优选与 Tetrasphaera 属 NITE P-154 菌株属于同种，更优选Tetrasphaera属NITE P-IM菌株)的菌的培养上清液加入到疏水性树脂色谱柱，根据需要，将疏水性树脂吸附物用含有0.5%非离子表面活性剂[例如，曲拉通X-IOO(TritonX-IOO)]的缓冲液等洗涤后，用含有1 %曲拉通X-100 (TritonX-IOO)的缓冲液洗脱，2)将洗脱物加入到阴离子交换树脂中，根据需要，将阴离子交换树脂吸附物用含有0. 两性表面活性剂(例如，3-[(3_胆酰胺丙基)二甲氨基]-1-丙磺酸内盐(CHAPS)；3- [ (3-Cholamidopropyl) dimethylammonio]-1-propanesulfonate (CHAPS))的缓冲液等洗涤后，用0. 5M NaCl溶液洗脱，3)将洗脱物透析后加入到阴离子交换柱，用NaCl梯度溶剂洗脱。例如，将洗脱物透析后加入到Iml容量的阴离子交换柱，用0 0. 75M NaCl梯度溶剂洗脱，每0. 5ml收集一次洗脱物。上述40kDa的脂肪酶，按照与已叙述的32kDa的脂肪酶相同的方法，可从将属于iTetrasphaera属(优选与iTetrasphaera属N ITE P-1M菌株属于同种，更优选Tetrasphaera属NITE P-1M菌株)的菌用市售培养基培养后获得的培养上清中分离 精制(参照实施例1)。上述40kDa的脂肪酶的优选例，其氨基酸序列为序列号3及/或序列号14中记载的氨基酸序列，更特定地说，为具有序列号3及序列号14中记载的氨基酸序列的氨基酸序列。通过使用本发明及由本说明书提供的信息，例如，通过使用上述40kDa的脂肪酶的全部或一部分、序列号3或序列号14中记载的氨基酸序列、或属于Tetrasphaera属的(优选与1Tetrasphaera 属 NITE P-1M 菌株属于同种，更优选 iTetrasphaera 属 NITE P-154菌株)菌、从该菌中获得的基因组DNA，另外适当的话还可通过适用本说明书中公开的针对32kDa脂肪酶的各种方法，获得编码40kDa脂肪酶的多核苷酸的序列信息及编码40kDa脂肪酶的多核苷酸。更具体地说，将从属于iTetrasphaera属(优选与Tetrasphaera属N ITEP-IM菌株属于同种，更优选Tetrasphaera属NITE P-IM菌株)的菌中获得的基因组DNA用适合的限制酶完全酶切，与对应限制酶的接头(Cassette)连接，制备模板DNA。另一方面，利用由40kDa的脂肪酶的一部分获得的氨基酸序列信息(例如，为N末端氨基酸序列的序列号3，为内部氨基酸序列的序列号14)，设计适合的引物。使用此引物和接头引物(Cassette Primer)进行PCR，获得40kD脂肪酶基因的周边基因组DNA序列。从所得到的碱基序列等中可推测出编码40kDa脂肪酶的基因的0RF。在推测ORF的扩增、克隆、碱基序列的确认、经编码的蛋白质功能的确认中，可适用本说明书中记载的、与32kDa的脂肪酶以相同目的使用的方法。即本发明还以使用序列号3或序列号14中记载的氨基酸序列、上述40kDa的脂肪酶的全部或一部分(即脂肪酶自身或其片段)、或属于Tetrasphaera属(优选与iTetrasphaera 属 NITE P-154 菌株属于同种，更优选 iTetrasphaera 属 NITE P-154 菌株)的菌为特征，提供编码该脂肪酶的多核苷酸碱基序列信息的生产方法。II. Tetrasphaera M N ITE P-154 菌株本发明还提供可产生本发明的脂肪酶的"Tetrasphaera属NITE P-154菌株。Tetrasphaera属NITE P-154菌株，从株式会社海洋生物技术研究所拥有的新型海洋性微生物文库中，使用含有中链脂肪酸油脂(MCT)的琼脂板，通过是否形成抑菌圈来蹄选。[iTetrasphaera 属 NITE P-1M 菌株的菌学性质]Tetrasphaera sp. NITE P-1M株(本说明书中有时表示为“#375”。)在形态上为球菌(0. 86X0.86 μ m)，无运动性。生理学上为革兰氏阳性，生育温度范围为15 45°C，作为碳源可使用D-果糖、D-葡萄糖、D-甘露糖醇、棉子糖及蔗糖，不能使用L-阿拉伯糖、肌醇、L-鼠李糖及D-木糖。化学分类上异戊二烯醌是MK-8 (H4)，DNA的碱基组成为70. 5%。表 1a.形态特性1)细胞的形状及大小2)有无运动性b.培养特性1) ISP培养基No. 2平板培养2) ISP培养基No. 4平板培养球菌、0. 86X0. 86 μ m无形成圆形、半球状、全缘、有光泽的白色菌落形成圆形、半球状、全缘、有光泽的白色菌落
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3) ISP培养基No. 5平板培养生育不良，但形成白色菌落4) ISP培养基No. 6平板培养形成圆形、半球状、全缘、有光泽带有黄色的白色菌落5) ISP培养基No. 7平板培养生育不良，但形成白色菌落6)Marine Agar琼脂平板培养形成圆形、半球状、全缘、有光泽的白色菌落c.生理学特性1)革兰氏染色阳性2)生育温度范围15-45度3)碱性磷酸酶活性阴性4)酯酶(C4)活件阳性5)酯酶脂肪酶(C8)活性阳性6)脂肪酶(C4)活性阳性7)亮氨酸芳香基酰胺酶活性阳性8)缬氨酸芳香基酰胺酶活性阳性9)胱氨酸芳香基酰胺酶活性阴性10)胰蛋白酶活性阴性11)糜蛋白酶活性阴性12)酸性磷酸酶活性阳性13)萘酚-AS-BI-磷酸水解酶活性阳性14) α-半乳糖苷酶活性阴性15) β -半乳糖苷酶活性阳性16) β -葡糖醛酸苷酶活性 阴性17) α -葡萄糖苷酶活性阳性18) β -葡萄糖苷酶活性阳性19) N-乙酰-β-葡萄糖胺酶活性阴性20) α -甘露糖苷酶活性阴性21) α-岩藻糖苷酶活性阴性22)碳源的利用性L-阿拉伯糖-D-果糖+D-葡萄糖+肌醇-D-甘露醇+L-鼠李糖-棉子糖+蔗糖+D-木塘-使用BiOLOG SFP2 酶标板。d.化学分类学特性
1)异戊二烯醌MK_8(H4)2) DNA 的碱基組成70. 5%用marine broth 2216 (Difco 公司制)培养 iTetrasphaera 属 NITE P-154 菌株时，将本发明的脂肪酶分泌到菌体外。本发明还提供如下菌株或其突变体，其为与Tetrasphaera属NITE P-1M菌株具有同样菌学性质的菌株或其突变体、及具有由与Tetrasphaera属NITE P-154菌株的16SrRNA基因(序列号1)有高度同一性(例如，具有高于98%的同一性、优选98. 5%同一，进一步优选99%同一，进一步优选99. 5%同一)的碱基序列组成的16S rRNA基因的菌株或其突变体。且根据本发明者的研究，与公知的菌最接近的是98%。本发明的菌株及其突变体的菌株，可用于本发明的蛋白质及脂肪酶的制造。本发明还提供由序列号1的碱基序列组成的多核苷酸。
图 1 表示 iTetrasphaera sp. NITE P_154(#375)的 16S rRNA 基因的碱基序列。图2表示HPLC分离后各组分的SDS-PAGE的照片。棚表示分子量标记，21 35表示组分#21 35泳动的泳道。图3表示链霉菌属(Sti^ptomyces)菌推测分泌蛋白质与来自龟裂链霉菌(Streptomyces rimosus)的⑶SL-脂肪酶的比对结果。#375株产生的32kDa蛋白质的N-末端15个氨基酸残基与比较近缘的链霉菌属(Sti^ptomyces)菌的推测分泌蛋白质显示出高度同一性，此链霉菌属(Streptomyces)菌推测分泌蛋白质，与包括来自龟裂链霉菌(Streptomyces rimosus)的⑶SL-脂肪酶在内的一些脂肪酶等的氨基酸序列有同一性。图4表示与推测的编码32kDa蛋白质的基因(lip32基因)碱基序列对应的氨基酸序列。lip32基因至少由777bp构成，编码由259个氨基酸残基组成的蛋白质。图5表示LIP32蛋白质表达载体(pET22b::lip32Nc)的构成。图6表示色谱柱精制后LIP32蛋白质的SDS-PAGE照片。M表示标记，2表示组分#2、3表示组分#3泳动的泳道。图7表示色谱柱精制后LIP32蛋白质通过Bradford法得到的结果。图8表示包含编码LIP32的基因的基因组DNA的碱基序列和LIP32的氨基酸序列。网线部表示与精制LIP32的N末端氨基酸序列一致的序列。图 9 表示 LIP32 的推测前序列及原序列、和 pETLIP32-F、pETLIP32_M、pETLIP32_S载体。图10表示包含编码LIP40的基因的基因组DNA的碱基序列和LIP40的氨基酸序列。下线部表示分泌信号序列，网线部表示与精制LIP40的部分氨基酸序列一致的序列。双重下线部为脂肪酶的保守区域。图11表示LIP40蛋白质表达载体(pETLIP40HP)的构成。图12表示LIP32PH及LIP40HP的最适温度。图13 表示 LIP32PH 及 LIP40HP 的最适 pH 值。图14表示使用固定化的LIP40HP或对照(pET22b)进行向虾青素的脂肪酸转移反应时反应液的HPLC分析图。
图15表示使用LIP40HP或对照(pET22b)进行向儿茶素的脂肪酸转移反应时反应液的HPLC分析图。图16表示LIP40成熟蛋白质的氨基酸序列。
具体实施例方式本发明的32kDa或40kDa的脂肪酶，可固定在适合的载体上，作为固定化酶使用。载体中，以同样目的使用的以往的树脂，可将例如碱性树脂[例如，MARATHON WBA陶氏化学公司(Dow Chemical Company)、三菱化学的SA系列、WA系列或FP系列的树脂及ORGANO公司Amber Light的IRA系列]、疏水性树脂[例如，FPHA(Diaion、三菱化学公司制)、三菱化学的HP系列、ORGANO公司的Amber Light XAD7等作为载体使用。向载体的固定化方法也可适用以同样目的使用的以往技术。例如，相对于1份上述的树脂载体，加入10份#375的培养上清，可直接进行减压干燥，也可使其吸附后，除去上清后干燥。经固定的脂肪酶在工业上很有利用价值。即将固定化酶充填入色谱柱，在其色谱柱中可进行原料流通的连续反应。此外也可容易地从反应液中除去固定化酶，还可进行再利用。本发明的脂肪酶或固定化脂肪酶，可在中链脂肪酸及/或长链脂肪酸的转移反应中、及中链脂肪酸酯及/或长链脂肪酸酯的制造中使用。酯中包含虾青素等的类胡萝卜素(由胡萝卜素类和叶黄素类组成。)与脂肪酸形成的酯、及儿茶素等的多酚与脂肪酸形成的酯。本说明书中的“转移反应”，除特殊情况外，为酯化反应或酯交换反应。转移反应用于制造各种脂肪酸酯。例如在甘油三酯间的酯交换、固醇酯的制造、脂肪酸甲酯制造等的工业化实施中，如使用以往的脂肪酶一样，此种情况下也可使用本发明的脂肪酶。可通过本发明的脂肪酶制造的酯中，作为特别有用的例子，可列举固醇酯(例如，β -谷留醇辛酸酯)、虾青素辛酸酯、儿茶素辛酸酯等。本发明还提供由本发明首次提供的与序列号1、序列号3、序列号14、序列号10、序列号11、序列号15、序列号16、序列号28及序列号 有关的序列信息及其一部分、以及其利用方法。实施例以下通过实施例，进一步具体说明本发明。但本发明不限于下述实施例。[实施例1]从#375株培养上清中的脂肪酶蛋白质的分离 精制和N末端15个残基的序列确定在Marine broth 2216(Difco公司制)液体培养基中接种1% #375株，25°C下振荡培养4日。对于培养上清液200ml，吸附于用缓冲液A:50mM三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液(pH8. O)/^· CaCl2/2mM MgCl2 平衡的疏水树脂Phenyl Sepharose CL4B (AmershamBiosciences公司制)2ml上，用于柱色谱法。用缓冲液A洗涤后，用IOml含有0. 5%曲拉通X-100 (TritonX-100)的缓冲液A洗涤除去脂肪酶蛋白质以外的物质。其次，通过用IOml含有曲拉通X-100 (TritonX-100)的缓冲液A洗脱，获得脂肪酶活性组分。在本脂肪酶组分(IOml)中添加10倍量的缓冲液A稀释后，吸附于阴离子交换树月旨Q-kpharose (Amersham Biosciences 公司制)0. 4ml 上，用含有 0. CHAPS 的缓冲液 A充分洗涤，从表面活性剂曲拉通X-100 (TritonX-IOO)置换为CHAPS后，用0. 5M进一步用IMNaCl进行分步洗脱。将证实了脂肪酶活性的0. 5M NaCl洗脱组分(^il)用含有0. 1 % CHAPS的缓冲液A充分透析后，使用阴离子交换柱=Hi1TrapQ (Amersham Biosciences公司制)1ml，通过HPLC进行0 — 0. 75MNaCl梯度洗脱。每0. 5ml收集一次组分，分别进行脂肪酶活性、及通过SDS-PAGE的条带的检测。表2表示脂肪酶活性及转移活性，图2表示SDS-PAGE结果。脂肪酶活性，按照实施例3中详细叙述的使用MU-C8的方法，使用底物MU-C8或MU-C18测定。单位用Unit[l Unit(IMU)是IL样品在Imin内水解Iymol的MU而游离的活性]表示。转移活性如下测定。在3-苯基-1-丙醇(10 μ 1)或1-苯基-2-丙醇(10 μ 1)和三辛酸甘油酯(150 μ 1)的混合液中添加酶溶液( οομ 1)，45°C下剧烈搅拌3日使其反应。离心分离反应液，回收上层50 μ 1，加入乙腈50 μ 1，取10 μ 1用HPLC分析。分析条件为色谱柱使用 Develosil C30-UG-5 (4. 6x150mm) (Nomura chemical，Aichi，Japan)，移动层使用90%乙腈0. 08% TFA，流速为Iml/分，温度为室温。用各种辛酸酯的生成率表示。表2表2.脂肪酶活件
权利要求
1.多核苷酸，其由下述(H2)、(I2)、(J2)、(K2)、(L2)、(M2)或(N2)组成(H2)多核苷酸，其由序列号28中记载的碱基序列的全部或至少包含414 1688位的碱基序列或498 1685位的碱基序列的部分组成；(I2)多核苷酸，其与由Ol2)中记载的多核苷酸碱基序列的互补碱基序列组成的多核苷酸在严谨条件下杂交，且编码具有脂肪酶活性的蛋白质，此时严谨条件为6M尿素、0.4% SDS,0. 1XSSC、以及 650C ；(J2)多核苷酸，其由(H2)中记载的多核苷酸的碱基序列中1 9个碱基发生取代、缺失、插入及/或附加的碱基序列组成，且编码具有脂肪酶活性的蛋白质；(K2)多核苷酸，其与(H2)中记载的多核苷酸的碱基序列有至少95%的同一性，且编码具有脂肪酶活性的蛋白质；(L2)多核苷酸，其编码由序列号29中记载的氨基酸序列的全部或至少包含四 4M 位的氨基酸序列的部分组成的蛋白质；(M2)多核苷酸，其编码由(L2)中记载的蛋白质的氨基酸序列中1 9个氨基酸发生取代、缺失、插入及/或附加的氨基酸序列组成，且具有脂肪酶活性的蛋白质；(N2)多核苷酸，其编码由与(L2)中记载的蛋白质的氨基酸序列有至少95%同一性的氨基酸序列组成，且具有脂肪酶活性的蛋白质。
2.权利要求1中所述的多核苷酸，其是下述(H2')、(V )、α，)、(K2' )、(L2' )、(M2，) 或汎，)(H/ )多核苷酸，其是序列号28中记载的碱基序列的全部或414 1688位的碱基序列或498 1685位的碱基序列组成的部分；(12’)多核苷酸，其与由(H/)中记载的多核苷酸碱基序列的互补碱基序列组成的多核苷酸在严谨条件下杂交，且编码具有脂肪酶活性的蛋白质，此时严谨条件为6Μ尿素、0.4% SDS,0. 1XSSC、以及 650C ；(J2')多核苷酸，其由(H2’ )中记载的多核苷酸的碱基序列中1 9个碱基发生取代、 缺失、插入及/或附加的碱基序列组成，且编码具有脂肪酶活性的蛋白质；(K2')多核苷酸，其与(H2’)中记载的多核苷酸的碱基序列有至少95%的同一性，且编码具有脂肪酶活性的蛋白质；(L2')多核苷酸，其编码的是序列号29中记载的氨基酸序列的全部或四 4Μ位的氨基酸序列组成的部分的蛋白质；(M2')多核苷酸，其编码由(L2’ )中记载的蛋白质的氨基酸序列中1 9个氨基酸发生取代、缺失、插入及/或附加的氨基酸序列组成，且具有脂肪酶活性的蛋白质；(N2')多核苷酸，其编码由与(L2’ )中记载的蛋白质的氨基酸序列有至少95%同一性的氨基酸序列组成，且具有脂肪酶活性的蛋白质。
3.权利要求1或2中所述的多核苷酸，其来自Tetrasphaera属。
4.载体，其包含权利要求1或2中所述的多核苷酸。
5.转化体，其通过权利要求4中所述的载体转化。
6.蛋白质，其由下述(I2)、(m2)或(n2)组成(I2)蛋白质，其由序列号29中记载的氨基酸序列的全部或至少包含四 4 位的氨基酸序列的部分组成；(Hi2)蛋白质，其由(I2)中记载的蛋白质的氨基酸序列中1 9个氨基酸发生取代、缺失、插入及/或附加的氨基酸序列组成，且具有脂肪酶活性；(n2)蛋白质，其由与(I2)中记载的蛋白质的氨基酸序列有至少95%同一性的氨基酸序列组成，且具有脂肪酶活性。
7.权利要求6中所述的蛋白质，其是下述(12，)、(m2，)或(n2’)(12’ )蛋白质，其是序列号29中记载的氨基酸序列的全部或四 似4位的氨基酸序列组成的部分；(m2’)蛋白质，其由(12’)中记载的蛋白质的氨基酸序列中1 9个氨基酸发生取代、 缺失、插入及/或附加的氨基酸序列组成，且具有脂肪酶活性；(n2’ )蛋白质，其由与(12’ )中记载的蛋白质的氨基酸序列有至少95%同一性的氨基酸序列组成，且具有脂肪酶活性。
8.权利要求6或7所述的蛋白质，其被固定于树脂上。
9.中链脂肪酸的转移方法，其特征在于，使用权利要求6或7所述的蛋白质。
10.中链脂肪酸的转移方法，其特征在于，使用权利要求8中所述的蛋白质。
11.中链脂肪酸酯的制造方法，其特征在于，使用权利要求6或7所述的蛋白质。
12.中链脂肪酸酯的制造方法，其特征在于，使用权利要求8中所述的蛋白质。
13.权利要求11中所述的制造方法，其是多酚与中链脂肪酸形成的酯、或类胡萝卜素与中链脂肪酸形成的酯的制造方法。
14.权利要求12中所述的制造方法，其是多酚与中链脂肪酸形成的酯、或类胡萝卜素与中链脂肪酸形成的酯的制造方法。
全文摘要
本发明提供Tetrasphaera属菌产生的、分子量约为32kDa的新型脂肪酶、编码该酶的基因。此脂肪酶可将中链脂肪酸作为底物识别。本发明还提供编码属于Tetrasphaera属的菌产生的、可将中链脂肪酸及长链脂肪酸作为底物识别、分子量约为40kDa的新型脂肪酶、编码该酶的多核苷酸。本发明还进一步提供Tetrasphaera属NITE P-154菌株。本发明的脂肪酶可作为固定化酶使用，在消化药、芳香剂制造、临床检验试剂、洗涤剂用酶、油脂制造、农药·医药品的光学活性中间体制造等领域中有利用价值。
文档编号C12N15/63GK102382848SQ201110362579
公开日2012年3月21日 申请日期2006年12月8日 优先权日2005年12月9日
发明者中尾正宏, 深见治一, 笠井宏朗, 落合美佐, 金森正树 申请人:三得利控股株式会社