专利名称：奥尔森派琴虫可视化环介导等温扩增检测试剂及检测方法
技术领域：
本发明属于环介导等温扩增检测技术领域，尤其涉及了可视化环介导等温扩增 (LAMP)检测技术在海水贝类奥尔森派琴虫检测中的应用。
背景技术：
派琴虫是影响贝类养殖业发展的主要病原，为世界动物卫生组织规定的必报水生动物疫病之一，可感染蛤仔、扇贝、牡蛎、鲍鱼、贻贝等贝类。在欧洲、美洲和亚洲等海域均有过贝类感染的报道。2000年，我国黄海沿岸爆发了菲律宾蛤仔的大规模死亡，派琴虫是其中危害最大的病原生物之一。在我国，目前由于派琴虫的检测技术有液体巯基醋酸盐培养基(RFTM)培养方法、 PCR/荧光PCR检测方法。如中国专利申请号为2008102246547公开了一种用于派琴虫检测的实时荧光PCR引物和探针，所述的引物对特异性针对派琴虫基因组DNA中ITS2序列的保守区域，所述探针特异性针对于该引物对扩增区域中的GC高含量区，该探针的5’端具有报告荧光染料标记，3’端具有淬灭荧光染料标记。但是液体巯基醋酸盐培养基(RFTM)培养方法即可培养派琴虫，也可以培养某些双鞭毛类，缺乏专一性，而且仅能检测到派琴虫的休眠孢子，同时RFTM检测方法需要7天时间，敏感度较低，只有当每克组织内原虫数量高于 1000个时方可检出，因此在实际工作中具有一定的局限性。对于PCR/荧光PCR检测方法， 虽然其敏感性高、特异性强，但是其通常需要昂贵、精密的一起设备，对实验环境和操作者技术要求也比较高，同时，由于PCR相关反应需要经过DNA的热变性、长时间的温度循环等等，耗时较长，从3小时到20小时不等，不利于食品中毒的现场快速诊断和处理，所以目前情况来看，在实验室研究中应用较多，在食品卫生实际检验中由于相对要求比较高，推广应用上有一定难度。环介导等温扩增法(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是由日本的荣研株式会社的Notomi等人于2000年开发出来的一种新型的核酸扩增方法，其特点是针对靶基因的6个区域设计4种特异引物，在链置换DNA聚合酶的作用下，60 65°C恒温扩增，15 60分钟左右即可核酸扩增，效率可达IO9 101°个数量级，具有操作简单、特异性强、快速灵敏、产物易检测等特点。在DNA合成时，从脱氧核酸三磷酸基质中析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的镁离子反应，产生大量焦磷酸镁沉淀，呈现白色；或在有钙黄绿素、 SYBR Green等颜色指示剂存在的情况下，反应产物呈现出特定的颜色。因此，可以把浑浊度或颜色作为反应的指标，只用肉眼观察到白色浑浊沉淀或特定颜色，就能鉴定扩增与否， 而不需要繁琐的电泳和染色过程。LAMP反应不需要PCR仪和昂贵的试剂，有着广泛的应用前景。但是，目前尚未见有利用环介导等温扩增(LAMP)对贝类奥尔森派琴虫进行检测的报道。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种更方便、特异性强、成本低、通过肉眼直接检测荧光来判断结果的奥尔森派琴虫可视化环介导等温扩增(LAMP)检测试剂及检测方法。为了实现上述目的，本发明采用了以下技术方案奥尔森派琴虫可视化环介导等温扩增检测试剂，针对奥尔森派琴虫的5. 8S核糖体RNA与内转录2间隔区序列，设计6条特异性LAMP扩增引物，其中包括两条外引物F3和B3、两条内引物FIP和BIP、两条环引物 LF和LB ；所述扩增引物的核苷酸序列分别为
F3 为 5，-GCAGAATTCCGTGAACCAGT-3，， B3 为 5，-GGAGGGGCTACAATACGAGA-3’ ；
FIP 为 5，-CGGGAAGAAGAGCGACACTGAT-AAGTCTCAACGCATACTGCA-3，， BIP 为 5，-TGCTTTGTATCCCGCTTGGACT-ATACGCCTGCCTTCACAAG-3，； LF 为 5，-ACAAAGAGGAAAGATCCCCTTTG-3，， LB 为 5，-TCGGAGATAGTTCGTTATGTGCG-3，。所述的扩增引物加入反应试剂后共同组成LAMP检测液体系，所述的反应试剂包括反应缓冲液Bst DNA polymerase bufferr、链置换DNA聚合酶、镁离子、甜菜碱、脱氧核糖核苷三磷酸dNTPs、颜色指示剂。所述的颜色指示剂为钙黄绿素和氯化锰，或是STOR Green0 SYBR Green是高灵敏的DNA荧光染料，应用于DNA和RNA的检测，这些试剂可以在市场上购买得到。所述的LAMP检测液体系中的各组分浓度分别为F3 0. 1 μ mol/L 2 μ mol/L, B3 0. 1 μ mol/L 2 μ mol/L, FIP 0. 8 μ mol/L 16 μ mol/L, BIP 0. 8 μ mol/L 16 μ mol/L, LF 0· 4 μ mol/L 8 μ mol/L, LB 0· 4 μ mol/L 8 μ mol/L,反应缓冲液Bst DNA polymerase buffer IX、链置换DNA聚合酶IU 40U、镁离子0. 6 mmol/L 7 mmol/L、甜菜碱0. 1 mmol/L 2 mmol/L、脱氧核糖核苷三磷酸dNTPs 0.2 mmol/L 2 mmol/L、钙黄绿素 6 μ mol/L 70 μ mol/L 和氯化猛 0. 05 mmol/L 1 mmol/L，或 1 X 10 X SYBR Green 代替钙黄绿素6 μ mol/L 70 μ mol/L和氯化猛0. 05 mmol/L 1 mmol/L。所述的LAMP检测液体系中的各组分浓度分别为F3 0. 6 μ mol/L, B3 0. 6 μ mol/ L，FIP 4. 8 μ mol/L, BIP 4. 8 μ mol/L, LF 2. 4 μ mol/L, LB 2. 4 μ mol/L，反应缓冲液 Bst DNA polymerase bufferl X (即1倍浓缩液)、链置换DNA聚合酶8U (即8单位)、镁离子4mmol/ L、甜菜碱0. 2mmol/L、脱氧核糖核苷三磷酸dNTPs 0. 8mmol/L、钙黄绿素25 μ mol/L和氯化锰 0. 25mmol/L，或用 4 X SYBR Green 代替钙黄绿素 25 μ mol/L 和氯化锰 0. 25mmol/L。一种用上述的贝类奥尔森派琴虫可视化环介导等温扩增检测试剂的检测方法的检测步骤包括
(1)提取待检样品的基因组DNA；
(2)配制LAMP检测液体系；
(3)在LAMP检测液体系中加入步骤(1)提取的待检样品基因组DNA；
(4)将步骤(3)配制的反应体系混合均勻；
(5)将步骤(4)的反应体系置于恒温设备(可以是恒温水浴锅、恒温干式加热器、PCR仪或基因扩增仪等任选其一)；
(6)按反应程序进行扩增反应，反应程序依次为55°C 70°C30min 120 min， 80°C 100°C 5min,10°C 5min ；(7)反应结束后，根据颜色反应判断检测结果，判断标准为肉眼直接观察或在紫外光下观察，呈现黄绿色荧光的样品判断为奥尔森派琴虫感染阳性样品，反之为阴性样品。所述的配制LAMP检测液体系为设计6条特异性LAMP扩增引物，其中包括两条外引物F3和B3、两条内引物FIP和BIP、两条环引物LF和LB，所述的F3为 5，-GCAGAATTCCGTGAACCAGT-3，，所述的 B3 为 5，-GGAGGGGCTACAATACGAGA-3，，所述的 FIP 为 5，-CGGGAAGAAGAGCGACACTGAT-AAGTCTCAACGCATACTGCA-3，，所述的 BIP 为 5，-TGCTTTGTATCC CGCTTGGACT-ATACGCCTGCCTTCACAAG-3，，所述的 LF 为 5，-ACAAAGAGGAAAGATCCCCTTTG-3，，所述的LB为5’ -TCGGAGATAGTTCGTTATGTGCG-3’，然后在LAMP扩增引物中加入反应试剂。所述的反应试剂为反应缓冲液Bst DNA polymerase buffer IX、链置换DNA聚合酶IU 40U、镁离子0. 6 mmol/L 7 mmol/L、甜菜碱0. 1 mmol/L 2 mmol/L、脱氧核糖核苷三磷酸dNIPs 0. 2 mmol/L 2 mmol/L、钙黄绿素6 μ mol/L 70 μ mol/L和氯化锰 0. 05 mmol/L 1 mmol/L，或 1 X 10 X SYBR Green 代替钙黄绿素 6 μ mol/L 70 μ mol/ L 和氯化锰 0. 05 mmol/L 1 mmol/L。所述的反应试剂为反应缓冲液Bst DNA polymerase buffer IX、链置换DNA聚合酶8U、镁离子4mmol/L、甜菜碱0. 2mmol/L、脱氧核糖核苷三磷酸dNIPs 0. 8mmol/L、钙黄绿素25 μ mol/L和氯化锰0. 25mmol/L,或4 X STOR Green代替钙黄绿素25 μ mol/L和氯化锰 0.25mmol/L。
上述的反应程序依次优选为60°C 60min,80°C 5min, 10°C 5min。在上述检测方法中，如果使用钙黄绿素和氯化锰作为颜色指示剂，则钙黄绿素和氯化锰作为反应试剂中的一种，与其他反应试剂同时加入反应；如果使用STOR Green作为颜色指示剂，则是在样品与其他反应试剂反应结束后，再加入STOR Green，进行颜色反应标识。即若使用钙黄绿素和氯化锰作为颜色指示剂，在反应结束后，直接根据颜色反应判断检测结果；若使用STOR Green代替钙黄绿素和氯化锰，则在反应结束后，在扩增产物中加入 SYBR Green，再根据颜色反应判断检测结果。与现有技术相比，本发明的优点
1.检测操作简单方便，成本低，适用于更多的基层单位。本发明的检测方法，不需要专门的技术人员全程操作，而且使用的仪器简单，如干式恒温仪、水浴锅等就可以了，也可以在基因扩增仪上进行基因扩增，通过肉眼直接观察颜色或荧光就可对结果进行判断。2.敏感性高，特异性强。
图1是可视化LAMP敏感性试验结果图
1-1.IOng ； 1-2. Ing ； 1-3. IOOpg ； 1-4. IOpg ； 1-5. Ipg ； 1-6. IOOfg ； 1-7. IOfg ； 1-8.阴性对照。图2是可视化LAMP特异性试验结果图
2-1，2-2，2-3.奥尔森派派琴虫阳性样品；2-4.其它亚种派琴虫；2-5.单孢子虫；2-6. 马尔太虫；2-7.正常贝类组织；2-8.阴性对照；
图3是本发明一实施例的肉眼直接观察结果图图中3-1 3-6为奥尔森派琴虫阳性样品，呈黄绿色；3-7为阴性样品；
图4是本发明一实施例的紫外线下观察结果图
图中 4_6为奥尔森派琴虫阳性样品，呈黄绿色；4-7为阴性样品。
具体实施例方式
下面结合实施例对本发明进一步说明。实施例1
(1)样品DNA提取取待检贝类腮组织25g，按海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒 (TIANGEN, DP324-02)说明提取基因组总DNA，_20°C保存备用。(2 ) LAMP检测液体系配制
①针对奥尔森派琴虫的5. 8S核糖体RNA与内转录2间隔区序列，设计6条特异性 LAMP扩增引物
F3 为 5，-GCAGAATTCCGTGAACCAGT-3，， B3 为 5，-GGAGGGGCTACAATACGAGA-3’ ；
FIP 为 5，-CGGGAAGAAGAGCGACACTGAT-AAGTCTCAACGCATACTGCA-3，， BIP 为 5，-TGCTTTGTATCCCGCTTGGACT-ATACGCCTGCCTTCACAAG-3，； LF 为 5，-ACAAAGAGGAAAGATCCCCTTTG-3，， LB 为 5，-TCGGAGATAGTTCGTTATGTGCG-3，；
反应试剂反应缓冲液Bst DNA polymerase bufferr、链置换DNA聚合酶、镁离子、甜菜碱、脱氧核糖核苷三磷酸dNTPs、钙黄绿素和氯化锰。②在PCR管中，依次加入上述奥尔森派琴虫LAMP检测液体系所需的各种试剂，试剂的加入量和浓度分别如下
1. 5 μ L 10 μ mol/L 的 F3 (终浓度 0. 6 μ mol/L), 1. 5 μ L 10 μ mol/L 的 Β3 (终浓度 0. 6 μ mol/L), L 5 μ L 80 μ mol/L 的 FIP(终浓度 4. 8 μ mol/L), L 5 μ L 80 μ mol/L 的 BIP (终浓度 4. 8 μ mol/L), 40 μ mol/L LF 1. 5 μ L (终浓度 2. 4 μ mol/L), 1. 5 μ L 40 μ mol/L 的 LB (终浓度 2· 4ymol/L)，2· 5μ L 10Χ 反应缓冲液 Bst DNA polymerase bufferr (终浓度1 X )，1 μ L 8U/ μ L的链置换DNA聚合酶(终浓度8U)，4 μ L 25 μ mol/L的镁离子(终浓度4mmol/L)，lyL 5mmol/L 的甜菜碱(终浓度 0. 2mmol/L)，2 μ L 10 mmol/L 的脱氧核糖核苷三磷酸dNIPs (终浓度0. 8mmol/L), IyL 625 μ mol/L钙黄绿素(终浓度25 μ mol/L) 和 0. 5 μ L 12. 5mmol/L 氯化锰(终浓度 0. 25mmol/L), 2 μ L 灭菌 dH20。(3)在LAMP检测液体系加入提取的待检样品DNA 2 μ L。试验同时设立空白对照， 以dH20代替DNA作为模板。将上述配制好的含LAMP反应体系的PCR反应管置于恒温水浴锅，设定反应程序进行扩增反应，反应程序为60°C 60min,80°C 5min, 10°C 5min。(4)结果判定
反应结束后，根据反应管颜色判定结果
①直接用肉眼观察反应液的颜色变化，反应液呈现黄绿色颜色则待检样品为奥尔森派琴虫阳性，反之为阴性；
②在紫外光下用肉眼观察反应液的颜色变化，反应液出现黄绿色荧光则待检样品为奥尔森派琴虫阳性，反之为阴性。实施例2
(1)样品DNA提取取待检贝类消化腺组织25g，按海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒(TIANGEN，DP324-02)说明提取基因组总DNA，_20°C保存备用。(2 ) LAMP检测液体系配制
①针对奥尔森派琴虫的5. 8S核糖体RNA与内转录2间隔区序列，设计6条特异性 LAMP扩增引物
F3 为 5，-GCAGAATTCCGTGAACCAGT-3，， B3 为 5，-GGAGGGGCTACAATACGAGA-3’ ；
FIP 为 5，-CGGGAAGAAGAGCGACACTGAT-AAGTCTCAACGCATACTGCA-3，， BIP 为 5，-TGCTTTGTATCCCGCTTGGACT-ATACGCCTGCCTTCACAAG-3，； LF 为 5，-ACAAAGAGGAAAGATCCCCTTTG-3，， LB 为 5，-TCGGAGATAGTTCGTTATGTGCG-3，；
反应试剂反应缓冲液Bst DNA polymerase bufferr、链置换DNA聚合酶、镁离子、甜菜碱、脱氧核糖核苷三磷酸dNTPs、钙黄绿素和氯化锰。②在PCR管中，依次加入上述奥尔森派琴虫LAMP检测液体系所需的各种试剂，试剂的加入量和浓度分别如下
0. 5 μ L 10 μ mol/L 的 F3 (终浓度 0. 1 μ mol/L)，0. 5 μ L 10 μ mol/L 的 B3 (终浓度 0. 1μ θ1/υ，0· 5μ L 80 μ mol/L ^ FIP (^ ^ 0. 8 μ mol/L), 0. 5 μ L 80 μ mol/ L 的 BIP (终浓度 0· 8 μ mol/L), 0. 5 μ L 40 μ mol/L 的 LF (终浓度 0. 4 μ mol/L), 0. 5 μ L 40 μ mol/L 的 LB (终浓度 0· 4 μ mol/L)，2· 5 μ L 10Χ 反应缓冲液 Bst DNA polymerase ^1 6灯(终浓度1\)，14 1^ 8U/yL的链置换DNA聚合酶(终浓度8U)，0. 6yL 25 μ mol/ L的镁离子(终浓度0. 6mmol/L),0. 5 μ L 5 mmol/L的甜菜碱(终浓度0. lmmol/L)，0. 5 μ L 10 mmol/L的脱氧核糖核苷三磷酸dNIPs (终浓度0. 2mmol/L)，0. M μ L 625 μ mol/L的钙黄绿素(终浓度6 μ mol/L)和0. 1 μ L 12. 5mmol/L的氯化锰(终浓度0. 05mmol/L), 14. 56 μ L 灭菌 dH20。(3)在LAMP检测液体系加入提取的待检样品DNA 2 μ L。试验同时设立空白对照， 以dH20代替DNA作为模板。将上述配制好的含LAMP反应体系的PCR反应管置于基因扩增仪，设定反应程序进行扩增反应，反应程序为70°C 30min,80°C 5min, 10°C 5min。(4)结果判定
反应结束后，根据反应管颜色判定结果
①直接用肉眼观察反应液的颜色变化，反应液呈现黄绿色颜色则待检样品为奥尔森派琴虫阳性，反之为阴性；
②在紫外光下用肉眼观察反应液的颜色变化，反应液出现黄绿色荧光则待检样品为奥尔森派琴虫阳性，反之为阴性。实施例3
(1)样品DNA提取取待检奥尔森派琴虫培养物25g，按海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒(TIANGEN，DP324-02)说明提取基因组总DNA，_20°C保存备用。
(2 ) LAMP检测液体系配制
①针对奥尔森派琴虫的5. 8S核糖体RNA与内转录2间隔区序列，设计6条特异性 LAMP扩增引物
F3 为 5，-GCAGAATTCCGTGAACCAGT-3，， B3 为 5，-GGAGGGGCTACAATACGAGA-3’ ；
FIP 为 5，-CGGGAAGAAGAGCGACACTGAT-AAGTCTCAACGCATACTGCA-3，， BIP 为 5，-TGCTTTGTATCCCGCTTGGACT-ATACGCCTGCCTTCACAAG-3，； LF 为 5，-ACAAAGAGGAAAGATCCCCTTTG-3，， LB 为 5，-TCGGAGATAGTTCGTTATGTGCG-3，；
反应试剂反应缓冲液Bst DNA polymerase bufferr、链置换DNA聚合酶、镁离子、甜菜碱、脱氧核糖核苷三磷酸dNTPs、钙黄绿素和氯化锰。②配制LAMP扩增弓I物混合液
按以下使用量将6条LAMP引物混合成配制成引物混合液100ymOl/L&F3 0. 5 μ L, lOOymol/L 的 Β3 0· 5μ L，200ymol/L 的 FIP 2 μ L，200 μ mol/L 的 BIP 2μ L, 200ymol/L&F3 1 μ L，200 μ mol/L 的 Β3 lyL，灭菌 dH20 3 μ L，混合均勻，-20°C保存③配制钙黄绿素和氯化锰混合液
按以下使用量配制钙黄绿素和氯化锰混合液625 μ mol/L的钙黄绿素10 μ L (终浓度 25 μ mol/L)和12. 5mmol/L的氯化锰5 μ L，混合均勻备用，4°C避光保存备用。④在PCR管中，依次加入上述奥尔森派琴虫LAMP检测液体系所需的各种试剂，试剂的加入量和浓度分别如下
3 μ L步骤②配制的扩增引物混合液(终浓度分别为F3 0.6 μ mol/L、B3 0. 6 μ mol/ L、FIP 4. 8ymol/L、BIP 4. 8ymol/L>LF 2. 4ymol/L>LB 2. 4 μ mol/L), 2. 5 μ L 10X 反应缓冲液Bst DNA polymerase bufferr (终浓度1 X )，1 μ L 8U/μ L的链置换DNA聚合酶(终浓度8U)，4yL 25ymol/L的镁离子(终浓度4mmol/L)，lyL 5mmol/L的甜菜碱 (终浓度0. 2mmol/L)，2yL 10 mmol/L脱氧核糖核苷三磷酸dNIPs (终浓度0. 8mmol/L)， 1. 5 μ L步骤③配制的钙黄绿素和氯化锰混合液(终浓度分别为25 μ mol/L和0. 25mmol/L), 9μ L 灭菌 dH20。(3)在LAMP检测液体系加入提取的待检样品DNA IyL0试验同时设立空白对照， 以dH20代替DNA作为模板。将上述配制好的含LAMP反应体系的PCR反应管置于恒温干式加热器，设定反应程序进行扩增反应，反应程序为55°C 120min, IOO0C 5min, 10°C 5min。(4)结果判定
反应结束后，根据反应管颜色判定结果
①直接用肉眼观察反应液的颜色变化，反应液呈现黄绿色颜色则待检样品为奥尔森派琴虫阳性，反之为阴性；
②在紫外光下用肉眼观察反应液的颜色变化，反应液出现黄绿色荧光则待检样品为奥尔森派琴虫阳性，反之为阴性。实施例4 (1)样品DNA提取取待检贝类腮组织25g，按海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒 (TIANGEN, DP324-02)说明提取基因组总DNA，_20°C保存备用。(2 ) LAMP检测液体系配制
①针对奥尔森派琴虫的5. 8S核糖体RNA与内转录2间隔区序列，设计6条特异性 LAMP扩增引物
F3 为 5，-GCAGAATTCCGTGAACCAGT-3，， B3 为 5，-GGAGGGGCTACAATACGAGA-3’ ；
FIP 为 5，-CGGGAAGAAGAGCGACACTGAT-AAGTCTCAACGCATACTGCA-3，， BIP 为 5，-TGCTTTGTATCCCGCTTGGACT-ATACGCCTGCCTTCACAAG-3，； LF 为 5，-ACAAAGAGGAAAGATCCCCTTTG-3，， LB 为 5，-TCGGAGATAGTTCGTTATGTGCG-3，；
反应试剂反应缓冲液Bst DNA polymerase bufferr、链置换DNA聚合酶、镁离子、甜菜碱、脱氧核糖核苷三磷酸dNTPs、SYBR Green0②配制LAMP扩增弓I物混合液
按以下使用量将6条LAMP引物混合成配制成引物混合液0. 5 μ L 100 μ mol/L的 F3,0. 5μ L 100 μ mol/L 的 Β3，2 μ L 200 μ mol/L 的 FIP，2 μ L 200 μ mol/L 的 ΒΙΡ，1 μ L 200 μ mol/L 的 F3，1 μ L 200 μ mol/L 的 Β3，3 μ L 灭菌 dH20,混合均勻，_20°C保存备用。③配制SYBR Green工作液
按厦门百维信生物科技有限公司提供的STOR Green试剂使用说明书，将STOR Green 试剂用灭菌dH20按1 :100倍稀释成工作液，4°C避光保存备用。④在PCR管中，依次加入上述奥尔森派琴虫LAMP检测液体系所需的各种试剂， 试剂的加入量和浓度分别如下3 μ L上述步骤②配制的扩增引物混合液(终浓度分别为 F3 0.6 μ mol/L、Β3 0· 6 μ mol/L、FIP 4· 8 μ mol/L、BIP 4.8 μ mol/L、LF 2.4 μ mol/L、LB 2. 4 μ mol/L), 2. 5μ L 10Χ 反应缓 7 中液 Bst DNA polymerase bufferr (终浓度 1 X )，1 μ L 8U/yL的链置换DNA聚合酶(终浓度8U)，4yL 25 μ mol/L的镁离子(终浓度4mmol/L)， IuL 5 mmol/L的甜菜碱(终浓度0. 2πιπι01/1)，2μ lOmmol/L的脱氧核糖核苷三磷酸 dNTPs (终浓度 0. 8mmol/L), 10. 5 μ L 灭菌 dH20。(3)在LAMP检测液体系加入提取的待检样品DNA IyL0试验同时设立空白对照， 以dH20代替DNA作为模板。将上述配制好的含LAMP反应体系的PCR反应管置于恒温干式加热器，设定反应程序进行扩增反应，反应程序为60°C 60min,90°C 5min, 10°C 5min。(4)结果判定
反应结束后取出反应管，加入1 μ L SYBR Green工作液，根据颜色判定结果
①直接用肉眼观察反应液的颜色变化，反应液呈现黄绿色颜色则待检样品为奥尔森派琴虫阳性，反之为阴性；
②在紫外光下用肉眼观察反应液的颜色变化，反应液出现黄绿色荧光则待检样品为奥尔森派琴虫阳性，反之为阴性。核苷酸序列表
<110>广西壮族自治区兽医研究所<120>贝类奥尔森派琴虫可视化环介导等温扩增检测试剂及检测方法
<160>6
<210>1
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<221>prim-bind
<222> (1) · · · (20)
<400>1
GCAGAATTCCGTGAACCAGT <210>2 <211>20 <212>DNA <213>人工序列 <221>prim-bind <222> (1) · · · (20) <400>2
GGAGGGGCTACAATACGAGA
<210>3
<211>42
<212>DNA
<213>人工序列
<221>prim-bind
<222> (1) · · · (42)
<400>3
CGGGAAGAAGAGCGACACTGAT-AAGTCTCAACGCATACTGCA
<210>4
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
<221>prim-bind
<222> (1) · · · (41)
<400>4
TGCTTTGTATCCCGCTTGGACT-ATACGCCTGCCTTCACAAG
<210>5
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<221>prim-bind<222> (1)··· (23) <400>5
ACAAAGAGGAAAGATCCCCTTTG <210>6 <211>23 <212>DNA <213>人工序列 <221>prim-bind <222> (1) · · · (23) <400>6
TCGGAGATAGTTCGTTATGTGCG
权利要求
1.奥尔森派琴虫可视化环介导等温扩增检测试剂，其特征在于针对奥尔森派琴虫的5. 8S核糖体RNA与内转录2间隔区序列，设计6条特异性LAMP扩增引物，其中包括两条外引物F3和B3、两条内引物FIP和BIP、两条环引物LF和LB，所述的F3为 5，-GCAGAATTCCGTGAACCAGT-3，，所述的 B3 为 5，-GGAGGGGCTACAATACGAGA-3，，所述的 FIP 为 5，-CGGGAAGAAGAGCGACACTGAT-AAGTCTCAACGCATACTGCA-3，，所述的 BIP 为 5，-TGCTTTGTATCC CGCTTGGACT-ATACGCCTGCCTTCACAAG-3，，所述的 LF 为 5，-ACAAAGAGGAAAGATCCCCTTTG-3，，所述的 LB 为 5' -TCGGAGATAGTTCGTTATGTGCG-3'。
2.根据权利要求1所述的奥尔森派琴虫可视化环介导等温扩增检测试剂，其特征在于所述的扩增引物加入反应试剂后共同组成LAMP检测液体系，所述的反应试剂包括反应缓冲液Bst DNA polymerase bufferr、链置换DNA聚合酶、镁离子、甜菜碱、脱氧核糖核苷三磷酸dNTPs、颜色指示剂。
3.根据权利要求2所述的奥尔森派琴虫可视化环介导等温扩增检测试剂，其特征在于所述的颜色指示剂为钙黄绿素和氯化锰，或是STOR Green0
4.根据权利要求3所述的奥尔森派琴虫可视化环介导等温扩增检测试剂，其特征在于所述的LAMP检测液体系中的各组分浓度分别为F3 0. lymol/L 2μπι01/1，Β3 0. 1 μ mol/L 2 μ mol/L, FIP 0. 8 μ mol/L 16 μ mol/L, BIP 0. 8 μ mol/L 16 μ mol/L, LF 0. 4 μ mol/L ~ 8 μ mol/L, LB 0· 4 μ mol/L 8 μ mol/L,反应缓冲液 Bst DNA polymerase buffer IX、链置换DNA聚合酶IU 40U、镁离子0. 6 mmol/L 7 mmol/L、甜菜碱0. 1 mmol/L 2 mmol/L、脱氧核糖核苷三磷酸dNTPs 0.2 mmol/L 2 mmol/L、钙黄绿素 6 μ mol/L 70 μ mol/L 和氯化猛 0. 05 mmol/L 1 mmol/L，或 1 X 10 X SYBR Green 代替钙黄绿素6 μ mol/L 70 μ mol/L和氯化猛0. 05 mmol/L 1 mmol/L。
5.根据权利要求3所述的奥尔森派琴虫可视化环介导等温扩增检测试剂，其特征在于所述的LAMP检测液体系中的各组分浓度分别为F3 0.6 μ mol/L, B3 0.6 μ mol/L, FIP 4. 8 μ mol/L, BIP 4. 8 μ mol/L, LF 2. 4 μ mol/L, LB 2· 4 μ mol/L，反应缓冲液 Bst DNA polymerase buffer 1 X、链置换 DNA 聚合酶 8U、镁离子 4mmol/L、甜菜碱 0. 2mmol/L、脱氧核糖核苷三磷酸dNIPs 0. 8mmol/L、钙黄绿素25 μ mol/L和氯化锰0. 25mmol/L,或4X SYBR Green代替钙黄绿素25 μ mol/L和氯化锰0. 25mmol/L。
6.一种用权利要求1 5任一所述的奥尔森派琴虫可视化环介导等温扩增检测试剂的检测方法，其特征在于所述检测方法的检测步骤包括(1)提取待检样品的基因组DNA；(2)配制LAMP检测液体系；(3)在LAMP检测液体系中加入步骤(1)提取的待检样品基因组DNA；(4)将步骤(3)配制的反应体系混合均勻；(5)将步骤(4)的反应体系置于恒温设备；(6)按反应程序进行扩增反应，反应程序依次为55°C 70°C30min 120 min, 80°C 100°C 5min,10°C 5min ；(7)反应结束后，根据颜色反应判断检测结果，判断标准为肉眼直接观察或在紫外光下观察，呈现黄绿色荧光的样品判断为奥尔森派琴虫感染阳性样品，反之为阴性样品。
7.根据权利要求6所述的用奥尔森派琴虫可视化环介导等温扩增检测试剂的检测方法，其特征在于所述的配制LAMP检测液体系为设计6条特异性LAMP扩增引物，其中包括两条外引物F3和B3、两条内引物FIP和BIP、两条环引物LF和LB，所述的F3为 5，-GCAGAATTCCGTGAACCAGT-3，，所述的 B3 为 5，-GGAGGGGCTACAATACGAGA-3，，所述的 FIP 为 5，-CGGGAAGAAGAGCGACACTGAT-AAGTCTCAACGCATACTGCA-3，，所述的 BIP 为 5，-TGCTTTGTATCC CGCTTGGACT-ATACGCCTGCCTTCACAAG-3，，所述的 LF 为 5，-ACAAAGAGGAAAGATCCCCTTTG-3，，所述的LB为5’ -TCGGAGATAGTTCGTTATGTGCG-3’，然后在LAMP扩增引物中加入反应试剂。
8.根据权利要求7所述的用奥尔森派琴虫可视化环介导等温扩增检测试剂的检测方法，其特征在于所述的反应试剂为反应缓冲液Bst DNA polymerase buffer IX、链置换 DNA 聚合酶 IU 40U、镁离子 0. 6 mmol/L 7 mmol/L、甜菜碱 0. 1 mmol/L 2 mmol/L、 脱氧核糖核苷三磷酸dNTPs 0. 2 mmol/L 2 mmol/L、钙黄绿素6 μ mol/L 70 μ mol/L和氯化猛0· 05 mmol/L 1 mmol/L，或1 X 10 X SYBR Green代替钙黄绿素6 μ mol/L 70 μ mol/L 和氯化锰 0. 05 mmol/L 1 mmol/L。
9.根据权利要求8所述的用奥尔森派琴虫可视化环介导等温扩增检测试剂的检测方法，其特征在于所述的反应试剂为反应缓冲液Bst DNA polymerase buffer IX、链置换 DNA聚合酶8U、镁离子4mmol/L、甜菜碱0. 2mmol/L、脱氧核糖核苷三磷酸dNIPs 0. 8mmol/L、 钙黄绿素25 μ mol/L和氯化锰0. 25mmol/L,或4 X SYBR Green代替钙黄绿素25 μ mol/L和氯化猛 0. 25mmol/L。
10.根据权利要求6所述的用奥尔森派琴虫可视化环介导等温扩增检测试剂的检测方法，其特征在于所述的反应程序依次为60°C 60min,80°C 5min, 10°C 5min。
全文摘要
本发明涉及一种奥尔森派琴虫可视化环介导等温扩增检测试剂及检测方法，针对奥尔森派琴虫的5.8S核糖体RNA与内转录2间隔区序列，设计6条特异性LAMP扩增引物，其中包括两条外引物F3和B3、两条内引物FIP和BIP、两条环引物LF和LB，扩增引物和反应试剂共同组成LAMP检测液体系，反应试剂包括反应缓冲液BstDNApolymerasebufferr、链置换DNA聚合酶、镁离子、甜菜碱、脱氧核糖核苷三磷酸dNTPs、颜色指示剂；本发明的检测方法在敏感性高、特异性强的前提下使用的仪器简单，成本低，适用于更多的基层单位。
文档编号C12Q1/68GK102363812SQ201110362400
公开日2012年2月29日 申请日期2011年11月16日 优先权日2011年11月16日
发明者刘加波, 庞耀珊, 范晴, 谢丽基, 谢志勤, 谢芝勋, 邓显文 申请人:广西壮族自治区兽医研究所