专利名称：一株芽孢杆菌及其在生产蛋白酶中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一株芽孢杆菌及其在生产蛋白酶中的应用。
背景技术：
蛋白酶(Protease)能够水解蛋白质肽键，广泛存在于细菌、放线菌、真菌、病毒、植物与动物体内，在自然界物质循环和生物体新陈代谢中发挥重要作用。蛋白酶不仅在自然界与生物体中具有重要作用，而且是一种非常重要的工业生物催化剂，采用酶制剂取代传统化学生产工艺，在降低污染、减少能耗、保护环境等方面发挥着重要作用。自从19世纪50年代酶制剂被首次发现，已被普遍应用于各种生产行业中，如洗涤剂、食品、化妆品、水产饲料、制革、纺织、医药和生物化学试剂等领域，目前已占世界酶制剂销售总量的60%。随着社会的快速发展和经济的迅猛提升，各行业对酶制剂的品种和性能要求越来越高，同时又要求酶制剂成本进一步降低。目前工业蛋白酶常用深层液体发酵法生产，也可以用固态发酵法生产，其中培养基占据了 30%-40%的生产成本，因而在获得适用于工业生产的产酶菌株后，还必须对菌种的发酵条件进行优化以获得最佳生产工艺。由于蛋白酶一般在生长稳定期大量产生，其发酵生产受到分解代谢阻遏的调控，酶产量也很大程度上受到碳氮影响。此外，其它理化因素，如溶氧量、接种量、培养温度以及培养基PH等因素也会影响酶产量，很难实现蛋白酶产量的高效稳定提高。因此，采用发酵条件优化可实现蛋白酶的高效稳定生产，是降低蛋白酶工业生产成本的重要方法之一，对蛋白酶工业化生产具有非常重要的现实意义。目前上述蛋白酶发酵技术虽然可以在一定程度上提高蛋白酶发酵生产效率，但是还存在以下问题和不足之处其一，多数菌株酶产量不高，发酵条件优化后酶产量提高不显著，往往在实际应用中产生不理想的结果；其二，大多技术所使用培养基常为高浓度的复合营养成分，发酵原料较昂贵，虽然也有一些技术也采用了廉价原料，但是酶产量没有明显提高，因而在单位酶产量的发酵原料上没有明显降低生产成本。
发明内容
本发明的目的是提供一株芽孢杆菌及其在生产蛋白酶中的应用。本发明提供一株产蛋白酶的芽孢杆菌(Bacillus sp. )BS036，该菌种已于2011年08月沈日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏号为CGMCC No. 5178。芽孢杆菌(Bacillus sp.)BS036 CGMCC No. 5178简称菌株BS036。芽孢杆菌又称芽胞杆菌。本发明还保护一种种子培养基，由溶质和水组成；所述溶质及其在所述种子培养基中的浓度如下葡萄糖4-20g/L(优选为5-15g/L)、蛋白胨3_8g/L、酵母粉3_8g/L、KH2P040. 5-1. 5g/L、MgSO4 0. 1-1. Og/L和Na2CO3 5_15g/L。所述种子培养基可为自然pH，可也为PH7. 0-11. 5，优选为pHll. 0。所述溶质及其在所述种子培养基中的浓度具体如下葡萄糖10g/L、蛋白胨 5g/L、酵母粉 5g/L、KH2PO4 lg/L、MgSO4 0. 2-0. 8g/L 和 Na2CO3 10g/L。
本发明还保护一种发酵培养基，由溶质和水组成；所述溶质由碳源、氮源和无机盐组成；所述碳源可为葡萄糖、玉米粉、可溶性淀粉、糖蜜、麦芽糖和小麦麸皮中的至少一种；所述氮源可为棉籽饼粉、豆饼粉、大豆蛋白胨、酪素、水溶性植物水解蛋白、鱼蛋白胨、酵母粉和Oxide蛋白胨中的至少一种；所述无机盐可为柠檬酸钠、NaN03> CaCl2, FeSO4, CuSO4,ZnCl2, KH2PO4, MgSO4 和 Na2CO3 中的至少一种。所述发酵培养基可为自然pH，可也为pH7. 0至11.5(7. 0、8.0、9.0、9.5、10.0、10. 5、11. 0 或 11. 5)，优选为 ρΗ9· 0-11. 0，最优选为 pHll. 0。每升所述发酵培养基中，所述碳源的加入量可为4-Mg。每升所述发酵培养基中，所述氮源的加入量可为4_20gL。每升所述发酵培养基中，每种所述无机盐的加入量可为0. 064_20g。所述碳源可为葡萄糖(每升发酵培养基加入4、8、12、16或20力、玉米粉(每升发酵培养基加入6、9、12、15、18、21或Mg)、可溶性淀粉(每升发酵培养基加入6、9、12、15或18g)、糖蜜(每升发酵培养基加入6、9、12、15、18或21g)、麦芽糖(每升发酵培养基加入6、
9、12、15或18g)和小麦麸皮(每升发酵培养基加入6、9、12、15、18或21g)中的至少一种。所述氮源可为棉籽饼粉(每升发酵培养基加入6、8、10、12或14g)、豆饼粉(每升发酵培养基加入4、6、8、10、12或14g)、大豆蛋白胨(每升发酵培养基加入8、10、12、14或16g)、酪素(每升发酵培养基加入8、10、12、14或16g)、水溶性植物水解蛋白(每升发酵培养基加入1、2、3、4、5、6或7g)、鱼蛋白胨(每升发酵培养基加入8、10、12、14或16g)、酵母粉(每升发酵培养基加入8、10、12、14或16g)和Oxide蛋白胨(每升发酵培养基加入6、8、
10、12、14、16、18或 20g)中的至少一种。所述无机盐可为柠檬酸钠(每升发酵培养基加入2、3、4、5或6g)、NaN03(每升发酵培养基加入4、8、12、16或20g)、CaCl2 (每升发酵培养基加入0. 2、0. 4、0. 6、0. 8或1. Og)、FeSO4 ·7Η20(每升发酵培养基加入0. 6,1. 2,1. 8,2. 4或3. 0g) ,CuSO4 ·5Η20(每升发酵培养基加入 0. 1,0. 2,0. 3,0. 4 或 0. 5g)、ZnC12 (每升发酵培养基加入 0. 1,0. 2,0. 3,0. 4 或 0. 5g)、KH2PO4 (每升发酵培养基加入0. 4、0. 8、1. 2、1. 6或2. 0g) ,MgSO4 (每升发酵培养基加入0. 2、0. 4、0. 6、0. 8或l.Og)和Na2CO3 (每升发酵培养基加入5.0、10. 0或15. Og)中的至少一种。所述溶质及其在所述发酵培养基中的浓度如下葡萄糖5_15g/L、蛋白胨3-8g/L、酵母粉 3-8g/L、KH2PO4 0. 5-1. 5g/L、MgSO4 0. 1-1. Og/L 和 Na2CO3 5_15g/L。所述溶质及其在所述发酵培养基中的浓度具体如下葡萄糖10g/L、蛋白胨5g/L、酵母粉5g/L、KH2P04 lg/L、MgSO4 0. 2-0. 8g/L 和 Na2CO3 10g/L。所述溶质及其在所述发酵培养基中的浓度如下玉米粉18. 0-20. 0g/L (18. 0g/L、18. 9g/L、19. 0g/L 或 20. Og/L)、大豆蛋白胨 6. 0-7. 0g/L (6. 0g/L,6. lg/L、6. 5g/L 或 7. Og/L)、柠檬酸钠 2. 0-6. Og/L(2. 0g/L、4. Og/L 或 6. Og/L)、MgSO4 0. 1-1. 2g/L(0. Ig/L、0. 4g/L、0. 7g/L 或 1. 2g/L)、KH2PO4 1. 0-1. 2g/L(l. 0g/L、l. lg/L 或 1. 2g/L)、CaCl2 0. 2-1. 2g/L(0. 2g/L、l. Og/L 或 1. 2g/L)和 Na2CO3 10. 0g/L。本发明还保护一种制备所述芽孢杆菌BS036的种子液的方法，包括如下步骤将所述芽孢杆菌BS036接种于所述种子培养基中，26-37°C、120-220rpm振荡培养，得到种子液。所述振荡优选为200rpm振荡。所述振荡培养的温度优选为30-34°C，最优选为340C。所述种子液的 OD600 为 0. 5-18. 0 (0. 5、1. 0、3. 0、7. 0、9. 0、12. 0、14. 0 或 18. 0)，优选为3. 0-12. 0，更优选为 7. 0 至 12. 0。本发明还保护一种制备蛋白酶的方法，是发酵所述芽孢杆菌BS036，得到蛋白酶。所述方法包括如下步骤将以上所述方法制备得到的种子液接种于所述发酵培养基中，26-37°C、120-220rpm振荡培养，得到蛋白酶。所述振荡优选为200rpm振荡。所述振荡培养的温度可为26-37°C (洸1、沘1、301、321、341或37°0，优选为30_37°C，最优选为;34°C。所述种子液的接种量可为0.5%-5.0% (0. 5%、1.0%、2. 0%、3. 0%、4. 0%或5. 0% )，优选为1. 5% -5. 0%，最优选为2. 0%。所述振荡培养的时间可为3-48小时，优选为M-40小时，最优选为27-30小时。所述方法还可包括如下步骤将所述振荡培养得到的发酵液12000X g离心lOmin，收集上清，即为粗酶液(含有蛋白酶)。以上所述方法制备得到的蛋白酶也属于本发明的保护范围。本发明还保护采用以上所述方法制备得到的蛋白酶在降解蛋白中的应用。应用所述蛋白酶降解所述蛋白时，采用的温度为20-90°C，采用的pH为5. 0-13. O。所述温度可为20-90 "C (20 °C、30 °C、40 °C、50 °C、55 °C、60 °C、65 °C、70 V、80 °C 或 90 °C )，优选为 60-65 °C。所述pH可为 5. 0-13. 0(5. 0、6. 0、7. 0、8. 0、9. 0,10. 0,11. 0,12. O 或 13. 0)，优选为 10. 0-11. O。所述蛋白具体可为酪蛋白或偶联酪蛋白。所述芽孢杆菌BS036在生产蛋白酶中的应用也属于本发明的保护范围。本发明提供了一株产蛋白酶性能良好的菌株。本发明的蛋白酶生产菌种酶产量高，发酵生产培养基配方简单，廉价原料来源广泛、价格低，发酵周期短，耗能低，蛋白酶生产效率高、成本低。本发明还提供了应用所述菌株高效生产蛋白酶的方法，采用此方法酶的生产周期缩短、产酶稳定、成本低，酶产量可以达到1000-100000U/mL。
图1为PCR扩增菌种BS036的ITS与GyrB基因产物电泳图。图2为芽孢杆菌蛋白酶发酵的培养基因素间相互作用三维空间响应曲面图及对应的二维等高线图A1与A2为玉米粉和大豆蛋白胨的相互作用图；Bl与B2为玉米粉和KH2PO4的相互作用图；Cl与C2为大豆蛋白胨和KH2PO4的相互作用图。图3为聚丙烯酰胺凝胶电泳检测芽孢杆菌BS036不同发酵时期的胞外蛋白酶。图4为利用芽孢杆菌BS036发酵生产蛋白酶的发酵曲线图。
具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。偶联酪蛋白(Azocasein)购自美国Sigma-Aldrich公司，货号为A2765。接种量(%)即种子液与发酵培养基的体积比。蛋白酶酶活测定的方法以偶联酪蛋白(Azocasein)为底物，将底物溶于缓冲液中配成lg/100mL的底物缓冲液；取1. 49mL底物缓冲液在预定温度的水浴中预热5分钟，然后加入10 μ L待测溶液，快速混合，在所述预定温度下反应5分钟，然后加入0.5mL 20%(体积比)三氯乙酸水溶液终止反应，12000Xg离心IOmin收集上清，在440nm波长下测定上清液的光吸收值；一个酶活力单位(U)定义为每分钟光吸收值改变0. 001所需要的酶量。实施例1、菌株BS036的筛选及鉴定一、菌株BS036的筛选利用酪素溶液从肥堆样品中富集蛋白酶生产菌株，在酪素培养基中连续培养，在酪素平板上筛选蛋白水解圈最大的菌株，命名为菌株BS036。二、菌株BS036的生理化学特征鉴定将菌株BS036在固体培养基上培养小时，菌落呈黄色圆球形、湿润粘稠、不透明，菌落随培养时间逐渐变大。通过革兰氏染色和显微镜观察，该细菌为杆状、革兰氏阳性。生理生化实验显示，菌株BS036能够生长于15-40°C、pH 7-11的条件下，具有水解蛋白和淀粉的能力，具体生理生化特征见表1。表1菌株BS036的生理生化特征
权利要求
1.芽孢杆菌(Bacillussp. BS036) BS036，它的保藏编号为 CGMCC NO. 5178。
2.权利要求1所述芽孢杆菌BS036的种子培养基，由溶质和水组成；所述溶质及其在所述种子培养基中的浓度如下葡萄糖4-20g/L、蛋白胨3-8g/L、酵母粉3-8g/L、KH2PO40. 5-1. 5g/L、MgSO4 0. 1-1. Og/L 禾Π Na2CO3 5_15g/L。
3.权利要求1所述芽孢杆菌BS036的发酵培养基，由溶质和水组成；所述溶质由碳源、氮源和无机盐组成；所述碳源为葡萄糖、玉米粉、可溶性淀粉、糖蜜、麦芽糖和小麦麸皮中的至少一种；所述氮源为棉籽饼粉、豆饼粉、大豆蛋白胨、酪素、水溶性植物水解蛋白、鱼蛋白胨、酵母粉和Oxide蛋白胨中的至少一种；所述无机盐为柠檬酸钠、NaNO3^ CaCl2, FeSO4,CuSO4, ZnCl2, KH2PO4, MgSO4 和 Na2CO3 中的至少一种。
4.制备权利要求1所述芽孢杆菌BS036的种子液的方法，包括如下步骤将所述芽孢杆菌BS036接种于权利要求2所述种子培养基中，26-370C、120_220rpm振荡培养，得到种子液。
5.一种制备蛋白酶的方法，是发酵权利要求1所述芽孢杆菌BS036，得到蛋白酶。
6.如权利要求6所述的方法，其特征在于所述方法包括如下步骤将权利要求4所述方法制备得到的种子液接种于权利要求3所述发酵培养基中，26-37°C、120-220rpm振荡培养，得到蛋白酶。
7.权利要求5或6所述方法制备得到的蛋白酶。
8.权利要求7所述蛋白酶在降解蛋白中的应用。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于应用所述蛋白酶降解所述蛋白时，采用的温度为 20-90°C，采用的 pH 为 5. 0-13.0。
10.权利要求1所述芽孢杆菌BS036在生产蛋白酶中的应用。
全文摘要
本发明公开了一株芽孢杆菌及其在生产蛋白酶中的应用。本发明提供的产蛋白酶的芽孢杆菌(Bacillus sp.)BS036，保藏号为CGMCC NO.5178。本发明的蛋白酶生产菌种酶产量高，发酵生产培养基配方简单，廉价原料来源广泛、价格低。本发明还提供了应用所述菌株高效生产蛋白酶的方法，采用此方法酶的生产周期缩短、产酶稳定、成本低，酶产量可以达到1000-100000U/mL。
文档编号C12R1/07GK102559537SQ20111036201
公开日2012年7月11日 申请日期2011年11月15日 优先权日2011年11月15日
发明者吴杰, 温廷益, 邓爱华 申请人:中国科学院微生物研究所