专利名称：一种花粉管介导的玉米原位转基因方法
技术领域：
本发明属于农业生物和现代农业技术领域，涉及一种玉米原位转基因方法。
背景技术：
基因工程作物品种改良和功能基因组研究需要高效的植物转基因技术(转化技术)。玉米是我国主要作物，也是世界的主要作物。应用转基因技术进行品种改良已取得许多成果。但现有转化技术水平还需要改进、创新和发展目前国际上常用的玉米转基因方法主要是基因枪和农杆菌介导法。农杆菌介导的转化方法比基因枪法拷贝数低，具有优越性。然而，用这两个技术的成功转化须建立在受体称之为II型胚性愈伤组织基础之上。但是II型胚性愈伤组织的诱导明显受到基因型的限制，能诱导较高频率II型胚性愈伤组织的基因型目前现在世界上虽在A188等少数材料基础上有所扩展，但大多数材料还不能诱导出Π型胚性愈伤组织，或诱导率低，容易丧失胚性。另一方面，这种基于组织培养技术进行的植物细胞转化，继而通过转化细胞再生达到获得转基因植物的技术，要得到同一基因背景细胞形成的转基因个体，必须在单细胞水平获得转化，然后通过克隆、分化以至产生植株。然而许多植物在组织培养水平是不容易保持完全的细胞一致性，也很难产生单细胞来源的体细胞克隆及背景一致的转基因植株。以生殖系统的可遗传单细胞为受体，是很多研究者正在关注的方法。高等植物的合子是体内个体发育的第一个细胞，具有易分裂和形成胚的能力。子房注射法是用微玻针把外源DNA注射到子房或胚珠中，使其在受精前后或合子胚的旺盛分裂期进入细胞，进而整合到基因组中。王景雪等(2001)用子房注射方法成功地将几丁质酶基因导入到玉米自交系中。但这种方法操作具有盲目性，经验性很强，要一个一个子房操作，好多因素影响转化效率，重复性差。直接以合子为受体的转化，首先建立在合子的分离和体外培养基础上，由于分离和培养技术需要实验室条件及操作人员技能，这种依赖实验室条件的合子转化同样受到限制。刘德璞(2005)发明了用农杆菌侵染活体植株合子的合子原位转化技术，大大提高了以合子为受体的转基因频率和成功率。通过转化花粉，然后用转化的花粉给受体植株授粉，得到转基因种子，不同的种子即可以携带不同DNA背景，一次转化操作可以得到多个不同的转基因个体，更有优越性。以花粉为受体的转化，现使用较多的是，在体外通过各种物理手段向花粉注入外源DNA分子， 如基因枪轰击花粉，超声波处理花粉，再用轰击和处理过的花粉给雌穗授粉。这种方法由于体外处理的影响，结实率低，转化率也不高。再一种是农杆菌浸花技术(Agrobacterium-mediated floral dipping method)。 最早几年，在拟南芥、白菜、苜蓿、萝卜上有成功报道(张广辉等，1998 ;Cao等，2000 ；Trieu 等，2000 ； Curt is等，2001)，在作物上应用的成功事例较少。近几年，在黑麦和小麦的遗传转化上的研究结果证实，这种遗传转化方法在禾本科麦类作物是可行的。在拟南芥中的研究进展，说明农杆菌浸染的目的受体是胚珠，证实转化时间发生在授粉前。
发明内容
本发明要解决的技术问题是公开一种由农杆菌和花粉管共介导的玉米原位转基因方法，即用农杆菌原位侵染已长出的花粉管，实现花粉的遗传转化，再以转化的花粉继续实现自然的受精作用，从而获得转化子种子。本发明要解决的技术方案由以下步骤实现1、种植受体玉米，按正常管理至开花期；2、菌种准备，平板菌种贮藏于4°C冰箱，每周活化一次，一个月后用YEP液体培养基于21°C培养三天至对数期，OD600 = 1，离心取出菌体，重悬至侵染培养基，调节密度在 OD600 = 0 . 7-l，23-25°C摇床培养4_5小时，制成感染液，用来侵染；3、转化操作，在20_25°C天气温度操作，用剪刀将距离雌穗顶端Icm的花丝剪平， 将感染液注入包叶内，滴入量2-4ml，套上纸袋，经过1. 5小时后人工授粉，授粉时，为使较多花粉授粉，将花丝分开，然后授粉，随即套袋再次隔离，管理至结实成熟；4、收获及筛选转化子。待玉米成熟后收获，筛选时，将种子用筛选剂溶液处理，然后播于蛭石介质的盘中筛选，或待出苗后涂抹叶片，选出抗性苗，经分子检测获得阳性株后，移栽至大花盆或直接进入田间。本发明对于以往的技术，有四方面创新1、受体细胞的选择一花粉管。受体是植物转化成功可否的关键。目前玉米的转化国际上通用的基因枪法和农杆菌法都是以可产生胚性愈伤组织的1. 2-1. 5mm大小的幼胚做起始受体，或先实施转化后诱导愈伤组织，或先诱导愈伤组织后实施转化，最后诱导分化再生苗。长期在组织培养条件下细胞容易产生变异而难以保持一致性，这是以体细胞为受体、通过组织培养实施转化的技术遇到的问题和困难。脱离组织培养、以单细胞的生殖细胞为受体，进行遗传转化无疑是可选的有利途径。花粉是配子细胞，是可以产生后代的单细胞，以它为受体，有其优越性。本发明从受体对象出发，意义是明确的。所异之处，以往的直接受体是花粉壁包裹的未萌发花粉细胞，本发明是已生长着的花粉管。花粉萌发之前，有花粉壁在外保护着内容物，轻微的物理方法不易进入其内，强而剧烈的力量要破坏它的生活力。然而当萌发后，内含遗传物质随之进入花粉管前端。 Franklin. Tong(1999)对花粉管的顶端结构作了概括，认为其基本特征是细胞质集中在花粉管的顶端生长区域，线粒体、高尔基体以及内质网等细胞器也包含在这个区域，在花粉管生长过程中，胼胝质塞以规则的间距产生，将细胞质和花粉管的其余部分隔开，而胼胝质塞后面的部分空泡化，因此不论花粉管有多长，细胞质依旧集中于花粉管的前端。很多研究也表明，胼胝质位于花粉管细胞壁的内层，它是花粉管壁的主要组成成分，也是花粉管壁有别于其他体细胞壁的一个明显特征(Geitmann et al，1995 ;Rae，1985)。在被子植物中，顶端花粉管壁上有胼胝质、酯化果胶的沉积，但花粉管极顶端没有。由于花粉管的极性生长， 顶端实际是一个相对运动着的物质区域，它的相对不稳定性是有利于接受外源物质如DNA 的，这为以花粉管作为受体，以温和的手段实施转化提供了细胞学基础。2、转化的基本方法一农杆菌法。如何以花粉为受体实施转化，一些工作者都是以物理的方法(如基因枪、超声波)，离体对花粉进行转化操作，之后以操作后的花粉人工授粉。这无疑要对离体的花粉做保持生命力的工作，创造有利花粉存活和生长的条件，但这样的条条件是比较难以确定的，因此也就难免要损伤相当数量的花粉，包括已转化的和未转化的，随之影响最后的结实率和转化率。农杆菌介导的转化是自然的、温和的生物转化， 在以体细胞为受体的转化中，由于其拷贝数少等优点，现已成为玉米转化的主流方法。但用来侵染转化花粉却存在收集、培养方面的困难，同时花粉壁也是农杆菌转化的一大障碍，难以实行。本发明克服了这一难题，以萌发生长中的花粉管在通过适合花粉管生长同时也适合农杆菌生长并有利其侵染转化的培养液途径中，实现花粉的转化。这就是花粉管的原位转化。3、 不用组织培养一原位转化要实现花粉管原位转化，最基本的要明确两点，并加以解决1)花粉管萌发生长。在自然条件下，只要温度湿度适应，落在柱头上的花粉就可以萌发，无需施加外来营养或激素，我们在考虑培养基时，把此问题搁置在外。但有研究表明， Ca2在花粉管生长过程中起着重要作用，在正常生长的花粉管顶端普遍存在一个极陡的Ca2 浓度梯度(Franklin-Tong et al，1997 ；Pierson et al，1996)，在花粉管生长过程中，花粉管的生长速度受到Ca2的影响(Steer and Steer，1989)。此外，在花粉离体培养中，加入硼 (H3BO3)、锰(MnSO4)对花粉管生长是有利的。我们在培养基的设计上，考虑了这些因素，满足了花丝、花粉和农杆菌的需要。2)然后迫使花粉管粘附农杆菌，并得以转化。这个问题要从注入农杆菌的时间、玉米授粉受精的时间上考虑解决。玉米花丝(雌蕊)较长，花粉管从萌发到抵达卵细胞进行精卵结合需21-24小时，在如此长时间内，农杆菌侵染花粉顶端导致转化大有实现的可能。 最终卵子被转化有两种可能，一是花粉生殖细胞接受了 DNA，进而，通过生长的花粉管进入卵细胞；另一种可能是，农杆菌粘附在花粉管上，花粉管携带细菌到达胚囊后通过目前还未知的机制使卵细胞或合子实现转化。玉米的花粉落在柱头上5分钟即可萌发(植物学教科书)，花粉管生长速度达0. 5cm/h(网络信息)，在花粉萌发1 2h后营养核与生殖核开始向花粉管移动，通常是营养核首先进入花粉管，而后生殖细胞进入，并且以较快的速度移向管端(参考文献)。据此，本发明先在25°C以下的温度下，将农杆菌侵染液注入雌穗顶端，生长一定时间后，用自花花粉人工授粉，让花粉管通过感染区，在行进中完成附着和转化行为。根据试验观察的结果，证实所获转化种子的下代(如果将当代所得种子和种子苗植株按组培转化的TO算，即Tl代)，对潮霉素的抗性与否成1 2 1分离，意味着最大可能是在花粉管生长期间已得到转化，当代获得的种子基因型与常规杂交一样是Aa杂合体，因此在下代呈现正常孟德尔分离。4、用花粉的转化最终实现卵细胞的转化不同于农杆菌浸花技术，在拟南芥中的研究进展，说明农杆菌浸染的目的受体是胚珠，证实转化时间发生在授粉前。本方法在花粉管伸长的行进中完成了转化，不必再对雌穗做任何处理，按常规育种方法套袋隔离，一直到秋收收获种子。将收获的种子于当年冬季即于温室条件下，在种子萌发期间，利用筛选基因对应的筛选剂选出主根长得好的转化子种子，移种至盆中长苗，进一步通过报告基因或PCR等手段确定，接着就可以得到转基因玉米下代种子。或于下年春季在苗期筛选，得到初选苗后，直接进入田间获得转基因后代。通过这些步骤，可以获得较多的转化种子，并且每个种子既是一个独立转基因个体，大大提高了转化率达百分之十以上，而 且也使成功率几乎达到100%。为基因工程育种和基因组学研究提供了很实用的技术。本发明以简单的步骤首先获得较多转化的花粉，再通过自然受精过程获得较多不同基因背景的转基因个体，不仅提高了转化率和成功率，而且可提高为获得不同背景的转基因后代的工作效率。这个方法具有低成本、周期短、转化效率高和基因型限制小的优点，实用性强，容易操作，一般常规育种人员即可于田间进行转基因。同时，由于不用组织培养，为进一步的无选择标记转化建立了基础系统。
具体实施例方式例1、本发明由以下步骤实现(1)种植受体玉米，按正常管理至开花期；(2)菌种准备，平板菌种贮藏于4°C冰箱，每周活化一次，一个月后用YEP液体培养基于21°C培养三天至对数期，OD600 = 1，离心取出菌体，重悬至侵染培养基，调节密度在 OD600 = 1，25°C摇床培养4小时，制成感染液，用来侵染；(3)转化操作，在23°C天气温度操作，用剪刀将距离雌穗顶端Icm的花丝剪平，将感染液注入包叶内，滴入量4ml，套上纸袋，经过1. 5小时后人工授粉，授粉时，为使较多花粉授粉，将花丝分开，然后授粉，随即套袋再次隔离，管理至结实成熟；(4)收获及筛选转化子。待玉米成熟后收获，筛选时，将种子用筛选剂溶液处理， 然后播于蛭石介质的盘中筛选，或待出苗后涂抹叶片，选出抗性苗，经分子检测获得阳性株后，移栽至大花盆或直接进入田间。例2、本发明由以下步骤实现(1)种植受体玉米，按正常管理至开花期；(2)菌种准备，平板菌种贮藏于4°C冰箱，每周活化一次，一个月后用YEP液体培养基于21°C培养三天至对数期，OD600 = 1，离心取出菌体，重悬至侵染培养基，调节密度在 OD600 = 0 . 7，23°C摇床培养5小时，制成感染液，用来侵染；(3)转化操作，在25°C天气温度操作，用剪刀将距离雌穗顶端Icm的花丝剪平，将感染液注入包叶内，滴入量2ml，套上纸袋，经过1. 5小时后人工授粉，授粉时，为使较多花粉授粉，将花丝分开，然后授粉，随即套袋再次隔离，管理至结实成熟；(4)收获及筛选转化子。待玉米成熟后收获，筛选时，将种子用筛选剂溶液处理， 然后播于蛭石介质的盘中筛选，或待出苗后涂抹叶片，选出抗性苗，经分子检测获得阳性株后，移栽至大花盆或直接进入田间。例 3、本发明由以下步骤实现(1)种植受体玉米，按正常管理至开花期；(2)菌种准备，平板菌种贮藏于4°C冰箱，每周活化一次，一个月后用YEP液体培养基于21°C培养三天至对数期，OD600 = 1，离心取出菌体，重悬至侵染培养基，调节密度在OD600 = 0 . 8，24°C摇床培养4. 5小时，制成感染液，用来侵染；(3)转化操作，在20°C天气温度操作，用剪刀将距离雌穗顶端Icm的花丝剪平，将感染液注入包叶内，滴入量3ml，套上纸袋，经过1. 5小时后人工授粉，授粉时，为使较多花粉授粉，将花丝分开，然后授粉，随即套袋再次隔离，管理至结实成熟；(4)收获及筛选转化子。待玉米成熟后收获，筛选时，将种子用筛选剂溶液处理， 然后播于蛭石介质的盘中筛选，或待出苗后涂抹叶片，选出抗性苗，经分子检测获得阳性株后，移栽至 大花盆或直接进入田间。例4、菌液准备带有质粒pl301-GFP 的农杆菌 EHA105 在附加(50mg/L kanamycin) (forpl301) and 50mg/LRif (for AgrobacteriumEHA105)的YEP培养基中生长克隆，甘油储藏管保存在-80°C冰柜。于转化之前1月取出划平板，贮藏于4°C冰箱。每周活化一次，一个月后用时从活化平板划一菌落，接种于含40ml附加(50mg/L Rif，and 50mg/L kanamycin)的YEP 液体培养基的IOOml三角瓶中，于21°C培养三天成液体菌种，4°C贮藏。用时以感染培养基重悬，在室温23-25°C大量培养至对数期，0D600 = 0. 7_1。于23_25°C摇床培养4_5小时， 即用于侵染转化。例5、转化操作受体自交系种植生长至开花受粉期，授粉前注意对雌雄穗做套袋隔离，严防异花受粉。操作当天重悬菌体，23°C左右慢摇4-5小时，当天13:00-14:00注菌。天气温度25°C 以下。用剪刀将距离雌穗顶端Icm外的花丝剪除剪平。将感染液注入包叶内花丝，用手轻挤捏迫使感染液沉下，滴入量5ml左右。套好硫酸纸代。人工授粉时先把花须分开，然后授粉，套上纸袋，记好标记，看护至结实成熟。例6、筛选成熟种子的转基因筛选。将成熟后的种子播种于高8cm、直径6. 5cm的营养钵中， 当幼苗长至三叶期时，以50mg/L浓度的潮霉素涂抹叶片法筛选转化子苗，第1片叶反应后， 为进一步证实抗感性，在第三片叶又涂抹一次。涂抹后5天就见对照和未转化者变黄，有的从绿色直接萎蔫。对95粒种子做筛选，获得32株抗性苗。对这32株苗做PCR分析鉴定， 24个阳性，转化率达25%。例7、GFP基因转化受体铁7922自交系，供体菌株EHA105，载体pl301，基因GFP(绿色荧光蛋白)，选择标记基因Hpt (潮霉素)。按实例3的方法转化，筛选时，先对种子用潮霉素浸泡处理，然后播种于营养钵内萌发。非转基因的不能发芽，而转基因的可以正常出苗长大。取1穗中的100粒种子做筛选，获得16株抗性苗，PCR鉴定13株阳性。转化率13%。将此13株的种子收获，再次种植下一代，开花期取其雄花(接近散粉期)，在共聚交荧光显微镜下观察， 花粉表现荧光反应。所得T2代种子HPT处理的萌发抗感反应呈1 2 1孟德尔分离。T2萌发筛选种子长根数行株穗号播种粒数长根总数无根总数最长总数 19—250401012
注彡3cm的记为最长根，彡0. 5cm的记为无根，彡2cm为中长。
权利要求
1.一种花粉管介导的玉米原位转基因方法，其特征是采用如下步骤完成(1)种植受体玉米，按正常管理至开花期；(2)菌种准备，平板菌种贮藏于4°C冰箱，每周活化一次，一个月后用YEP液体培养基于 21°C培养三天至对数期，OD600 = 1，离心取出菌体，重悬至侵染培养基，调节密度在0D_ = 0. 7-1，23-25°C摇床培养4-5小时，制成感染液，用来侵染；(3)转化操作，在20-25°C天气温度操作，用剪刀将距离雌穗顶端Icm的花丝剪平，将感染液注入包叶内，滴入量2-4ml，套上纸袋，经过1. 5小时后人工授粉；，(4)收获及筛选转化子。待玉米成熟后收获，筛选时，将种子用筛选剂溶液处理，然后播于蛭石介质的盘中筛选，或待出苗后涂抹叶片，选出抗性苗，经分子检测获得阳性株后，移栽至大花盆或直接进入田间。
2.根据权利要求1所述的花粉管介导的玉米原位转基因方法，其特征于授粉时，将花丝分开，然后授粉，随即套袋再次隔离，管理至结实成熟。
全文摘要
一种花粉管介导的玉米原位转基因方法，属于农业生物和现代农业技术领域，采用种植受体玉米、菌种准备、转化操作和收获及筛选转化子步骤完成，其中转化操作是在20-25℃天气温度操作，用剪刀将距离雌穗顶端1cm的花丝剪平，将感染液注入包叶内，滴入量2-4ml，套上纸袋，经过1.5小时后人工授粉。本发明方法具有低成本、周期短、转化效率高和基因型限制小的优点，同时，由于不用组织培养，为进一步的无选择标记转化建立了基础系统。
文档编号C12N15/82GK102392044SQ20111037488
公开日2012年3月28日 申请日期2011年11月23日 优先权日2011年11月23日
发明者刘德璞 申请人:刘德璞