专利名称：一种硫氰酸红霉素的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种硫氰酸红霉素的制备方法，特别涉及一种硫氰酸红霉素的一次水相结晶及丙酮重结晶工艺，属医药生物技术领域。
背景技术：
红霉素是1952年从红色链霉菌培养液中分离出来的一种碱性抗生素，红霉素具有广谱抗菌作用，对革兰阳性菌，如葡萄球菌、化脓性链球菌、绿色链球菌、肺炎链球菌、粪链球菌、梭状芽孢杆菌、白喉杆菌等有较强的抑制作用。对革兰阴性菌，如淋球菌、螺旋杆菌、百日咳杆菌、布氏杆菌、军团菌、以及流感嗜血杆菌、拟杆菌也有相当的抑制作用。我国从1957年试制成功并逐步投入大生产。目前红霉素的提取方法主要是溶剂萃取法，所用萃取溶剂为乙酸丁酯，即在碱性条件下从发酵滤液中用乙酸丁酯萃取，再经其他处理而得最终结晶产品。该工艺主要缺点是乙酸丁酯萃取时溶剂消耗量大。专利CN95105997. 1公开了 “大环内酯类抗生素萃取工艺”，该工艺中，发酵滤液采用萃取剂——八碳醇(正辛醇、异辛醇或仲辛醇)和稀释剂(正己烷、环己烷、正庚烷、磺化煤油或加氢煤油)进行萃取，萃取液用醋酸和醋酸钠缓冲液进行反萃取。该方法存在操作复杂，且用发酵滤液直接萃取，所需有机溶剂需要量大，不利于环境保护及操作安全。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种方法简单，易于掌握的硫氰酸红霉素的一次水相结晶及丙酮重结晶工艺。本发明目的是通过如下技术方案实现的本发明所述的硫氰酸红霉素的制备方法包括如下步骤(1)发酵液浓缩红霉素发酵液用浓度为5 20 %的氢氧化钠溶液调pH为7. 5 9. 0，采用50nm IOOnm孔径的陶瓷膜过滤，过滤液用200分子量的纳滤膜进行浓缩，得到红霉素浓缩液；(2)结晶将红霉素浓缩液置于结晶罐，每十亿单位红霉素加入0. 15 0. 2kg的 5 20%硫氰酸钠溶液，用20 80%的冰醋酸溶液调节pH为5. 5 7. 0，结晶析出硫氰酸红霉素，固液混合物经离心分离得硫氰酸红霉素粗品，硫氰酸红霉素粗品按照1 1 1 8比例加入丙酮，用浓度为5% 20%的氢氧化钠溶液调节pH为9. 5 10. 5，将硫氰酸红霉素转化成红霉素碱，静置，取丙酮溶液，每十亿单位红霉素加入0. 15 0. 2kg的5 20%硫氰酸钠溶液，用20 80%冰醋酸溶液调pH至5. 5 7. 5，按溶解液体积的1 3倍加入45 60°C纯化水，控制结晶温度20 35°C，采用变频电机缓慢搅拌10分钟，再静置降温0. 5 2小时进入离心机分离得硫氰酸红霉素湿品，硫氰酸红霉素湿品离心机中分别用丙酮、45 60°C纯化水淋洗，离心分离直到母液排出，干燥，即得硫氰酸红霉素成品。本发明所述的一种硫氰酸红霉素的制备方法优选如下步骤
(1)发酵液浓缩红霉素发酵液用浓度为10%的氢氧化钠溶液调PH为8. 0 8. 4， 采用50nm IOOnm孔径的陶瓷膜过滤，过滤液用200分子量的纳滤膜进行浓缩，得到红霉素浓缩液。(2)重结晶将红霉素浓缩液置于结晶罐，每十亿单位红霉素加入0. 18kg的10% 的硫氰酸钠溶液，用50%的冰醋酸溶液调节pH为6. 0 6. 5，结晶析出硫氰酸红霉素，固液混合物经离心分离得硫氰酸红霉素粗品，硫氰酸红霉素粗品按照1 4比例加入丙酮，用浓度为8%的氢氧化钠溶液调节pH为9. 8 10. 0，将硫氰酸红霉素转化成红霉素碱，静置分离，分去下层母液取丙酮溶液，每十亿单位红霉素加入0. 18kg的10 %的硫氰酸钠溶液，用 50%冰醋酸溶液调pH至6. 5，按溶解液体积的1. 5倍加入50 55°C纯化水，控制结晶温度 25 30°C，采用变频电机缓慢搅拌10分钟，，静置降温1小时进入离心机分离得硫氰酸红霉素湿品，硫氰酸红霉素湿品分别用丙酮、50 55°C纯化水在离心机中淋洗，干燥，即得硫氰酸红霉素成品。本发明所述的一种硫氰酸红霉素的制备方法优选如下步骤(1)发酵液浓缩红霉素发酵液用浓度为15%的氢氧化钠溶液调pH为7. 8 8. 2， 采用50nm IOOnm孔径的陶瓷膜过滤，过滤液用200分子量的纳滤膜进行浓缩，得到红霉素浓缩液。(2)重结晶将红霉素浓缩液置于结晶罐，每十亿单位红霉素加入0. 15kg的15% 的硫氰酸钠溶液，用40%的冰醋酸溶液调节pH为6. 0 6. 5，结晶析出硫氰酸红霉素，固液混合物经离心分离得硫氰酸红霉素粗品，硫氰酸红霉素粗品按照1 3比例加入丙酮，用浓度为10%的氢氧化钠溶液调节pH为9. 6 9. 8，将硫氰酸红霉素转化成红霉素碱，静置，取丙酮溶液，每十亿单位红霉素加入0. 15kg的15%的硫氰酸钠溶液，用40%冰醋酸溶液调pH 至6. 5，按溶解液体积的1. 0倍加入50 55°C纯化水，控制结晶温度25 30°C，采用变频电机缓慢搅拌10分钟，，静置降温1小时进入离心机分离得硫氰酸红霉素湿品，硫氰酸红霉素湿品分别用丙酮、50 55°C纯化水在离心机中淋洗，干燥，即得硫氰酸红霉素成品。所述红霉素发酵液是按照如下方法制备的(1)红霉素种子液培养①母斜面孢子制备将冷冻保存在砂土管中的红霉素链霉菌(产生菌)孢子(本发明使用的红霉素链霉菌为广东省微生物菌种保藏中心商业上广泛销售的菌种，GIM编号GIM4. 14，其他编号AS4. 198)，接种于经灭菌的斜面培养基上，在温度32 34°C条件下，培养7 9天；②子斜面孢子制备将母斜面孢子，接种于经灭菌的斜面培养基上，在温度32 34°C条件下，培养7 9天；③种子培养将子斜面孢子，接种于经灭菌的种子培养基，经过三级种子扩大培养，得到红霉素种子液；(2)发酵将红霉素种子液按10 20%体积比接种于经灭菌的培养基中，通入无菌空气并搅拌15 30小时，添加营养物质，经过7 10天培养，得红霉素发酵液。上述母斜面孢子制备培养基是由下述组分组成淀粉0. 1 1. 0重量份、玉米浆 0. 05 0. 2重量份、琼脂0. 1 1. 0重量份、葡萄糖0. 1 1. 0重量份、氯化钠0. 5 2. 0 重量份、氯化钙0. 1 1. 0重量份、用自来水定容到100体积份。上述子斜面孢子制备斜面培养基是由下述组分组成淀粉0. 1 1. 0重量份、玉米浆0. 05 0. 2重量份、琼脂0. 1 1. 0重量份、葡萄糖0. 1 1. 0重量份、氯化钠0. 5 2. 0重量份、氯化钙0. 1 1. 0重量份、用自来水定容到100体积份。
上述一级种子扩大培养条件为(1)培养基组成黄豆粉2 4重量份、淀粉1 2 重量份、CaCO3O. 6 0. 8.重量份、糊精1 2重量份、硫铵0. 2 0. 4重量份、玉米浆1 4重量份、植物油0. 5 1重量份、用自来水定容到100体积份；(2)温度为32 34°C; (3) 培养时间48 96小时；上述二、三级种子扩大培养条件为(1)培养基组成黄豆粉2.0 4. 5重量份、淀粉2. 5 4. 0重量份、CaCO3O. 5 0. 7重量份、氯化钠0. 4 0. 6重量份、糊精2. 5 4. 0 重量份、硫铵0. 1 0. 3重量份、玉米浆1 2重量份、植物油0. 8 1. 5重量份、消沫剂 0 0. 02重量份、用自来水定容到100体积份；⑵温度为32 34°C ； (3)培养时间M 48小时。上述发酵培养基组成为黄豆粉3. 5 5. 5重量份、淀粉2. 0 4. 0重量份、硫铵 0. 08 0. 15重量份、CaCO3O. 6 1. 0重量份、植物油0. 5 1. 0重量份、消沫剂0. 005 0. 02重量份、用自来水定容到100体积份。上述添加营养物质组成为液糖10 50重量份、植物油1 10重量份、正丙醇溶液0. 5 5重量份。上述植物油为花生油、菜籽油、大豆油、棉籽油、香油、葵花籽油、橄榄油、莪术油、 大蒜油、沙棘油、当归油、生姜油、连翘油、紫苏油、陈皮油、蓖麻油、薄荷油、肉豆蔻油中的任一种。所述的植物油优选为大豆油、菜籽油中的任一种。所述的液糖为20 70%葡萄糖溶液。所述的正丙醇溶液为20 70%正丙醇溶液。所述的消沫剂为聚醚类消沫剂。所述的聚醚类消沫剂为聚氧丙烯甘油和聚氧乙烯氧丙烯甘油中的任一种或两种的组合物。本发明方法与现有的硫氰酸红霉素制备方法相比的进步性如下1、陶瓷膜过滤未添加硫酸锌、聚合氯化铝等絮凝物，微生物生长繁殖不会受到金属离子抑制，所得滤渣的生化性大为提高，易于开发成有机复合肥和沼气，减少废渣产生; 同时使生产成本大为降低。2、未使用板框，生产现场无需冲洗板框和清洗滤布，场地无水无渣，实现清洁生产。3、采用纳滤膜浓缩工艺后，红霉素的提取浓缩不再使用乙酸丁酯等溶媒对红霉素进行萃取浓缩，有机溶媒的使用和周转量大为减少，企业的安全生产更有保证，无须对提取后的生产废水进行蒸馏回收乙酸丁酯。4、采用纳滤浓缩后，纳滤膜渗透水除有微量的无机盐外，无其它有机物，可作陶瓷膜机组的套用水和机组洗涤用水，节约资源。5、采用一次结晶后，用少量的丙酮重结晶提纯，红霉素A组分可高达90%，硫氰酸红霉素的品质大为提高，有机溶剂使用量大为减少，有利于环保及生产安全。以下的实施例将有助于本领域的普通技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。实验例1对比试验
7
现有硫氰酸红霉素制备方法发酵液放罐后用浓度为10%的氢氧化钠溶液调pH为8. 0 8. 4，之后加入4%的硫酸锌絮凝，絮凝后用板框过滤除去固形物，滤液用冰醋酸溶液调节至PH6. 0 6. 5，再用乙酸丁酯等复合溶媒萃取，溶媒相加入硫氰酸钠和冰醋酸，使硫氰酸红霉素结晶出来，晶体经过洗涤、烘干，即得硫氰酸红霉素。本发明硫氰酸红霉素制备方法(1)发酵液浓缩红霉素发酵液除渣后，用浓度为10%的氢氧化钠溶液调pH为 8. 0 8. 4，采用50nm IOOnm孔径的陶瓷膜过滤，过滤液用200分子量的纳滤膜进行浓缩， 得到红霉素浓缩液。(2)重结晶将红霉素浓缩液置于结晶罐，加入10%的硫氰酸钠溶液(每十亿单位红霉素加入0. 18kg的10%硫氰酸钠溶液)，用50%的冰醋酸溶液调节pH为6. 0 6. 5，结晶析出硫氰酸红霉素，固液混合物经离心分离得硫氰酸红霉素粗品，硫氰酸红霉素粗品按照1 4比例加入丙酮，用浓度为10%的氢氧化钠溶液调节pH为9. 8 10. 0，将硫氰酸红霉素转化成红霉素碱，静置，取丙酮溶液，加入10%的硫氰酸钠溶液(每十亿单位红霉素加入0. 18kg的10%硫氰酸钠溶液)，用50%冰醋酸溶液调pH至6. 5，按溶解液体积的1. 5倍加入50 55°C纯化水，控制结晶温度25 30°C，停搅拌，静置1小时进入离心机分离得硫氰酸红霉素湿品，硫氰酸红霉素湿品分别用丙酮、50 55°C纯化水淋洗，干燥，即得硫氰酸红毒素成品。表一硫氰酸红霉素制备方法的比较
权利要求
1.一种硫氰酸红霉素的制备方法，其特征在于该方法包括如下步骤(1)发酵液浓缩红霉素发酵液浓度为5 20%的氢氧化钠溶液调PH为7.5 9. 0， 采用50nm IOOnm孔径的陶瓷膜过滤，过滤液用200分子量的纳滤膜进行浓缩，得到红霉素浓缩液；(2)结晶将红霉素浓缩液置于结晶罐，每十亿单位红霉素加入0.15 0. 2kg的5 20%硫氰酸钠溶液，用20 80%的冰醋酸溶液调节pH为5. 5 7. 0，结晶析出硫氰酸红霉素，固液混合物经离心分离得硫氰酸红霉素粗品，硫氰酸红霉素粗品按照1 1 1 8 比例加入丙酮，用浓度为5% 20%的氢氧化钠溶液调节pH为9. 5 10. 5，将硫氰酸红霉素转化成红霉素碱，静置，取丙酮溶液，每十亿单位红霉素加入0. 15 0. 2kg的5 20% 硫氰酸钠溶液，用20 80%冰醋酸溶液调pH至5. 5 7. 5，按溶解液体积的1 3倍加入 45 60°C纯化水，控制结晶温度20 35°C，采用变频电机缓慢搅拌10分钟，再静置降温 0. 5 2小时进入离心机分离得硫氰酸红霉素湿品，硫氰酸红霉素湿品离心机中分别用丙酮、45 60°C纯化水淋洗，离心分离直到母液排出，干燥，即得硫氰酸红霉素成品；红霉素发酵液是按照如下步骤制备的(1)红霉素种子液培养①母斜面孢子制备将冷冻保存在砂土管中的红霉素链霉菌 (产生菌)孢子接种于经灭菌的斜面培养基上，在温度32 34°C条件下，培养7 9天；② 子斜面孢子制备将母斜面孢子，接种于经灭菌的斜面培养基上，在温度32 34°C条件下， 培养7 9天；③种子培养将子斜面孢子，接种于经灭菌的种子培养基，经过三级种子扩大培养，得到红霉素种子液；(2)发酵将红霉素种子液按10 20%体积比接种于经灭菌的培养基中，通入无菌空气并开启搅拌，添加营养物质，经过7 10天培养，得红霉素发酵液。
2.如权利要求1所述的硫氰酸红霉素的制备方法，其特征在于该方法包括如下步骤(1)发酵液浓缩红霉素发酵液用浓度为10%的氢氧化钠溶液调pH为8.0 8.4，采用50nm IOOnm孔径的陶瓷膜过滤，过滤液用200分子量的纳滤膜进行浓缩，得到红霉素浓缩液。(2)重结晶将红霉素浓缩液置于结晶罐，每十亿单位红霉素加入0.18kg的10%的硫氰酸钠溶液，用50%的冰醋酸溶液调节pH为6. 0 6. 5，结晶析出硫氰酸红霉素，固液混合物经离心分离得硫氰酸红霉素粗品，硫氰酸红霉素粗品按照1 4比例加入丙酮，用浓度为 8%的氢氧化钠溶液调节pH为9. 8 10. 0，将硫氰酸红霉素转化成红霉素碱，静置分离，分去下层母液取丙酮溶液，每十亿单位红霉素加入0. 18kg的10%的硫氰酸钠溶液，用50%冰醋酸溶液调PH至6. 5，按溶解液体积的1. 5倍加入50 55°C纯化水，控制结晶温度25 30°C，采用变频电机缓慢搅拌10分钟，，静置降温1小时进入离心机分离得硫氰酸红霉素湿品，硫氰酸红霉素湿品分别用丙酮、50 55°C纯化水在离心机中淋洗，干燥，即得硫氰酸红毒素成品。
3.如权利要求1所述的硫氰酸红霉素的制备方法，其特征在于该方法包括如下步骤(1)发酵液浓缩红霉素发酵液用浓度为15%的氢氧化钠溶液调pH为7.8 8. 2，采用50nm IOOnm孔径的陶瓷膜过滤，过滤液用200分子量的纳滤膜进行浓缩，得到红霉素浓缩液。(2)重结晶将红霉素浓缩液置于结晶罐，每十亿单位红霉素加入0.15kg的15%的硫氰酸钠溶液，用40%的冰醋酸溶液调节pH为6. 0 6. 5，结晶析出硫氰酸红霉素，固液混合物经离心分离得硫氰酸红霉素粗品，硫氰酸红霉素粗品按照1 3比例加入丙酮，用浓度为 10%的氢氧化钠溶液调节pH为9. 6 9. 8，将硫氰酸红霉素转化成红霉素碱，静置，取丙酮溶液，每十亿单位红霉素加入0. 15kg的15%的硫氰酸钠溶液，用40%冰醋酸溶液调pH至 6. 5，按溶解液体积的1. 0倍加入50 55°C纯化水，控制结晶温度25 30°C，采用变频电机缓慢搅拌10分钟，，静置降温1小时进入离心机分离得硫氰酸红霉素湿品，硫氰酸红霉素湿品分别用丙酮、50 55°C纯化水在离心机中淋洗，干燥，即得硫氰酸红霉素成品。
4.如权利要求1 3任一所述的硫氰酸红霉素的制备方法，其特征在于所述红霉素母斜面孢子制备培养基是由下述组分组成淀粉0. 1 1. 0重量份、玉米浆0.05 0. 2重量份、琼脂0. 1 1. 0重量份、葡萄糖0. 1 1. 0重量份、氯化钠0. 5 2. 0 重量份、氯化钙0. 1 1. 0重量份，自来水配制。
5.如权利要求1 3任一所述的硫氰酸红霉素的制备方法，其特征在于红霉素子斜面孢子制备培养基是由下述组分组成淀粉0. 1 1. 0重量份、玉米浆0. 05 0. 2重量份、琼脂0. 1 1. 0重量份、葡萄糖0. 1 1. 0重量份、氯化钠0. 5 2. 0重量份、氯化钙0. 1 1.0重量份、用自来水定容到100体积份。
6.如权利要求1 3任一所述的硫氰酸红霉素的制备方法，其特征在于红霉素一级种子扩大培养基组成黄豆粉2 4重量份、淀粉1 2重量份、CaCO3O. 6 0. 8重量份、糊精 1 2重量份、硫铵0. 2 0. 4重量份、玉米浆1 4重量份、植物油0. 5 1重量份、用自来水定容到100体积份。
7.如权利要求1 3任一所述的硫氰酸红霉素的制备方法，其特征在于红霉素一级种子扩大培养温度为32 34°C，培养时间为48 96小时。
8.如权利要求1 3任一所述的硫氰酸红霉素的制备方法，其特征在于红霉素二、三级种子扩大培养基组成为黄豆粉2. 0 4. 5重量份、淀粉2. 5 4. 0重量份、CaCO3O. 5 0. 7 重量份、氯化钠0. 4 0. 6重量份、糊精2. 5 4. 0重量份、硫铵0. 1 0. 3重量份、玉米浆 1 2重量份、植物油0. 8 1. 5重量份、消沫剂0 0. 02重量份、用自来水定容到100体积份。
9.如权利要求1 3任一所述的硫氰酸红霉素的制备方法，其特征在于红霉素二、三级种子扩大培养温度为32 34°C，培养时间为M 48小时。
10.如权利要求1 3任一所述的硫氰酸红霉素的制备方法，其特征在于红霉素发酵培养基组成为黄豆粉3. 5 5. 5重量份、淀粉2. 0 4. 0重量份、硫铵0. 08 0. 15重量份、CaCO3O. 6 1. 0重量份、植物油0. 5 1. 0重量份、消沫剂0. 005 0. 02重量份、用自来水定容到100体积份。
11.如权利要求1 3任一所述的硫氰酸红霉素的制备方法，其特征在于红霉素发酵培养基中添加的营养物质组成为液糖10 50重量份、植物油1 10重量份、正丙醇溶液 0. 5 5重量份。
12.如权利要求11所述的硫氰酸红霉素的制备方法，其特征在于所述的液糖为20 70%葡萄糖溶液。
13.如权利要求11所述的硫氰酸红霉素的制备方法，其特征在于所述的正丙醇溶液为 20 70%正丙醇溶液。
14.如权利要求8所述的硫氰酸红霉素的制备方法，其特征在于所述的消沫剂为聚氧丙烯甘油和聚氧乙烯氧丙烯甘油中的任一种或两种的组合物。
全文摘要
本发明涉及一种硫氰酸红霉素的制备方法，该方法包括如下步骤红霉素发酵液加氢氧化钠调pH值，过滤，浓缩，重结晶得硫氰酸红霉素。本发明方法有机溶剂使用量大为减少，生产成本降低，减少了废渣的产生，有利于环保及生产安全。
文档编号C12R1/465GK102408462SQ20111039617
公开日2012年4月11日 申请日期2011年12月2日 优先权日2011年12月2日
发明者刘思川, 梁隆, 王利春, 程志鹏, 邓芸, 邹太平, 黄海玉 申请人:伊犁川宁生物技术有限公司