专利名称：一种微生物总基因组dna的提取方法
技术领域：
本发明属于环境科学和生物技术科学领域，具体地涉及一种微生物总基因组DNA 的简易提取方法，该方法借助于生物技术手段，获取样品中微生物基因组。
背景技术：
环境样品由于其成分的复杂性在对其进行DNA提取时，想要得到量大，纯度又高的DNA是比较困难的。相对于环境水样中微生物DNA的提取，养殖池塘底泥中微生物DNA提取难度更大。一方面，养殖池塘底泥中微生物种类更为丰富，这就提高了在DNA提取过程中对裂解细胞壁的要求；另一方面，底泥中富含的悬浮物，腐殖质和硫化物等物质，都会影响到所提取到的DNA的纯度，进而影响后续的PCR等实验操作。所以，使环境样品中微生物细胞壁充分裂解释放DNA以及获得纯度较高的DNA样品是养殖池塘底泥微生物总基因组DNA 提取和对底泥微生物多样性分析的关键。本发明解决了养殖池塘底泥微生物总基因组DNA提取中存在的操作时间长，所提取的DNA量少而纯度低等问题，提出了一种微生物总基因组DNA的提取方法，具有DNA释放量大、实验条件简易、成本低等有益效果。
发明内容
本发明提出了一种微生物总基因组DNA的提取方法，包括以下步骤
(1)将TENP洗液加入待提取样品中，再经过8000rpm，4°C，离心得到沉淀；
(2)向所述沉淀加入裂解液和溶菌酶溶液，于37°C进行水浴后，充分涡旋震荡；
(3)加入SDS溶液和蛋白酶K溶液，依次于55°C、70°C下进行水浴，于17000g，4°C，离心
得上清；
(4)用等体积的酚/氯仿/异戊醇抽提液对所述步骤(3)得到的上清进行抽提，经离心得上清，重复用等体积的酚/氯仿/异戊醇抽提液抽提一次；
(5)用等体积的氯仿/异戊醇抽提液抽提，离心得上清；
(6)向所述步骤(5)得到的上清中加入异丙醇，室温下静置，离心得到DNA沉淀；
(7)用乙醇将所述DNA沉淀重悬，离心后弃上清，经干燥得到沉淀；
(8)用成分为IOmMTris-HCl, ImM EDTA, PH=8. 0的TE溶液将所述步骤(7)得到的沉淀溶解，得到所述微生物总基因组DNA，置于-20°C保存备用。当所述待提取样品是含有水分的，所述步骤(2)中进行水浴前还加入玻璃珠，并对待提取样品进行充分涡旋震荡处理。所述的步骤(1)中TENP洗液pH为8 10，添加量为1. 5^3mL,优选添加量为2mL。所述 TENP 洗液成分为 50 m mol/L Tris, 20 m mol/L EDTA，100 m mol/L NaCl, 0. 59Γ2. 5%w/v聚乙烯基吡咯烷酮。其中，聚乙烯基吡咯烷酮的优选添加量为l%w/v。所述的步骤(2)中，所述裂解液成分为IM Tris-HCl,0. 5M EDTA，0. 5M Na3P04,1. 5M NaCl, 1% CTAB ；所述溶菌酶溶液添加量为200 400 μ L，浓度为10_80mg/mL。
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所述的步骤(3)中，SDS溶液浓度为20% 25%W/v，添加量为100 200 μ L ；蛋白酶K 浓度为15-30mg/mL，添加量为50 100μ L。所述的步骤(4)中酚/氯仿/异戊醇抽提液中酚、氯仿、异戊醇的体积比例为 25:24:1ο所述的步骤(5)中氯仿/异戊醇抽提液中氯仿、异戊醇的体积比例为对:1。所述的步骤(6)中所述异丙醇的加入体积是步骤(5)得到的上清体积的0. 6倍。所述的步骤(7)中所述乙醇为预冷的70%乙醇，添加量为广1. 5mL。本发明目的之一在于解决养殖池塘底泥微生物总基因组DNA提取过程中操作时间长，试剂价格昂贵以及提取到的DNA量少、纯度不够等问题。该方法可以很好的破裂革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌的细胞壁，大量除去样品中的腐殖质和蛋白质，所得的DNA可以用于PCR-DGGE技术，能较准确地反映出底泥环境中细菌微生物的丰度和种群多样性。本发明将采集到的样品先用洗液洗涤，然后经过玻璃珠，裂解液和溶菌酶的作用， 使细菌细胞充分破裂，释放DNA。将获得的粗提DNA经过酚/氯仿/异戊醇抽提后得到纯化。按照本发明得到的DNA样品纯度较高，可直接用于后续的PCR等实验操作，且本发明操作简单，耗时短，一次可处理多个样品，非常适合在实验室条件下进行简单的DNA提取。针对养殖池塘底泥类样品中微生物总基因组DNA的提取，本发明具体操作步骤如下
(1)把待提取样品放入离心管中，用洗液除去样品中的腐殖酸，SOOOrpm,4°C，离心后得到样品沉淀；
(2)所得的沉淀中加入玻璃珠，裂解液和溶菌酶溶液，37°C水浴Ih后，充分涡旋，使细菌充分裂解释放DNA ；
(3)离心管中加入SDS溶液和蛋白酶K溶液，使蛋白变性或降解，55°C水浴20min，7(TC 水浴 IOmin, 17000g, 4°C，离心 IOmin 得上清；
(4)所得的上清转移至干净离心管中，用等体积酚/氯仿/异戊醇抽提液抽提两次，离心得上清；
(5)上清转移至干净离心管中，用等体积氯仿/异戊醇抽提液抽提一次，离心得上清；
(6)所得的上清中加异丙醇沉淀DNA，室温下静置一段时间，离心取沉淀；
(7)所得的DNA沉淀用乙醇重悬，离心后弃上清，干燥沉淀；
(8)所得的沉淀用TE溶液溶解，得到微生物总基因组DNA，并置于-20°C保存备用。上述步骤中洗液TENP的pH为10左右，可以有效地除去腐殖质。上述步骤⑵中溶菌酶的浓度为50mg/mL，添加量为300 μ L，涡旋时间为5 10min。上述步骤(3)中SDS浓度为25%w/v，添加量为100 μ L ；蛋白酶K的浓度为20mg/ mL，添加量为60 μ L。上述TE 溶液的成分为 10mmol/L Tris-Hcl，lmmol/L EDTA，溶液 pH=8。本发明上述方法也可适用于其他土壤中微生物DNA的提取，若待测样品是干燥的土壤，可以省去适用于含有水分的底泥类样品的玻璃珠，改为先用液氮研磨处理样品后，再按本发明其他步骤进行操作。本发明方法是利用物理、化学和酶等多种方法对细胞壁进行裂解，从而最大限度地释放DNA;另外，实验中所用的所有试剂和仪器都是基础的生物学实验用品，容易获得且价格低廉。使用本发明得到的DNA样品，可直接用于16 S rDNA片段的扩增，得到的DGGE 图谱能较准确地反映环境样品中细菌的丰度和多样性。
图1养殖池塘底泥微生物基因组DNA电泳图谱。图2养殖池塘底泥微生物基因组DNA 16S rDNA扩增电泳图谱。图3养殖池塘底泥微生物基因组DNA PCR-DGGE电泳图谱。
具体实施例方式结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的保护内容不局限于以下实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。实施例上海市金山区漕泾养殖基地对虾养殖池塘底泥微生物DNA提取 1.底泥样品的前期处理
1. 1取底泥样品0. 2g加入已灭菌的2mL TENP洗液(50 m mol/L Tris, 20 m mol/ L EDTA, 100 m mol/L NaCl，l%w/v 聚乙烯基吡咯烷酮，pH=10)，涡旋混勻，65°C水浴!3min， SOOOrpm离心5min，取沉淀。重复1步骤2 3次，直至上清变得较透明。2.底泥样品中微生物细胞壁裂解
2.1向1. 1步骤获得的沉淀中加入约6粒直径为Imm的玻璃珠，ImL的裂解液(IM Tris-HCl, 0. 5M EDTA，0. 5M Na3P04,1. 5M NaCl, 1% CTAB)禾口 300 μ L 50mg/mL 的溶菌酶溶液， 涡旋震荡5 10min，37°C水浴Ih以上。3.底泥样品种粗DNA的获取
3.1向2. 1的离心管中再加入60 μ L 20mg/mL蛋白酶K溶液和100 μ L 25%SDS溶液，55°C水浴20min，7(TC水浴IOmin ； 17000g，4°C，离心lOmin，取上清；加等体积酚/氯仿 /异戊醇(体积比25 24 :1)提取液，混勻，12000g，4°C，离心5min，取上清；用酚/氯仿/异戊醇(体积比25 24 :1)提取液再抽提一次，取上清；加等体积氯仿/异戊醇(体积比M :1) 提取液，混勻，12000g, 4°C，离心5min，取上清。4.底泥样品微生物基因组DNA的获取
4. 1在3. 1所得上清中加0. 6倍体积的异丙醇，室温下静置30min以上，5400g， 4°C，离心5min，取沉淀；加入预冷的70%的乙醇，5400g, 4°C，离心5min，一次性倒尽上清，沉淀干燥 15min，用 50μ L IXTE 溶液(IOmM Tris-HCl, ImM EDTA，ΡΗ=8. 0)溶解沉淀，得到底泥样品中微生物总基因组DNA样品，将样品置于-20°C下冷冻保存。
使用实施例中所用方法提取上海市金山区漕泾养殖基地对虾池底泥样品DNA，可以得到清亮的DNA条带，经紫外分光光度测定，所得样品0拟60/0拟80的值在1. 6^1. 9之间，表明所提到的DNA蛋白含量较低。本实施例提取得到的养殖池塘底泥微生物基因组DNA 电泳检测结果如图1所示。图1中，第1泳道为λ -Hind πι Marker，第2泳道为养殖池塘进水口处底泥中微生物的总基因组DNA，条带大小在IOOOObp左右，第3泳道养殖池塘中部底泥中微生物的总基因组DNA，条带大小在IOOOObp左右，第4泳道养殖池塘出水口处底泥中微生物的总基因组DNA，条带大小在IOOOObp左右。从条带亮度来看，本实施例提取得到的养殖池塘中部底泥中微生物的总基因组DNA量较大，且条带清晰说明提取到的DNA完整性较好。为了验证所提取到的DNA样品能否用于分子生物学分析，将实验得到的DNA样品用细菌16S rDNA V3区特异性引341F/534R进行扩增，PCR扩增后，取分别取5 μ L和IOyL 进行琼脂糖电泳和变性梯度凝胶电泳，电泳结果如图2和图3所示。图2为养殖池塘底泥微生物基因组DNA 16S rDNA扩增电泳图谱；其中，第1泳道为空白对照，第2泳道为养殖池塘进水口处底泥中微生物的总基因组DNA，条带大小在 200bp左右，第3泳道为养殖池塘中部底泥中微生物的总基因组DNA，条带大小在200bp左右，第4泳道为养殖池塘出水口处底泥中微生物的总基因组DNA，条带大小在200bp左右，第 5 泳道 DL-2000Markero图3为养殖池塘底泥微生物基因组DNA PCR-DGGE电泳图谱；其中，第1泳道养殖池塘进水口处底泥中微生物的总基因组DNA，第2泳道养殖池塘中部底泥中微生物的总基因组DNA，第3泳道泳道养殖池塘出水口处底泥中微生物的总基因组DNA。从实验结果可以看出样品中微生物种类丰富，优势菌条带明显，进一步验证了本发明方法能够较好地实现微生物总基因组DNA的提取，所提取的DNA样品经16 S rDNA片段的扩增能够准确反映环境样品中细菌的丰度和多样性。
权利要求
1.一种微生物总基因组DNA的提取方法，其特征在于，包括以下步骤(1)将TENP洗液加入待提取样品中，再经过8000rpm，4°C，离心得到沉淀；(2)向所述沉淀加入裂解液和溶菌酶溶液，于37°C进行水浴后，充分涡旋震荡；(3)加入SDS溶液和蛋白酶K溶液，依次于55°C、70°C下进行水浴，于17000g，4°C，离心得上清；(4)用等体积的酚/氯仿/异戊醇抽提液对所述步骤(3)得到的上清进行抽提，经离心得上清，重复用等体积的酚/氯仿/异戊醇抽提液抽提一次；(5)用等体积的氯仿/异戊醇抽提液抽提，离心得上清；(6)向所述步骤(5)得到的上清中加入异丙醇，室温下静置，离心得到DNA沉淀；(7)用乙醇将所述DNA沉淀重悬，离心后弃上清，经干燥得到沉淀；(8)用TE溶液将所述步骤(7)得到的沉淀溶解，得到所述微生物总基因组DNA，置于-20°C保存备用。
2.如权利要求1所述的微生物总基因组DNA的提取方法，其特征在于，当所述待提取样品是含有水分的，所述步骤(2)中进行水浴前还加入玻璃珠，并对待提取样品进行涡旋震荡。
3.如权利要求1所述的微生物总基因组DNA的提取方法，其特征在于，所述的步骤(1) 中TENP洗液pH为8 10，添加量为1. 5 3mL，优选添加量为2mL。
4.如权利要求2所述的微生物总基因组DNA的提取方法，其特征在于，所述TENP洗液成分为 50 m mol/L Tris, 20 m mol/L EDTA，100 m mol/L NaCl，0. 5% 2. 5%w/v聚乙烯基吡咯烷酮；其中，聚乙烯基吡咯烷酮的优选添加量为l%w/v。
5.如权利要求1所述的微生物总基因组DNA的提取方法，其特征在于，所述的步骤(2) 中，所述裂解液成分为 IM Tris-HCl,0. 5M EDTA，0. 5M Na3P04,1. 5M NaCl，1% CTAB ；所述溶菌酶溶液添加量为20(Γ400μ L，浓度为10-80mg/mL。
6.如权利要求1所述的微生物总基因组DNA的提取方法，其特征在于，所述的步骤(3) 中，SDS溶液浓度为20% 25%w/v，添加量为100 200 μ L ；蛋白酶K浓度为15_30mg/mL，添加量为 50^100 μ L0
7.如权利要求1所述的微生物总基因组DNA的提取方法，其特征在于，所述的步骤(4) 中酚/氯仿/异戊醇抽提液中酚、氯仿、异戊醇的体积比例为25:24:1。
8.如权利要求1所述的微生物总基因组DNA的提取方法，其特征在于，所述的步骤(5) 中氯仿/异戊醇抽提液中氯仿、异戊醇的体积比例为1。
9.如权利要求1所述的微生物总基因组DNA的提取方法，其特征在于，所述的步骤(6) 中所述异丙醇的加入体积是步骤(5)得到的上清体积的0. 6倍。
10.如权利要求1所述的微生物总基因组DNA的提取方法，其特征在于，所述的步骤 (7)中所述乙醇为预冷的70%乙醇，添加量为广1. 5mL。
全文摘要
本发明公开了一种微生物总基因组DNA的提取方法，向待提取样品中加入裂解液和溶菌酶，使细菌细胞充分破裂并释放DNA；将获得的粗提DNA经过酚/氯仿/异戊醇提取液抽提后得到经纯化的微生物总基因组DNA。本发明提取方法具有DNA释放量大、实验条件简易、成本低等有益效果。
文档编号C12N15/10GK102409041SQ20111040592
公开日2012年4月11日 申请日期2011年12月8日 优先权日2011年12月8日
发明者常忠义, 王亭芳, 赵云龙, 金风杰, 高红亮 申请人:华东师范大学