专利名称：敲除氧-甲基转移酶基因获得格尔德霉素衍生物的方法
技术领域：
本发明涉及利用分子生物学手段，通过敲除参与链霉菌活性代谢产物生物合成的基因获得新化合物的方法。
背景技术：
以格尔德霉素(geldanamycin)为代表的苯醌安莎类化合物(benzoquinone ansamycin)是目前研究最多、效果很好的抗肿瘤化合物之一。此类化合物的抗肿瘤机制是与肿瘤细胞中的热休克蛋白(heat shock protein)Hsp90特异结合，导致肿瘤细胞内许多需要Hsp90维持功能的重要蛋白质迅速降解，从而抑制肿瘤细胞的生长或引发肿瘤细胞死亡。虽然格尔德霉素具有很强的抗肿瘤活性，但因其毒副作用大、水溶性差和稳定性差，不适合临床使用。通过对格尔德霉素一些化学基团进行修饰，可以提高其活性并降低毒性。目前多种极具潜力的格尔德霉素衍生物已经进入临床实验，这些化合物的共同特点是在格尔德霉素的碳-17位进行了不同程度的修饰。苯醌安莎化合物的生物合成是以3-氨基-羟基苯甲酸为起始物，通过聚酮合酶 (polyketide synthase, I3KS)逐步加入一些延伸元件如乙酸、丙酸和羟基乙酸等，形成一个聚酮的核心结构，最后再经过后修饰酶进行修饰而成。目前国内外对于此类化合物的生物合成研究表明，其合成核心结构的PKS酶很相似，主要区别在于后修饰，其中最为重要的是碳-17位的修饰，修饰的结果对该类化合物的抗肿瘤活性及细胞毒性具有很重要的影响。虽然多个苯醌安莎化合物生物合成的基因簇已经克隆，如吸水链霉菌 hygroscopicus)WSL 3602中格尔德霉素生物合成基因簇和吸水链霉菌AM 3672中的除莠霉素(herbimycin)基因簇等，但是编码参与17-氧甲基化的酶的基因一直未能找到。我们从一株产格尔德霉素的放线菌新种一一自溶链霉菌 autolyticus CGMCC 0516) (ZL 00134063. 8)中克隆并测序了格尔德霉素生物合成的全基因簇，首次发现了编码参与碳-17位修饰的氧-甲基转移酶基因，并通过体内和体外实验证明了此基因的功能，有关该基因的研究尚未见报道。在此基础上，我们对自溶链霉菌野生型菌株进行了遗传改造，负责格尔德霉素生物合成途径中碳-17位甲基化的氧-甲基转移酶基因(^/―)被敲除后，菌株完全丧失了产生格尔德霉素的能力，却能够产生17-氧-去甲基格尔德霉素(17-0-Demethyl-geldanamycin)和17-氨基-17-去甲氧基格尔德霉素(17-Amino-17-demethoxy-geldanamycin)。其中17-氧-去甲基格尔德霉素可作为格尔德霉素碳-17位改造的起始物质，通过结构改造可能获得具有更好药理学特性的抗肿瘤药物。而 17-氨基-17-去甲氧基格尔德霉素是目前最有前途的格尔德霉素类抗肿瘤药物，目前正由美国hfinity !Pharmaceuticals开发，并进入一期临床试验。但是17-氨基_17_去甲氧基格尔德霉素的生物合成至今未见报道。本发明涉及的17-氧-去甲基格尔德霉素和17-氨基-17-去甲氧基格尔德霉素可以通过所构建的氧-甲基转移酶基因敲除工程菌发酵产生，与化学合成方法相比，更加经济、环保，并可持续利用。CN 102533896 A
发明内容
本发明构建了自溶链霉菌的全基因文库，以和/基因片段为探针通过菌落原位杂交和Southern杂交筛选获得格尔德霉素生物合成基因簇，采用鸟枪法对所克隆基因簇DNA序列进行了测定，并从中发现了苯醌安莎类化合物生物合成基因簇中都未见报道的氧-甲基转移酶基因，此基因编码氧-甲基转移酶的功能经体内和体外实验证实。采用 Red/ET 一步PCR法构建了该氧-甲基转移酶基因的敲除突变株，发酵产物分析表明，所构建氧-甲基转移酶基因敲除工程菌能够产生17-氧-去甲基格尔德霉素和17-氨基-17-去甲氧基格尔德霉素。本发明提供了构建该氧甲基转移酶基因敲除工程菌的方法，以及通过发酵获得17-氧-去甲基格尔德霉素和17-氨基-17-去甲氧基格尔德霉素的方法。本发明所涉及的17-氧-甲基转移酶基因全长678个核苷酸，蛋白质全长225个氨基酸。本发明基因工程菌自溶链霉菌autoIyticus, CGMCC 0516)氧-甲基转移酶(GdmMT) 突变株保藏于中国典型培养物保藏中心(0^0)，地址武汉大学，保藏编号M 2011200, 保藏日期2011年6月16日。
图1.自溶链霉菌CGMCC 0516中格尔德霉素生物合成基因簇。(A)以探针1和探针2筛选得到覆盖格尔德霉素生物合成全基因簇粘粒质粒PBS17001，pBS17002和pBS17003 ； (B) 格尔德霉素生物合成基因簇的遗传组成及相关ORF的推测功能；(C)格尔德霉素可能的合成途径。图2.表达纯化的氧-甲基转移酶。1为低分子量蛋白标准，2为纯化的氧-甲基转移酶蛋白。图3.不同pH对氧-甲基转移酶活性的影响。图4.不同金属离子对氧-甲基转移酶活性的影响。图5.氧-甲基转移酶敲除突变株的构建及Southern杂交分析。(A)突变株的构建策略；(B)Southern杂交分析，其中1为BamR I酶切的野生型菌株基因组DNA，2为及
I酶切的突变株基因组DNA。图6.氧-甲基转移酶敲除突变株的产物检测。I 格尔德霉素标样；II :17-氧-去甲基格尔德霉素标样；III =Ag-/突变株产物；IV 野生型菌株产物V -AgdmMT r勉； VI 互补菌株产物；VII 失活的氧-甲基转移酶催化17-氧-去甲基格尔德霉素反应产物； VIII 氧-甲基转移酶催化17-氧-去甲基格尔德霉素反应产物； 17-氨基-17-去甲氧基格尔德霉素。
具体实施例方式
1.自溶链霉菌中格尔德霉素生物合成基因簇的克隆和测序
以粘粒质粒PHAQ34为载体构建自溶链霉菌的全基因文库，首先用部分酶切自溶链霉菌染色体DNA，回收40 1Λ左右片段，去磷酸化处理后与I酶切的 pHAQIM连接，连接产物经包装后转染大肠杆菌(fecAericAia coli ) XLl Blue MR建立基因文库。以PCR扩增的gdmN (探针1，扩增引物为5 ‘ -AAGGTGATGGGCCTGGCGCC-3 ‘ 和 5 ‘ -CGCGCGGTGCCGTCCACATG-3 ‘)和 gdmAI (探针 2，扩增弓丨物为 5' -TGCTGAGGCTGGATTGGG-3‘和 5' -ACAGAACCAGGATCAGGAGACC-3‘)基因片段为探针，通过菌落原位杂交和Southern杂交筛选阳性克隆，利用DNA酶切分析和末端序列测定将格尔德霉素生物合成基因簇定位于粘粒质粒PBS17001、pBS17002和pBS17003 (图1A)。以 PSmart为载体分别构建了 3个序列测定质粒文库，然后对所构建测序文库中的插入片段进行DNA序列测定，序列经kqScape拼接后得到格尔德霉素生物合成基因簇的完整序列。2.氧-甲基转移酶基因的验证
借助NCBI网站的ORF finder, glimmer和BLAST等工具对格尔德霉素基因簇进行分析，推测各开放阅读框架(open reading frame, 0RF)功能(图IB)及格尔德霉素可能的合成途径(图1C)。根据氨基酸序列同源性确定可能编码氧-甲基转移酶的基因(^/―)，其含有三个特征性的依赖于SAM的甲基转移酶结构域和与二价阳离子结合的D)(D)(D结构域。 以pBS17003为模板采用PCR扩增卯ferr基因(扩增引物5' -GGAATTCCATATGCCGTCCACACTG CACAC-3‘和 5' -CCCAAGCTTCAGCCGAGCCGCACACCCG-3')，克隆至载体 pET48a(+)中构建表达质粒PBS17009。将PBS17009转化至大肠杆菌BL21中，通过IPTG诱导表达此氧-甲基转移酶(GdmMT)，并采用亲和层析纯化GdmMT。纯化的GdmMT在SDS-PAGE电泳中为单一条带，表观分子量为沈kDa,与通过序列计算的26. 2 kDa相符(图2)。此GdmMT在SAM存在下能够在体外催化17-去甲基格尔德霉素生成格尔德霉素，催化反应的最佳pH值为7. 0 (图3)，最佳金属离子为Mg2+ (图4)。3.氧-甲基转移酶基因敲除突变株的构建
采用Red/ET —步PCR法构建氧-甲基转移酶基因的插入突变(图5A)。在此方法中， 首先以PHY773为模板采用PCR扩增两端带有与氧_甲基转移酶基因同源序列的aac (3) IV 基因插入盒(引物为 5 ‘ -CTATCCGGTGACCGTGTCGACCCTGAAGGAGATCGCATGATTCCGGGGATCCGTCG ACC-3‘和5' -GGCCGCCCCCGGGAACAGCGCCGTCCAGCGGAGCGCTCATGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3')， 然后通过电转化把PCR扩增片段导入含PIJ790和目的基因即氧-甲基转移酶基因的大肠杆菌中，筛选阿泊拉霉素(Apramycin)抗性的结合转移子获得插入突变基因。利用结合转移把突变基因导入野生型自溶链霉菌中，通过同源重组构建氧-甲基转移酶基因的敲除突变株SB17002。此突变株经PCR和Southern杂交验证(图5B)，其中PCR验证所有引物为 5 ‘ -TGCACCCCGACTACCAGG-3 '和 5 ‘ -CGCCGGAAGAAGAATCTATCC-3 ‘，制备 Southern 杂交探针的PCR引物为 5' -GCGACTGGTCGAAGTGGTGTTC-3‘和5' -CGGTGGAGCGGCAGATTGA-3‘。 同时构建此突变株的互补菌株，以PBS17003为模板PCR扩增野生型gdmMT基因(引物为 5 ‘ -GGAATTCCATATGGGGCCTGAGATCGAGATTGC-3'和 5 ‘ -CGGGATCCTCAGCCGAGCCGCACACCCGC CAGGATG-3 ‘)，扩增片段克隆至带有份7 俠启动子的质粒pBS9010中，然后利用结合转移把互补质粒导入SB17002中获得互补菌株SB17003。4.氧-甲基转移酶基因敲除突变株发酵产物的检测
自溶链霉菌菌株的新鲜孢子接种至50 mL TSB培养基中，于^°C、250 rpm培养40小时制备发酵种子液，然后以1 %的接种量接种0.5 mL种子液至发酵培养基中(2 %豆粉，0.2 %蛋白胨，2 %葡萄糖，0.5 %可溶性淀粉，0.2 %酵母浸膏，0.4 % NaCl, 0. 05 % K2HPO4, 0.05 % MgSO4,0. 2 % CaCO3),于 28。C、250 rpm 发酵培养 5 天。发酵液离心(3500 g，30 分钟)取上清，用乙酸乙酯抽提两次，然后经硅胶柱层析及半制备HPLC进行纯化，洗脱液蒸干后溶于丙酮并进行分析。所构建氧-甲基转移酶基因敲除突变株失去产生格尔德霉素的能力，而产生新的化合物17-氧-去甲基格尔德霉素和17-氨基-17-去甲氧基格尔德霉素(图6)。化合物结构经质谱和1H^3C核磁共振分析确认。 序列表
<110> 云南大学
<120>敲除氧-甲基转移酶基因获得格尔德霉素衍生物的方法 <130>氧甲基转移酶 <160> 2
<170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 678 <212> DNA
<213> 自溶链霉菌autolyticus) <400> 1
tcagccgagc cgcacacccg ccaggatccc gtgtgcgacg ggcaggcgca gtgcgagata 60
gccgctggaggggtcggcgaggtagtcccgcatctcacggtgcatatcgaagccgaagtc120catgtccatgtcgtccacgagcaccagcgcgccccggcgcagccggggttccaccacctc180gagcaccgcgcggttgaggttgggccagccgtccatcagcaggaggtccaccgactcggg240cagctcccgcagggtctcccgtgcgtcgccgacccggacgctcgcgatgtcggagaggcc300ggcggcggcgatggcctccgtggccctggccaccttgtccgcctggagctccgtgccgat360cacctgcccgCCgCCgttgtcccgtaccgcgctggccaggtagagggtggacacgccgaa420agaggtcccgtactcgacgacggtcctggcgccggtcgcgcgggtgagcaggtagagcag480ctcaccgccttccttggacaccgacatggaggcgtccttgaacgtctcggccatctggcc540ggcatccagctcggcccaggccgccttcgggtcggtcacaccggtctcggcgaacgcgcg600ctcgtcgccttcgcgctcggcctccagcagtccgtccaggacggtcgccacgggctcggt660
gtgcagtgtg gacggcat <210> 2
<211> <212> <213> <400> Met 1
Leu
225 PRT
自溶链霄菌(Streptomyces autolyticus )
2
Pro Ser Thr Leu His Thr 5
Leu Glu Ala Glu Arg Glu 20
Gly Val Thr Asp Pro Lys 35
Met Ala Glu Thr Phe 50
Glu Leu Leu
Glu Pro 10
Gly Asp
25 Ala
Val Ala Thr Val 15
Glu Arg Ala Phe 30 Leu Asp
Leu Asp Gly
Ala Glu Thr
Ala Gly Gln
Gly 65
Tyr 70
Lys 55 Leu
Ala Ala Trp Ala Glu 4045
Asp Ala Ser Met Ser Val Ser Lys Glu Gly 60
Leu Thr Arg Ala Thr Gly Ala Arg Thr Val 7580
678Val Glu Tyr Gly Thr Ser Phe Gly Val Ser Thr Leu Tyr Leu Ala Ser
859095
Ala Val Arg Asp Asn Gly Gly Gly Gln Val lie Gly Thr Glu Leu Gln
100105110
Ala Asp Lys Val Ala Arg Ala Thr Glu Ala lie Ala Ala Ala Gly Leu
115120125
Ser Asp lie Ala Ser Val Arg Val Gly Asp Ala Arg Glu Thr Leu Arg
130135140
Glu Leu Pro Glu Ser Val Asp Leu Leu Leu Met Asp Gly Trp Pro Asn 145150155160
Leu Asn Arg Ala Val Leu Glu Val Val Glu Pro Arg Leu Arg Arg Gly
165170175
Ala Leu Val Leu Val Asp Asp Met Asp Met Asp Phe Gly Phe Asp Met
180185190
His Arg Glu Met Arg Asp Tyr Leu Ala Asp Pro Ser Ser Gly Tyr Leu
195200205
Ala Leu Arg Leu Pro Val Ala His Gly lie Leu Ala Gly Val Arg Leu 210215220
Gly 22权利要求
1.利用敲除氧-甲基转移酶基因获得格尔德霉素衍生物的方法，其特征在于构建氧-甲基转移酶基因插入突变，获得氧-甲基转移酶基因突变菌株，发酵产生17-氧-去甲基格尔德霉素和17-氨基-17-去甲氧基格尔德霉素等格尔德霉素衍生物。
2.根据权利要求1所述的构建氧-甲基转移酶基因插入突变，其特征在于采用Red/ET 一步PCR法在质粒上构建该突变基因。
3.根据权利要求1所述的构建氧-甲基转移酶突变菌株，其特征在于采用接合转移导入突变基因，同源重组获得具阿泊拉霉素抗性标识的工程菌株。
4.根据权利要求1所述的产物发酵，其特征在于将氧-甲基转移酶突变工程菌进行发酵培养，对发酵产物进行提取、HPLC检测和质谱及1H^3C核磁共振分析。
全文摘要
本发明所提供的敲除氧-甲基转移酶基因获得格尔德霉素衍生物的方法涉及利用分子生物学手段敲除参与链霉菌活性代谢产物生物合成的基因获得新化合物的方法。本发明克隆并测序了自溶链霉菌中格尔德霉素生物合成基因簇，发现并通过实验验证了在苯醌安莎类化合物生物合成基因簇中都未见报道的氧-甲基转移酶基因。采用Red/ET一步PCR法构建了此基因的插入突变并通过同源重组获得其敲除突变株。所构建的氧-甲基转移酶基因敲除菌株发酵可获得格尔德霉素衍生物17-氧-去甲基格尔德霉素和17-氨基-17-去甲氧基格尔德霉素，它们可作为抗肿瘤药物或合成类似抗肿瘤药物的前体。采用本发明所提供的方法构建工程菌合成这两种化合物比其它方法更加经济和环保。
文档编号C12R1/465GK102533896SQ20111040518
公开日2012年7月4日 申请日期2011年12月7日 优先权日2011年6月17日
发明者尹敏, 沈奔, 赵立兴, 韩§ 林, 鲁涛 申请人:云南大学