专利名称：一种人气道上皮细胞的培养方法
技术领域：
本发明是一种人气道上皮细胞的培养方法，属于生物技术领域。
背景技术：
气管或支气管是下呼吸道的重要组成部分，气道上皮细胞是呼吸道的重要防御屏障，已有研究发现，反复的呼吸道感染与粘膜上皮功能失调密切相关，因此，气道上皮细胞是探寻C0PD、哮喘等呼吸系统常见疾病发病机制的重要研究材料。气道上皮细胞离体后， 生物学特性尚未发生变化，能在一定程度上反映体内状态，并显示亲体组织的形态学特征和细胞生物学特性，因此体外气道上皮细胞的原代培养和细胞株的建立是研究亲体组织生物学特性的有效手段，同时也为研究呼吸道疾病发病机制及其防治措施提供研究工具。另外，我国的气管移植技术一直处于实验研究阶段，组织工程气管是气管移植的重要手段，而气道上皮细胞作为种子细胞是组织工程气管中不可缺少的部分，因此找到一种简便、高效的气道上皮培养方法对研究呼吸系统疾病发病机制以及开展气管移植都具有重要的意义。目前，气道上皮细胞的培养方法主要有胰酶和/或蛋白酶消化结合机械剥离粘膜法和/或机械刮刷法，这些方法都存在以下缺点(1)机械剥离粘膜法/机械刮刷法是采用镊子等器械在气管或支气管上进行钝性分离，其操作难度大，且在剥离过程中容易损伤上皮细胞，获得的存活细胞少，且细胞活力差。( 胰酶消化/蛋白酶消化法是采用胰酶/ 蛋白酶溶液对气管或支气管进行消化处理，以获得上皮细胞，但是胰酶/蛋白酶的消化力很强，且消化时间不易掌握，易对上皮细胞造成损失，细胞获得率少，细胞存活率低且活力差。另外，尚存在以下原因导致以人气道上皮细胞为来源的细胞培养受到限制1.肺脏为一开放性脏器，因此获得的气道在进行细胞培养的过程中易发生污染，同时由于患者气道含有大量粘蛋白等渣滓而增加了细胞分离的难度；2.可用于分离气道上皮细胞的标本，都是从手术切除下来的具病灶的部位，标本数量有限，且标本中的正常的气管或支气管很少， 如采用一般的气道上皮细胞培养方法，对细胞损伤大、获得率低再加上细胞贴附能力差，最后成活的细胞数量极少；3.气道上皮细胞原代培养中，最容易引进成纤维细胞污染，成纤维细胞生长快、活力好，具有生长优势，最终造成原代气道上皮细胞培养失败。
发明内容
本发明的目的是提供一种高效、简便、高纯度的人气道上皮细胞的培养方法。本发明的目的通过以下技术方案实现一种人气道上皮细胞的培养方法，包括以下步骤(1)获取原代培养的人气道上皮细胞取离体人气管或支气管，用消化培养基在 40C消化M 4 后收集气道上皮细胞，然后接种至培养皿中，用完全培养基进行原代细胞培养，获得原代培养的人气道上皮细胞；(2)获取传代培养的人气道上皮细胞当原代细胞达到70 90%融合密度后，用磷酸缓冲液(PBS)溶液清洗，加入CN 102433296 A
说明书
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0. 25%胰蛋白酶溶液，室温消化5 10分钟，当细胞出现回缩、悬浮时，收集细胞悬浮液，加入含有蛋白酶抑制剂的等量溶液，离心收集细胞，然后以1 6X106细胞/ml的浓度接种于新的含完全培养基的培养皿中进行培养，3 5天细胞生长至对数生长期，获得传代培养的人气道上皮细胞。所述步骤O)中胰蛋白酶溶液中含0.02%乙二胺四乙酸(EDTA)；在培养皿中，每 IOOmm单孔板的胰蛋白酶溶液的用量为1ml。所述步骤⑵中蛋白酶抑制剂为大豆胰蛋白酶抑制剂(Soybean Trypsin hhibitor)，浓度为 0. 5 lmg/ml。所述步骤(1)中获取原代培养人气道上皮细胞的具体步骤为1>在显微镜下分离弃除气管或支气管上所有额外的结缔组织，然后切成小段组织块，用预冷的生理盐水清洗，将分离干净的气管或支气管浸泡在浸泡培养基中，涡旋震荡 30 60s后，浸泡5 lOmin，接着用洗涤培养基冲洗干净，把洗好的组织块置于离心管内， 加入消化培养基，4°C，在摇床上以转速50 60r/min消化气管或支气管组织块M 48h ；2>取出经消化的气管或支气管组织块倒入培养皿中，加入胎牛血清至终体积浓度为10 20%，纵向剪开气管，用细胞刷轻刮内表面，然后用磷酸缓冲液冲洗内表面和细胞刷，收集含有脱落细胞的溶液，4°C离心5min后，用洗涤培养基清洗细胞，4°C离心5min后， 用完全培养基重悬细胞；3>用完全培养基调整细胞密度，以1 6X IO5细胞/ml的密度接种于培养板中， 于37°C、5% CO2培养箱内静置培养2 3天，得到原代培养的人气道上皮细胞。本发明所述的步骤1>中所述的浸泡培养基、洗涤培养基和消化液的用量以没过气管或支气管组织为宜。所述的涡旋震荡条件为1000 1200r/min，所述的小段组织块的长度为5 10cm。本发明所述的完全培养基为含95 105U/ml青霉素和95 105U/ml链霉素的 BEGM培养基
本发明所述的洗涤培养基为含95 105U/ml青霉素和95 105U/ml链霉素的 MEM 培养基(minima essential medium)。本发明所述的浸泡培养基为含95 105U/ml青霉素、95 105U/ml链霉素、0. 5 lmg/ml的二硫代苏糖醇(Dithiothreitol，DTT)和0. 5 lXl(T2mg/ml的脱氧核糖核酸酶 (DNase)的MEM培养基。本发明所述的消化培养基为含95 105U/ml青霉素、95 105U/ml链霉素、终浓度为0. 5 lmg/ml的XIV型蛋白酶(ProteaseXIV)和0. 5 IX l(T2mg/ml的脱氧核糖核酸酶(DNase)的MEM培养基。本发明所述步骤O)中采用的培养皿为包被了 0.05 0.1%的IV型胶原蛋白 (Collagen type IV)的普通的细胞培养皿。该培养皿的具体制作方法是①IOXCollagen type IV的配制10ml超纯水中加入20ul乙酸，混勻，加入 0.05 0. Img Collagen type IV ；②培养皿制备100mm培养皿加入IOXCollagen type IV 1. 5 2. 5ml，摇勻，使其平铺在培养皿上，之后每半小时摇勻一次，两小时后吸弃剩余液体，在超净台中风干，紫外灭菌。
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本发明与现有的技术相比有以下优点1.本发明的培养方法技术稳定，重复性好，培养的细胞纯度高，形态均一，生长良好，且可以连续传代。2.本发明是在显微镜直视下，选择性的去除气管或支气管表面的多余组织，有效减少成纤维细胞的污染且避免损伤气道上皮细胞；采用温和的还原剂DTT和脱氧核糖核酸酶去除气管或支气管表面粘蛋白和核酸；采用特定的含XIV型蛋白酶的消化液在低温环境下缓慢消化，消化液中含有基本培养基，在消化的同时保证细胞的活性，且消化液反应温和，只消化细胞间质而不会对细胞膜造成损伤，使细胞贴壁率及成活率显著提高，培养2 3天即可得到纯度为95%以上的气道上皮细胞。另外，气道上皮是假复层纤毛柱状上皮，仅有一层细胞，用此法可最大限度的保证原代培养细胞的数量和质量。3.本发明的培养方法中使用的培养皿中包被有胶原蛋白IV，上皮细胞在这样的培养皿上生长，有效地提高了上皮细胞的贴壁性，通常情况下，在培养约他后上皮细胞就能几乎完全贴壁，为气道上皮细胞原代培养的成功奠定了扎实基础。4.本发明提供的方法获得的细胞经过倒置显微镜观察及细胞免疫组化鉴定具有典型的气道上皮细胞的形态及特点，为进一步研究C0PD、哮喘等呼吸系统疾病的发病机制奠定了有利实验基础，并且作为组织工程气管的种子细胞，为组织工程提供了充足细胞源。
图1是普通倒置显微镜图2是普通倒置显微镜图3是普通倒置显微镜图4是普通倒置显微镜图5是普通倒置显微镜图6是普通倒置显微镜图7是普通倒置显微镜
100X)下后的人支气管上皮细胞。 100X)下1 后的人支气管上皮细胞。 100X)下2天后的人支气管上皮细胞。 400X)下3天后的人支气管上皮细胞。 100X)下5天后的人支气管上皮细胞。 100 X)下传代后1天的人支气管上皮细胞。
:100X)下第二代人支气管上皮细胞。 图8a是免疫组化法鉴定第二代人支气管上皮细胞，用角蛋白免疫细胞染色，DAB 显色，细胞质呈棕黄色阳性反应。 图8b是免疫组化法鉴定的作为阴性对照的第二代人支气管上皮细胞。
具体实施例下面结合实例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式并不仅限于此，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用技术手段，在不脱离本发明上述基本技术思想的前提下，还可以做出其它多种形式的衍化、替换或变更。实施例11.主要实验材料(1)细胞来源因肺癌等疾病行肺叶切除手术，取切除所得的离体肺叶的远端肺组织标本。(2)洗涤培养基溶液95U/ml的青霉素、95U/ml的链霉素加入MEM培养基(minima essential medium)。
(3)浸泡培养基是洗涤培养基中加入终浓度为0.5mg/ml的二硫代苏糖醇和 0. 5X10-2mg/ml的脱氧核糖核酸酶。(4)消化液培养基是洗涤培养基中加入终浓度为0.5mg/ml的XIV型蛋白酶和 0. 5X10-2mg/mL的脱氧核糖核酸酶。(5)完全培养基含95U/ml青霉素和95U/ml链霉素的BEGM培养基。(6)包被 0. 05% Collagen type IV 的培养皿的制备①IOXCollagen type IV的配制10ml的超纯水中加入20ul的乙酸，混勻，加入 0. 05mg 的 Collagen type IV。②培养皿的制备在IOOmm的普通的细胞培养皿加入1. 5ml的10XCollagen type IV，摇勻，使其平铺在培养皿上，之后每半小时摇勻一次，两小时后吸弃剩余液体，在超净台中风干，紫外灭菌。以上(1) (5)所有溶液配制好经0. 22 μ m滤膜过滤除菌。2.人支气管上皮细胞的培养方法2. 1获取人支气管1)将标本置于体视显微镜下，沿气管解剖结构用显微镊和显微剪于显微镜下钝性分离气管周围组织，在此过程中需反复用生理盐水冲洗以使视野清晰；2)将分离获得的支气管剪下后放入预冷的生理盐水中反复漂洗至肉眼观察支气管壁干净光滑，调高显微镜的放大倍数，于显微镜下使用显微镊和显微剪小心剥离支气管外残留脂肪及纤维组织外膜，然后用洗涤培养基反复冲洗去除多余结缔组织；2. 2获取原代培养的人支气管上皮细胞1)将支气管切成5cm的小段组织块，用预冷的双抗生理盐水清洗，浸泡在浸泡培养基内，浸泡培养基没过组织即可，然后lOOOr/min涡旋震荡30s，再浸泡5min，接着用洗涤
培养基冲洗气管三次；2)将洗好的组织块放入50ml的锥形离心管中，加入消化培养基至没过组织，4°C， 在摇床上以转速60r/min消化气管Mh ；3)将消化好的组织及消化液倒入IOOmrn培养皿中，加入胎牛血清到终体积浓度为 10%以中和XIV型蛋白酶。纵向剪开气管，用细胞刷轻刮内表面，然后用磷酸缓冲液(PBS) 冲洗内表面和细胞刷，用50ml的锥形离心管收集含有脱落细胞的溶液。500g，4°C离心5min 后，弃上清，用洗涤培养基清洗细胞，500g，4°C离心5min后，用完全培养基重悬细胞，细胞计数；4)第二天，绝大部分单细胞已贴壁，细胞团漂浮，用50ml离心管收集旧完全培养基，500g，4°C离心5min。然后用PBS冲洗离心管一次，再加入IOml新鲜制备的含有2mM EDTA, 0. 5mg/mL DTT, 0. 25mg/ml 胶原酶(collagenase)，10ug/ml DNase 的洗涤培养基，37°C 温育15min，然后加胎牛血清到10% (V/V)，500g，4°C离心5min，弃上清，计数，调整细胞密度，以IXlO5细胞/ml的密度种植于培养板，置于37°C、5% CO2培养箱内静置培养。2. 3获取传代培养的人支气管上皮细胞当原代细胞生长密度达70%后，即可传代。届时，用IOmlPBS溶液清洗细胞3次， 加入Iml 0. 25% (m/v)含0. 02% EDTA的胰蛋白酶溶液室温消化5分钟，当出现大量悬浮细胞时，加入含有0. 5mg/ml大豆胰蛋白酶抑制剂的等量溶液，离心收集细胞，然后以1 X IO6
7细胞/ml的浓度接种于新的含完全培养基的培养皿中进行培养，5天细胞生长至对数生长期，获得传代培养的人支气管气道上皮细胞。3.培养结果3. 1倒置相差显微镜下观察原代培养气道上皮细胞刚种植的细胞呈圆形、透亮、 单个均勻分布。原代培养的人支气管上皮细胞生长他左右可见多数细胞贴壁。大部分为多角形细胞，呈铺路石状，还有一些体积较小的圆形细胞和少量体积较大的圆形细胞(图1和 2)。2天后细胞有融合趋势，呈多角形镶嵌排列，细长梭形细胞呈放射状或涡旋状分布，胞核多为卵圆形，多数细胞为单核，少数细胞有双核或三核，核大居中，细胞质透明，无颗粒，细胞间排列紧密(图幻。3天后细胞数量明显增多呈积聚性生长，可见细长梭形细胞与铺路石样细胞互相掺杂，生长细胞间常有突起相连(图4)。5天细胞生长达到对数期生长，部分区域细胞重叠堆积生长(图5)。3. 2倒置相差显微镜下观察传代培养气道上皮细胞细胞生长速度较原代细胞明显加快。传代后3天生长为单层细胞，形态与原代相似，但细胞体积有所增大，并逐渐拉长 (图6禾口 7)。3. 3细胞免疫组化鉴定用鼠抗人细胞角蛋白(AE1/AE3)单克隆抗体进行免疫组化鉴定，细胞质呈棕黄色，细胞核为深蓝色(图8a)，同时不加鼠抗人细胞角蛋白单克隆抗体作为阴性对照进行免疫组化鉴定，只可见细胞核为深蓝色(图8b)。具体步骤参见福州迈新生物技术开发有限公司生产的即用型免疫组织化学超敏UltraSensitve SP试剂盒 (KIT-9710)说明书进行。在光镜下计数阳性着色细胞数。纯度(％)=阳性着色细胞数/ 细胞总数X100%，重复3次取平均值。每张片随机选取5个视野，每个视野至少检测200 个细胞。计算每个视野中细胞纯度，平均达95%以上。实施例21.主要实验材料(1)细胞来源因肺癌等疾病行肺叶切除手术，取切除所得的离体肺叶的远端肺组织标本。(2)洗涤培养基溶液105U/ml的青霉素、105U/ml的链霉素加入MEM培养基。(3)浸泡培养基是洗涤培养基中加入终浓度为lmg/ml的二硫代苏糖醇和 1 X 10_2mg/ml的脱氧核糖核酸酶。(4)消化液培养基是洗涤培养基中加入终浓度为lmg/ml的XIV型蛋白酶和 1 X 10_2mg/mL的脱氧核糖核酸酶。(5)完全培养基含105U/ml青霉素和105U/ml链霉素的BEGM培养基。(6)包被0. 1% Collagen type IV的培养皿的制备①IOXCollagen type IV的配制10ml的超纯水中加入20ul的乙酸，混勻，加入 0. Img 的 Collagen type IV。②培养皿的制备在IOOmm的普通的细胞培养皿加入2. 5ml的10XCollagen type IV，摇勻，使其平铺在培养皿上，之后每半小时摇勻一次，两小时后吸弃剩余液体，在超净台中风干，紫外灭菌。以上(1) (5)所有溶液配制好经0. 22 μ m滤膜过滤除菌。2.人支气管上皮细胞的培养方法
2. 1获取人支气管1)将标本置于体视显微镜下，沿气管解剖结构用显微镊和显微剪于显微镜下钝性分离支气管周围组织，在此过程中需反复用生理盐水冲洗以使视野清晰。2)将分离获得的支气管剪下后放入预冷的生理盐水中反复漂洗至肉眼观察支气管壁干净光滑，调高显微镜的放大倍数，于显微镜下使用显微镊和显微剪小心剥离支气管外残留脂肪及纤维组织外膜，然后用洗涤培养基反复冲洗去除多余结缔组织。2. 2获取原代培养的人支气管上皮细胞1)将支气管切成IOcm的小段组织块，用预冷的双抗生理盐水清洗，浸泡在浸泡培养基内，浸泡培养基没过组织即可，然后1200r/min涡旋震荡60s，再浸泡5min，接着用洗涤
培养基冲洗支气管三次；2)将洗好的组织块放入50ml的锥形离心管中，加入消化培养基至没过组织，4°C， 在摇床上以转速50r/min消化气管36h ；3)将消化好的组织及消化液倒入IOOmm培养皿中，加入胎牛血清到终体积浓度为 20%以中和XIV型蛋白酶。纵向剪开气管，用细胞刷轻刮内表面，然后用磷酸缓冲液PBS冲洗内表面和细胞刷，用50ml的锥形离心管收集含有脱落细胞的溶液。500g，4°C离心5min 后，弃上清，用洗涤培养基清洗细胞，500g，4°C离心5min后，用完全培养基重悬细胞，细胞计数；4)第二天，绝大部分单细胞已贴壁，细胞团漂浮，用50ml离心管收集旧完全培养基，500g，4°C离心5min。然后用PBS冲洗离心管一次，再加入IOml新鲜制备的含有2mM EDTA，0. 5mg/mLDTT，0. 25mg/ml 胶原酶(collagenase)，10ug/ml DNase 的洗涤培养基，37°C 温育lh。然后加胎牛血清到10% (V/V)，500g，4°C离心5min，弃上清，计数，调整细胞密度， 以IXlO5细胞/ml的密度种植于培养板，置于37°C、5% CO2培养箱内静置培养。2. 3获取传代培养的人支气管上皮细胞当原代细胞生长密度达90%后，即可传代。届时，用IOmlPBS溶液清洗细胞3次， 加入Iml 0. 25% (m/v)含0. 02% EDTA的胰蛋白酶溶液室温消化10分钟，当出现大量悬浮细胞时，加入含有lmg/ml大豆胰蛋白酶抑制剂等量溶液，离心收集细胞，然后以6 X IO6细胞/ml的浓度接种于新的含完全培养基的培养皿中进行培养，3天细胞生长至对数生长期， 获得传代培养的人支气管气道上皮细胞。3.培养结果结果与实施例一相同。实施例31.主要实验材料(1)细胞来源因肺气肿等严重肺部疾病行肺移植手术，取切除所得的离体肺组织标本。(2)洗涤培养基溶液105U/ml的青霉素和105U/ml的链霉素加入MEM培养基。(3)浸泡培养基是洗涤培养基中加入终浓度为lmg/ml的二硫代苏糖醇和1 X 10_2/ ml的脱氧核糖核酸酶。(4)消化液培养基是洗涤培养基中加入终浓度为lmg/ml的XIV型蛋白酶和 1 X 10_2mg/mL的脱氧核糖核酸酶。
(5)完全培养基含105U/ml青霉素和105U/ml链霉素的BEGM培养基。(6)包被0. 1% Collagen type IV的培养皿的制备①IOXCollagen type IV的配制10ml的超纯水中加入20ul的乙酸，混勻，加入 0. Img 的 Collagen type IV。②培养皿的制备在IOOmm的普通的细胞培养皿加入2. 5ml的10XCollagen type IV，摇勻，使其平铺在培养皿上，之后每半小时摇勻一次，两小时后吸弃剩余液体，在超净台中风干，紫外灭菌。以上(1)-( 所有溶液配制好经0. 22 μ m滤膜过滤除菌。2.人支气管上皮细胞的培养方法2. 1获取人气管1)将标本置于体视显微镜下，沿气管解剖结构用显微镊和显微剪于镜下快速钝性分离气管周围组织，在此过程中需反复用生理盐水冲洗以使视野清晰；2)将分离获得的气管剪下后放入预冷的生理盐水中反复漂洗至肉眼观察气管壁干净光滑，调高显微镜的放大倍数，于显微镜下使用显微镊和显微剪小心剥离气管外残留脂肪及纤维组织外膜，然后用洗涤培养基反复冲洗去除多余结缔组织；2. 2获取原代培养的人气管上皮细胞1)将气管切成5cm的小段组织块，用预冷的双抗生理盐水清洗，浸泡在浸泡培养基内，浸泡培养基没过组织即可，然后1200r/min涡旋震荡60s，再浸泡5min，接着用洗涤培
养基冲洗气管三次；2)将洗好的组织块放入50ml的锥形离心管中，加入消化培养基至没过组织，4°C， 在摇床上以转速55r/min消化气管48h ；3)将消化好的组织及消化液倒入IOOmm培养皿中，加入胎牛血清到终体积浓度为 20%以中和XIV型蛋白酶。纵向剪开气管，用细胞刷轻刮内表面，然后用磷酸缓冲液PBS冲洗内表面和细胞刷，用50ml的锥形离心管收集含有脱落细胞的溶液。500g，4°C离心5min 后，弃上清，用洗涤培养基清洗细胞，500g，4°C离心5min后，用完全培养基重悬细胞，细胞计数；4)第二天，绝大部分单细胞已贴壁，细胞团漂浮，用50ml离心管收集旧完全培养基，500g，4°C离心5min。然后用PBS冲洗离心管一次，再加入IOml新鲜制备的含有2mM EDTA, 0. 5mg/mLDTT, 0. 25mg/ml 胶原酶，10ug/ml DNase 的洗涤培养基，37°C温育 lh。然后加胎牛血清到10% (V/V)，500g，4°C离心5min，弃上清，计数，调整细胞密度，以1父105细胞/ ml的密度种植于培养板，置于37°C、5% CO2培养箱内静置培养。2. 3获取传代培养的人气管上皮细胞当原代细胞生长密度达80%后，即可传代。届时，用IOmlPBS溶液清洗细胞3次， 加入Iml 0. 25% (m/v)含0. 02% EDTA的胰蛋白酶溶液室温消化10分钟，当出现大量悬浮细胞时，加入含有lmg/ml大豆胰蛋白酶抑制剂的等量溶液，离心收集细胞，然后以6X106 细胞/ml的浓度接种于新的含完全培养基的培养皿中进行培养，3天细胞生长至对数生长期，获得传代培养的人气管气道上皮细胞。3.培养结果结果与实施例一相同。
权利要求
1.一种人气道上皮细胞的培养方法，其特征在于，包括以下步骤(1)获取原代培养的人气道上皮细胞取离体人气管或支气管，用消化培养基在4°c消化M 4 后收集气道上皮细胞，然后接种至培养皿中，用完全培养基进行原代细胞培养， 获得原代培养的人气道上皮细胞；(2)获取传代培养的人气道上皮细胞当原代细胞达到70 90%融合密度后，用磷酸缓冲液溶液清洗，加入0. 25%胰蛋白酶溶液，室温消化5 10分钟，当细胞出现回缩、悬浮时，收集细胞悬浮液，加入含有蛋白酶抑制剂的等量溶液，离心收集细胞，然后以1 6X106细胞/ml的浓度接种于新的含完全培养基的培养皿中进行培养，3 5天细胞生长至对数生长期，获得传代培养的人气道上皮细胞。
2.根据权利要求1所述的人气道上皮细胞的培养方法，其特征在于，所述步骤( 中胰蛋白酶溶液中含0. 02%乙二胺四乙酸；在培养皿中，每IOOmm单孔板的胰蛋白酶溶液的用量为Imlo
3.根据权利要求1所述的人气道上皮细胞的培养方法，其特征在于，所述步骤( 中蛋白酶抑制剂为大豆胰蛋白酶抑制剂，浓度为0. 5 lmg/ml。
4.根据权利要求1所述的人气道上皮细胞的培养方法，其特征在于，所述步骤(1)中获取原代培养人气道上皮细胞的具体步骤为1>在显微镜下分离弃除气管或支气管上所有额外的结缔组织，然后切成小段组织块， 用预冷的生理盐水清洗，将分离干净的气管或支气管浸泡在浸泡培养基中，涡旋震荡30 60S后，浸泡5 lOmin，接着用洗涤培养基冲洗干净，把洗好的组织块置于离心管内，加入消化培养基，4°C，在摇床上以转速50 60r/min消化气管或支气管组织块M 48h ；2>取出经消化的气管或支气管组织块倒入培养皿中，加入胎牛血清至终体积浓度为 10 20%，纵向剪开气管，用细胞刷轻刮内表面，然后用磷酸缓冲液冲洗内表面和细胞刷， 收集含有脱落细胞的溶液，4°C离心5min后，用洗涤培养基清洗细胞，4°C离心5min后，用完全培养基重悬细胞；3>用完全培养基调整细胞密度，以1 6X IO5细胞/ml的密度接种于培养板中，于 37°C,5% CO2培养箱内静置培养2 3天，得到原代培养的人气道上皮细胞。
5.根据权利要求1所述的人气道上皮细胞的培养方法，其特征在于，所述的步骤1>中所述的浸泡培养基、洗涤培养基和消化液的用量要没过气管或支气管组织；所述的涡旋震荡条件为1000 1200r/min，所述的小段组织块的长度为5 10cm。
6.根据权利要求1所述的人气道上皮细胞的培养方法，其特征在于，所述的完全培养基为含95 105U/ml青霉素和95 105U/ml链霉素的BEGM培养基。
7.根据权利要求1所述的人气道上皮细胞的培养方法，其特征在于，所述的洗涤培养基为含95 105U/ml青霉素和95 105U/ml链霉素的MEM培养基。
8.根据权利要求1所述的人气道上皮细胞的培养方法，其特征在于，所述的浸泡培养基为含95 105U/ml青霉素、95 105U/ml链霉素、0. 5 lmg/ml的二硫代苏糖醇和0. 5 1 X 10_2mg/ml的脱氧核糖核酸酶的MEM培养基。
9.根据权利要求1所述的人气道上皮细胞的培养方法，其特征在于，所述的消化培养基为含95 105U/ml青霉素、95 105U/ml链霉素、终浓度为0. 5 lmg/ml的XIV型蛋白酶和0. 5 1 X 10_2mg/ml的脱氧核糖核酸酶的MEM培养基。
10.根据权利要求1所述的人气道上皮细胞的培养方法，其特征在于，所述步骤O)中采用的培养皿为包被了 0. 05 0. 的IV型胶原蛋白的普通的细胞培养皿。
全文摘要
本发明公开了一种人气道上皮细胞的培养方法，包括以下步骤(1)获取原代培养的人气道上皮细胞；(2)获取传代培养的人气道上皮细胞当原代细胞达到70～90％融合密度后，用磷酸缓冲液溶液清洗，加入0.25％胰蛋白酶溶液，室温消化5～10分钟，当细胞出现回缩、悬浮时，收集细胞悬浮液，加入含有蛋白酶抑制剂的等量溶液，离心收集细胞，然后以1～6×106细胞/ml的浓度接种于新的含完全培养基的培养皿中进行培养，3～5天细胞生长至对数生长期，获得传代培养的人气道上皮细胞。本发明的培养方法技术稳定，重复性好，培养的细胞纯度高，形态均一，生长良好，且可以连续传代。
文档编号C12N5/071GK102433296SQ201110416809
公开日2012年5月2日 申请日期2011年12月13日 优先权日2011年12月13日
发明者何建行, 卢文菊, 巩雪芳, 张晨婷, 徐小明, 王健, 钟南山, 陈豫钦 申请人:呼吸疾病国家重点实验室, 广州医学院第一附属医院