专利名称：用于表达miRNA和/或蛋白的载体及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种用于表达miRNA和/或蛋白的表达载体及其应用。
技术背景
miRNA是真核生物中一类长度约为22核苷酸，参与基因转录后水平调控的非编码小分子RNA，成熟的miRNA是由较长的可折叠形成发卡结构的前体转录物经过Dicer酶或类似于Dicer酶的内切核酸酶加工而来。miRNA基因存在于基因组的间隔区域或者内含子当中。这些小分子的RNA通过碱基配对与靶mRNA序列的3’ UTR区结合来调控基因的表达。 目前人们对miRNA的生物合成过程已经了解比较清楚，细胞内编码的miRNA的基因首先在 RNA聚合酶II的作用下发生转录，形成长度约为几百个核苷酸的初级转录产物pri-miRNA， 初级转录产物在RNaseIII家族酶-Drosha的参与下被加工成只含60-70nt具有茎环结构的单个miRNA前体pre-miRNA ；在另一个RNaseIII家族酶-Dicer的参与下，miRNA前体被加工为双链的miRNA，随后接连形成单链成熟的miRNA。miRNA的转录所需的转录酶与蛋白表达所需的转录酶都属于RNA聚合酶II，因此可以使用同一个II型转录启动子。
目前较为常用的miRNA表达载体一般是在利用某一特定的miRNA基因的 5' -flanking region和3’ -flanking region作为克隆位点来连接体外合成发卡形状的 miRNA的前体。由于miRNA在基因组中的位置的特殊性，决定了在体外情况下，普通的miRNA 表达载体中无法插入外源蛋白进行表达。这就限制了载体的用途。发明内容
本发明的目的是提供一种用于表达miRNA和/或蛋白的表达载体。
本发明所提供的表达载体是由线性载体pcDNA6. 2-GW/EmGFP_miR和两端各有一个粘性末端的双链DNA片段连接而成的环状表达载体；所述线性载体pcDNA6. 2-GW/ EmGFP-miR的两个末端和所述双链DNA片段的两个粘性末端相连，并且两个连接处均形成限制性内切酶BsmB I的识别位点。限制性内切酶BsmB I的识别位点及酶切位点为 5'-......CGTCTC(N)1 τ......-3'
3，-......GCAGAG(N)5a......_5，
上述序列中带下划线部分为限制性内切酶BsmB I的识别位点，三角形代表酶切位点。BsmB I切出的位点有四个碱基的粘性末端，这几个碱基是随机的碱基，没有序列特异性，因此可用BsmB I切出pcDNA6. 2-Gff/EmGFP-miR粘性末端的四个碱基，这样就不会破坏pcDNA6. 2-Gff/EmGFP-miR载体自身携带的flanking region的核苷酸序列也就不会影响miRNA的表达，因此发明人设计使所述两个连接处均形成限制性内切酶BsmB I的识别位点ο
实际操作中，可在所述双链DNA片段的内部添加限制性内切酶Dra I的识别位点。关于Dra I的设计，在图1中可以看出在5’侧翼序列(5’ -flanking region)的前端有EmGFP的序列，此序列前后都有Dra I酶切位点，在此序列的后面有终止密码子(后一个Dra I后，5’ -flanking region前面，miRNA的表达不受影响)，因此，此线性的末端不能直接连接蛋白表达。在试验中，本发明人在插入的多克隆位点中间加入一个Dra I酶。加上插入的Dra I，该质粒中共有三个Dra I位点，用Dra I酶切正好切除EmGFP和5，-flanking region的区域，而不破坏EmGFP前面的启动子，因此蛋白可以正常表达。
所述DNA片段的一条链为如下a) -c)中
a)其核苷酸序列为序列表中序列2 ；
b)其核苷酸序列为在序列表中序列2的第11位和第12位核苷酸之间再插入1-50 个脱氧核糖核苷酸后所组成的序列；所述1-50个脱氧核糖核苷酸不含有如下序列或其反向互补序列5' -CGTCTC-3'；
c)其核苷酸序列为序列表中序列4 ；
所述DNA片段的另一条链为如下d)_f)中的任一种
d)其核苷酸序列为序列表中序列3 ；
e)其核苷酸序列为在序列表中序列3的第11位和第12位核苷酸之间再插入1_50 个脱氧核糖核苷酸后所组成的序列；所述1-50个脱氧核糖核苷酸不含有如下序列或其反向互补序列5' -CGTCTC-3'；
f)其核苷酸序列为序列表中序列5 ；
所述双链DNA片段的两条链除两端的粘性末端外，其余的核苷酸序列均反向互补。
在本发明的实施例中，所述双链DNA片段的一条链的核苷酸序列为序列表中序列 6 ；所述双链DNA片段的另一条链的核苷酸序列为序列表中序列7 ；且所述序列6中的第一个脱氧核糖核苷酸(N)(自5’端到3’端的方向)具体为G，第二个脱氧核糖核苷酸(N)(自 5’端到3’端的方向)具体为A ；所述序列7中的第一个脱氧核糖核苷酸(N)(自5’端到 3’端的方向)具体为T，第二个脱氧核糖核苷酸(N)(自5’端到3’端的方向)具体为C。 连接有上述DNA片段的表达载体的核苷酸序列具体为序列表中的序列1。该载体命名为 pcDNA6. 2-EmGFP-BsmB I。
制备本发明所提供的表达载体的方法也属于本发明的保护范围。
该方法包括将所述线性载体pcDNA6. 2-Gff/EmGFP-miR的两个末端和所述双链DNA 片段的两个粘性末端相连，并且使连接处形成限制性内切酶BsmB I的识别位点的步骤。
本发明所提供的表达载体在表达miRNA中的应用也属于本发明的保护范围。
利用本发明所提供的表达载体表达miRNA的方法也属于本发明的保护范围。
该方法具体包括如下步骤
1)将所述表达载体用限制性内切酶BsmB I进行单酶切，回收大片段，获得用于表达miRNA的线性骨架载体；
2)将编码目的miRNA的双链DNA与步骤1)获得的所述线性骨架载体相连，获得用于表达所述目的miRNA的重组载体；
所述编码目的miRNA的双链DNA满足如下A) -C)的条件
A)所述编码目的miRNA的双链DNA中的正义链的序列组成为如下al)或a2)
al)自5’端到3’端的方向依次为寡核苷酸序列I、所述目的miRNA的反向靶序列、 所述目的miRNA的环序列、所述目的miRNA的正向靶序列；
a2)自5’端到3’端的方向依次为寡核苷酸序列I、所述目的miRNA的反向靶序列、 所述目的miRNA的环序列、所述目的miRNA的正向靶序列、脱氧核糖核苷酸C ；
所述寡核苷酸序列I的序列为从序列1的第1519位开始、按照序列1的核苷酸序列向序列1的5'端延长，得到长度为4至6个核苷酸的任一个序列，即为如下Al)-A3)中的任一种Al) 5' -GCTC-3 ‘ ；A2)5' -TGCTC-3 ‘ ；A3) 5' -ATGCTC-3 ‘；
B)所述编码目的miRNA的双链DNA中的反义链的序列组成为如下bl)或b2)
bl)自5’端到3’端的方向依次为寡核苷酸序列II、所述目的miRNA的正向靶序列的反向互补序列缺失第9位和第10位核苷酸后所形成的序列、所述目的miRNA的环序列的反向互补序列、所述目的miRNA的反向靶序列的反向互补序列；
b2)自5’端到3’端的方向依次为寡核苷酸序列II、所述目的miRNA的正向靶序列的反向互补序列缺失第9位和第10位核苷酸后所形成的序列、所述目的miRNA的环序列的反向互补序列、所述目的miRNA的反向靶序列的反向互补序列、寡核苷酸序列III ；
所述寡核苷酸序列II的序列为从5' -TCCTG-3'的自5'端第5位开始，向5' 端延长，得到长度为4至5个核苷酸的任一序列，即为如下Bi)或B2) :B1)5' -CCTG-3'； B2)5' -TCCTG-3'；所述寡核苷酸序列III的序列为从5‘ -CA-3'自5'端第1位开始，向 3'端延长，得到长度为1或2个核苷酸的任一序列，即为如下Cl)或C2) :C1)5' -CA-3'； C2) 5 ‘ -C-3‘
C)所述编码目的miRNA的双链DNA中的正义链与所述编码目的miRNA的双链DNA 中的反义链反向互补后形成与所述线性骨架载体相匹配的粘性末端。
所述编码目的miRNA的双链DNA中的正义链的序列组成自5’端到3’端的方向依次为5 ‘ -TGCTG-3 ‘、所述目的miRNA的反向靶序列、所述目的miRNA的环序列、所述目的miRNA的正向靶序列；所述编码目的miRNA的双链DNA中的反义链的序列组成自5’端到 3’端的方向依次为5' -CCTG-3'、所述目的miRNA的正向靶序列的反向互补序列缺失第9 位和第10位核苷酸后所形成的序列、所述目的miRNA的环序列的反向互补序列、所述目的 miRNA的反向靶序列的反向互补序列、脱氧核糖核苷酸C。
在本发明的实施例中，所述目的miRNA具体为Hsa-miR-130b。用于表达所述Hsa-miR-130b的双链DNA的中的正义链的序列为序列表中序列8 ；用于表达所述 Hsa-miR-130b的双链DNA的中的反义链的序列为序列表中序列9。
本发明所提供的表达载体在表达蛋白中的应用也属于本发明的保护范围。
在上述应用中，利用本发明所提供的表达载体表达蛋白的方法包括如下1)和2) 的步骤
1)将所述表达载体用限制性内切酶Dra I进行单酶切(去除线性载体 pcDNA6. 2-Gff/EmGFP-miR自身位于cmv启动子下游的EmGFP表达框)，回收大片段，获得用于表达蛋白的线性骨架载体；
2)将含有目的蛋白编码基因的双链DNA与步骤1)获得的所述线性骨架载体相连， 获得用于表达所述目的蛋白的重组载体。
在本发明的一个实施例中，与线性载体pcDNA6. 2-Gff/EmGFP-miR相连的所述双链 DNA片段内部含有限制性内切酶Dra I的识别位点；所述目的蛋白编码基因为编码红色荧光蛋白(dsRed)的基因deRed，所述deRed来源于pDsRed-Monomer-Hyg-m载体。
本发明通过在miRNA 表达载体 pcDNA6. 2-Gff/EmGFP-miR 的 5，-flanking region 和3’ -flanking region克隆位点处连接了两段具有特殊限制性内切酶BsmB I识别位点的多克隆位点序列，利用该内切酶的特殊切法可轻松的切出原来的5’ -flanking region 和3’-flanking region(不破坏载体本身的核酸序列)，用于表达miRNA。同时利用 pcDNA6. 2-GW/EmGFP-miR载体自身的限制性内切酶Dra I识别位点(或和设计优化的多克隆位点序列中的Dra I)可以切除位于pcDNA6. 2-Gff/EmGFP-miR载体cmv启动子下游的 EmGFP开放阅读框，进而可以连接所需要表达的蛋白序列，表达目的蛋白。实验证明，在表达 miRNA方面，本发明所提供的表达载体为环形载体，可在大肠杆菌中大量扩增，克服了原始线性载体pcDNA6. 2-Gff/EmGFP-miR 一次性使用的缺陷，大大节约了实验成本；同时，本发明所提供的表达载体还可用于表达蛋白，克服了普通载体只能单一表达蛋白或表达miRNA的不足。
图1为线性载体pcDNA6. 2-Gff/EmGFP-miR的粘性末端。
图2为2. 5%琼脂糖胶电泳检测双链多克隆位点序列(PolyLinker)的结果。其中，泳道M为DL1000 DNA Marker (TakaRa)；泳道1为双链多克隆位点序列(PolyLinker)。
图3为BsmB I单酶切pcDNA6. 2-EmGFP_BsmB I质粒的1 %琼脂糖胶电泳图。其中， 泳道 M 为 DL15000 DNA Marker (TakaRa)；泳道 1 为 pcDNA6. 2-EmGFP-BsmB I 质粒经 BsmB I单酶切后酶切产物的电泳结果。
图 4 为 pcDNA6. 2-EmGFP-BsmB I 的质粒图谱。
图5为Msc I单酶切pcDNA6. 2-EmGFP-mir_130b质粒的1 %琼脂糖胶电泳图。其中，泳道 M 为 Wide Range DNA Marker(100-6000) (TakaRa)；泳道 1 为 pcDNA6. 2-EmGFP-mir-130b质粒经Msc I单酶切后酶切产物的电泳结果。
图6为RT-PCR检测Hsa-mir-130b在HeLa细胞内的表达情况。其中，C为转染 pcDNA6. 2-EmGFP-mir-130b 质粒的 HeLa 细胞(实验组)；B 为转染 pcDNA6. 2-EmGFP-BsmB I 质粒的HeLa细胞(阴性对照组)；A为未转染的HeLa细胞(空白对照组)。每组纵坐标的倍数是以空白对照组中Hsa-mir-130b表达量为1计算所得。
图7为琼脂糖凝胶电泳检测dsRed基因的PCR产物。其中，泳道M为Wide Range DNA Marker (100-6000)；泳道1为dsRed基因PCR产物的电泳结果。
图8为Dra I单酶切pcDNA6. 2-DsRed质粒的琼脂糖胶电泳图。其中，泳道M 为 DL15000 DNA Marker (TakaRa)；泳道 1 为 pcDNA6. 2-DsRed 质粒经 Dra I 单酶切后酶切产物的电泳结果。
图9为转染pcDNA6. 2-DsRed质粒的HeLa细胞中红色荧光蛋白的表达情况。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步阐明本发明，应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所涉及的分子生物学相关技术如核酸分子克隆技术等在科学文献中都已有充分描述(如参见J ·萨姆布鲁克E · F ·弗里奇T ·曼尼要蒂斯，分子克隆实验指南(第三版))。涉及到各种试剂(或试剂盒)的具体操作，按照各试剂(或试剂盒)的使用说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。 pcDNA6. 2-Gff/EmGFP-miR 载体购自美国 hvitrogen 公司；pDsRed-Monomer-Hyg-Nl 载体购自Clontech Laboratories ；HeLa细胞购自ATCC ；质粒中量提取试剂盒为QIAGEN Plasmid Midi kit购于德国QIAGEN公司；琼脂糖凝胶回收试剂盒购于北京TIANGEN公司；所用的 BsmB I和Dra I及其他常用的DNA内切酶和！"4 DNA Ligase均购于英国NEB公司。细胞培养试剂DMEM，无血清培养基Opti-MEM，胎牛血清，脂质体转染试剂Lipofectamine及miRNA 反转录和miRNA定量检测试剂盒均购于美国hvitrogen公司。Realtime PCR反应仪为美 H stratagene Mx3000Po
实施例1、表达载体pcDNA6. 2-EmGFP-BsmB I的构建
一、插入片段(双链多克隆位点序列)的获得
根据线性载体pcDNA6. 2-Gff/EmGFP-miR(Invitrogen)(序列 11)的粘性末端(图 1)，设计两条单链DNA序列，使所述两条单链DNA序列经退火形成双链DNA片段(内部具有限制性内切酶Dra I识别位点)后，再与所述线性载体pcDNA6. 2-Gff/EmGFP-miR相连，能够形成两个连接处各带有一个限制性内切酶BsmB I识别位点的环状表达载体。其中一条链的核苷酸序列为序列表中序列6 (自5’端到3’端的方向，第一个脱氧核糖核苷酸(N)为G， 第二个脱氧核糖核苷酸(N)为A)所示，反义链的核苷酸序列为序列表中序列7 (自5’端到 3’端的方向，第一个脱氧核糖核苷酸(N)为T，第二个脱氧核糖核苷酸(N)为C)所示。
人工合成上述两条单链DNA后，退火使所述两条单链DNA形成双链。退火反应体系为正义链和反义链(溶于TE缓冲液，浓度均为200 μ M)各5μ 1，IOx退火反应液(配方 终浓度为IOOmM的iTris-HCl,终浓度为IOmM的EDTA，终浓度为IM的NaCl，ρΗ 8. 0) 2 μ 1， 用无核酸酶的水补充至20 μ 1。退火反应条件为将反应体系加入到95°C的水浴锅中缓慢降温至室温。
用2. 5%琼脂糖胶电泳对结果进行检测，结果如图2所示，扩增出大小约为40bp的目的条带。。将得到的作为插入片段的双链DNA命名为双链多克隆位点序列(PolyLinker)， 将其置于_20°C备用。
二、表达载体 pcDNA6. 2-EmGFP-BsmB I 的获得
将步骤一获得的双链多克隆位点序列(插入片段)与线性载体pcDNA6.2-GW/ EmGFP-miR(Invitrogen)相连，具体的连接体系为双链多克隆位点序列(溶于无核酸酶的水，浓度为 IOnM) 4 μ 1，线性载体 pcDNA6. 2-Gff/EmGFP-miR(浓度为 IOng/ μ 1) 2 μ 1，IOx Τ4 连接酶缓冲液2 μ 1，Τ4连接酶1 μ 1，用无核酸酶的水补充至20 μ 1。连接条件为16°C过夜连接。
取10 μ 1上述连接产物加入到100 μ 1的Τ0Ρ10感受态细菌中，将反应体系冰上孵育30min后，迅速放入42°C水浴中孵育90s热激活，热激活后再次冰浴3min。冰浴结束后向反应体系加入500 μ 1新鲜LB培养基，370C，150rpm,复苏培养45min。取200 μ 1复苏好的菌液均勻涂到LB壮观霉素选择性固体培养基上，37°C过夜培养。第二天，挑取单菌落接种到:3ml LB培养基中，370C，200rpm过夜摇菌(12_16h)，次日取2ml菌液碱裂解法小提质粒。 所提质粒用限制性内切酶BsmB I进行单酶切，酶切产物进行琼脂糖电泳，结果如图3所示，在约5700bp的位置出现载体骨架片段，由于插入片段(多克隆位点序列)只有42bp所以琼脂糖电泳结果没有显示出来。酶切初步鉴定正确的质粒，送公司测序，进一步鉴定正确(成功插入步骤一所得的双链多克隆位点序列)后，命名为pcDNA6. 2-EmGFP-BsmB I， 该载体的核苷酸序列为序列表中序列1，该载体的质粒图谱如图4所示。利用德国QIAGEN 公司的质粒中量提取试剂盒QIAGEN Plasmid Midi kit制备中量pcDNA6. 2-EmGFP-BsmB I， 置于-20°C备用。
其中，T0P10感受态细胞的制备方法如下从37°C培养16_20h的新鲜LB平板上挑取T0P10单菌落，接种于3ml不含抗生素的LB培养基中，37°C中速摇床培养过夜O50rpm， 12-16h)。取Iml上述培养物接种到IOOml的液体LB培养基中继续培养，待菌液的0D600值达到0. 3-0. 6时，将菌液移植到两支预冷的无菌的50ml离心管中，冰浴30min。4°C，3000g 离心IOmins弃上清，加入IOml冰冷的CaCl2重悬，冰上放置30min，4°C，3000g离心5min， 再次加入含10% DMSO的2ml冰冷的CaCl2重悬细菌，按每管100 μ 1的量分装到预冷无菌的EP管中，置于-80°C备用。
实施例2、miRNA表达载体的构建及其在细胞中的表达
本实施例所要表达的miRNA为Hsa-miR_130b，用于表达Hsa-miR_130b的宿主细胞为 HeLa0
一、设计合成表达Hsa-miR-130b的双链DNA
根据Hsa-miR_130b 序列(MI0000748-----http //www. mirbase. org)，以及实施例1所制备的pcDNA6. 2-EmGFP-BsmB I载体的序列(序列1)，设计表达Hsa-miR-130b前体的双链DNA，其中，所述双链DNA中的正义链的序列为序列表中序列8 ；所述双链DNA中的反义链的序列为序列表中序列9。
人工合成上述双链DNA的正义链和反义链后，退火使正义链和反义链互补形成双链DNA。退火反应体系为正义链和反义链(溶于TE缓冲液，浓度均为200 μ M)各5μ1， IOx退火反应液(配方终浓度为IOOmM的Tris-HCl，终浓度为IOmM的EDTA，终浓度为IM 的NaCl，pH 8. 0)2 μ 1，用无核酸酶的水补充至20 μ 1。退火反应条件为将反应体系加入到 95 0C的水浴锅中缓慢降温至室温。
用2. 5%琼脂糖胶电泳对结果进行检测，得到大小约为65bp的目的条带。将得到的作为插入片段的双链DNA置于_20°C备用。
二、pcDNA6. 2-EmGFP-mir_130b 重组表达载体的获得
用限制性内切酶BsmB I单酶切实施例1制备的pcDNA6. 2-EmGFP-BsmB I质粒，琼脂糖凝胶回收试剂盒(北京TIANGEN公司)回收大片段。按照实施例1步骤二所述方法连接上述步骤一制备的双链DNA (表达Hsa-miR-130b前体的双链DNA)和上述回收的大片段 (BsmB I单酶切pcDNA6. 2-EmGFP-BsmB I质粒后的大片段)。
参照实施例1步骤二的方法，用连接产物转化T0P10感受态细菌，挑取单菌落，碱裂解法小提质粒。将所提质粒用限制性内切酶Msc I进行单酶切(37°C，8h)，之后用琼脂糖电泳胶鉴定(图5)，结果显示所提质粒经Msc I单酶切后获得大小为 1430bp和4307bp的两条带，与预期结果相一致。经测序后证实所提质粒已成功插入了上述步骤一制备的双链DNA (表达Hsa-miR-130b前体的双链DNA)，将该重组质粒命名为 pcDNA6. 2-EmGFP-mir-130bo利用德国QIAGEN公司的质粒中量提取试剂盒QIAGEN Plasmid Midi kit 制备中量 pcDNA6. 2-EmGFP-mir_130b，置于 _20°C备用。
三、pcDNA6. 2-EmGFP-mir_130b质粒在HeLa细胞的表达及鉴定
1、转染
用pcDNA6. 2-EmGFP-mir_130b 质粒(实验组)和 pcDNA6. 2-EmGFP-BsmBI 质粒(阴性对照组)分别转染HeLa细胞。具体操作如下
(1)细胞的准备HeLa细胞(ATCC)按3xl05个/孔的量铺六孔板，用含有10 % (体积百分含量)胎牛血清的无抗生素DMEM培养基(美国^witrogen公司，产品目录号 11965)过夜培养，待细胞达到90%-95%汇合度的时候进行脂质体转染。转染前Ih去掉六孔板中细胞培养基，加入Iml无血清无抗生素的Opti-MEM培养基(Invitrogen，产品目录号 31985)。
(2)转染复合物的制备将 4μ g 质粒(pcDNA6. 2-EmGFP-mir_130b 或 pcDNA6. 2-EmGFP-BsmB I)溶解在250 μ 1无血清无抗生素Opti-MEM培养基中，得到溶液A ； 将10 μ 1脂质体(Iipofectamine)(美国hvitrogen公司)溶解在2δ0 μ 1无血清无抗生素OPti-MEM培养基中，室温孵育5min，得到溶液B ；将溶液A加入溶液B中，混勻，室温孵育 30min，即得到转染复合物。
(3)转染将上述含有脂质体和质粒(pcDNA6. 2-EmGFP-mir-130b或 pcDNA6. 2-EmGFP-BsmB I)的转染复合物均勻的滴加到上述步骤(1)准备好的HeLa细胞中， 37°C，5% CO2培养箱中过夜孵育后，去掉旧培养基换上含有10% (体积百分含量)胎牛血清的DMEM培养基。
2、Hsa-miR_130b在细胞中的表达及鉴定
将经上述步骤1转染后的细胞(同时设置空白对照组，即未转染的HeLa细胞)继续培养18-36小时，收集细胞，Trizol法提取总RNA，经DNase I消化后，利用Promega公司的 ImProm-II Reverse Transcription System(A3800)试剂盒进行反转录。具体操作按照说明书进行，得到cDNA。
接着，用RealtimePCR仪检测Hsa-mir-130b的表达情况。以所得到的cDNA为模板，以自行设计的如下一条引物5’-AGTGCAATGATGAAAGGGCAT-3’以及上述试剂盒自身带有的通用引物作为PCR引物，反应的条件是:50°C 2mins，95°C，2mins ；95°C, 15s,60°C, lmin, (共 40 个循环)；95°C，lmin，55°C，30s，95°C，30s。
结果显示，与阴性对照组(转染pcDNA6. 2-EmGFP-BsmB I质粒的HeLa细胞)和空白对照组(未转染的HeLa细胞)相比，实验组(转染pcDNA6. 2-EmGFP-mir-130b质粒的 HeLa细胞)中Hsa-mir-130b的表达量是空白对照组的5. 44倍(如图6所示)。这一结果表明pcDNA6. 2-EmGFP-BsmBI载体可以用于表达miRNA.
实施例3、蛋白表达载体的构建及其在细胞中的表达
本实施例所要表达的蛋白为红色荧光蛋白(dsRed)，用于表达dsRed的宿主细胞为 HeLa0
一、dsRed蛋白DNA序列的克隆
红色荧光蛋白dsRed(编码基因的核苷酸序列为序列表中序列10)在波长为557nm的激发光照射下可以显示红色荧光。该蛋白是通过PCR的方式从质粒 pDsRed-Monomer-Hyg-Nl (Clontech Laboratories, Inc.)中克隆得到。克隆 deRed 的上下游引物分别为
上游引物5，-AGCTTTGTTTAAAATGGACAAGACCGAGGACGTC-3，(下划线部分为Dra I 酶切位点)；
下游引物5，-AGCTTTGTTTAAACTACTGGGAGCCGGAGTGGCG-3，(下划线部分为Dra I 酶切位点)。
PCR反应体系为Taq DNA聚合酶(2. 5M) 1 μ 1、IOx反应缓冲液5 μ 1、dNTP G种 dNTP的浓度均为10mM)l μ 1、上游引物和下游引物(浓度均为10 μ Μ)各2μ1，模板质粒 (pDsRed-Monomer-Hyg-Nl, 0. 1 μ g/μ 1) 1 μ 1，ddH20 38 μ L· PCR 反应程序为95 °C 预变性 5min ；95°C变性 30s，58°C退火 30s，72°C延伸 Imin(共 30 个循环)；72°C延伸 5min ；4°C保温终止反应。
将上述PCR反应的产物用1 %琼脂糖凝胶电泳检测(图7)，结果显示PCR扩增得到大小为700bp左右的目的条带。
二、pcDNA6. 2-DsRed重组表达载体的获得
用限制性内切酶Dra I单酶切实施例1制备的pcDNA6. 2-EmGFP-BsmB I质粒，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳检测后，用琼脂糖凝胶回收试剂盒(北京TIANGEN公司)回收酶切后的大片段(PCDNA6. 2-EmGFP-BsmB I质粒经限制性内切酶Dra I单酶切后，位于cmv 启动子下游的EmGFP开放阅读框被切除)。同样，用限制性内切酶Dra I单酶切上述步骤一获得的大小为700bp左右的目的条带，并胶回收。然后，按照实施例1步骤二所述方法连接上述回收所得的pcDNA6. 2-EmGFP-BsmB I质粒大片段和700bp左右的目的条带。
参照实施例1步骤二的方法，用连接产物转化T0P10感受态细菌，挑取单菌落，碱裂解法小提质粒。将所提质粒用限制性内切酶Dra I进行单酶切，之后用琼脂糖电泳胶鉴定，结果显示所提质粒经Dra I单酶切后获得大小为4996bp和684bp的两条带(图8)， 与预期结果相一致。经测序后证实所提质粒已成功插入了上述步骤一所得700bp左右的目的条带(dsRed)，将该重组质粒命名为pcDNA6. 2-DsRed。利用德国QIAGEN公司的质粒中量提取试剂盒 QIAGEN Plasmid Midi kit 制备中量 pcDNA6. 2-DsRed，置于 _20°C备用。
三、pcDNA6. 2-DsRed质粒在HeLa细胞的表达及鉴定
1、转染
用pcDNA6. 2-DsRed 质粒(实验组)和 pcDNA6. 2-EmGFP-BsmB I 质粒(阴性对照组)分别转染HeLa细胞。具体操作如下
(1)准备细胞HeLa细胞(ATCC)按3xl05个/孔的量铺六孔板，用含有10% (体积百分含量)胎牛血清(Gibco，16000-044)的无抗生素DMEM培养基(美国^witrogen 公司，产品目录号1196 过夜培养，待细胞达到90% -95%汇合度的时候进行脂质体转染。转染前Ih去掉六孔板中细胞培养基，加入Iml无血清无抗生素的Opti-MEM培养基 (Invitrogen，产品目录号 31985)。
(2)制备转染复合物将 4 μ g 质粒(pcDNA6. 2-DsRed 或 pcDNA6. 2-EmGFP-BsmB I)溶解在250μ 1无血清无抗生素Opti-MEM培养基中，得到溶液A ；将10 μ 1脂质体 (Iipofectamine)(美国hvitrogen公司)溶解在250 μ 1无血清无抗生素OPti-MEM培养基中，室温孵育5min，得到溶液B ；将溶液A加入溶液B中，混勻，室温孵育30min，即得到转染复合物。
(3)转染将上述步骤⑵制备的含有脂质体和质粒(pcDNA6. 2-DsRed或pcDNA6. 2-EmGFP-BsmB I)的转染复合物均勻的滴加到上述步骤(1)准备好的HeLa细胞中， 37°C，5% CO2培养箱中过夜孵育后，去掉旧培养基换上含有10% (体积百分含量)胎牛血清的DMEM培养基。
2、dsRed在细胞中的表达及鉴定
将经上述步骤1转染后的细胞继续培养18-36小时以后，用荧光显微镜在557nm 波长激发光条件下观察红色荧光(同时设置未转染的HeLa细胞作为空白对照组)，从而确定dsRed蛋白在HeLa细胞中的表达情况。
结果显示，实验组(转染pcDNA6.2-DSRed质粒的HeLa细胞)的细胞出现明显的红色荧光的表达(图9)；而阴性对照组(转染pcDNA6. 2-EmGFP-BsmB I质粒的 HeLa细胞)和空白对照组(未转染的HeLa细胞)均无红色荧光的表达。这一结果表明 pcDNA6. 2-EmGFP-BsmB I质粒可以作为一种表达蛋白的载体使用。
权利要求
1.一种表达载体，是由线性载体pcDNA6. 2-GW/EmGFP-miR和两端各有一个粘性末端的双链DNA片段连接而成的环状表达载体；所述线性载体pcDNA6. 2-Gff/EmGFP-miR的两个末端和所述双链DNA片段的两个粘性末端相连，并且两个连接处均形成限制性内切酶BsmB I 的识别位点。
2.根据权利要求1所述表达载体，其特征在于所述双链DNA片段的内部具有限制性内切酶Dra I的识别位点。
3.根据权利要求1或2所述表达载体，其特征在于所述DNA片段的一条链为如下a)-c)中a)其核苷酸序列为序列表中序列2；b)其核苷酸序列为在序列表中序列2的第11位和第12位核苷酸之间再插入1-50个脱氧核糖核苷酸后所组成的序列；所述1-50个脱氧核糖核苷酸不含有如下序列或其反向互补序列5' -CGTCTC-3‘；c)其核苷酸序列为序列表中序列4；所述DNA片段的另一条链为如下d)-f)中的任一种d)其核苷酸序列为序列表中序列3；e)其核苷酸序列为在序列表中序列3的第11位和第12位核苷酸之间再插入1-50个脱氧核糖核苷酸后所组成的序列；所述1-50个脱氧核糖核苷酸不含有如下序列或其反向互补序列5' -CGTCTC-3 ‘；f)其核苷酸序列为序列表中序列5；所述双链DNA片段的两条链除两端的粘性末端外，其余的核苷酸序列均反向互补。
4.根据权利要求1-3中任一所述的表达载体，其特征在于所述双链DNA片段的一条链的核苷酸序列为序列表中序列6 ；所述双链DNA片段的另一条链的核苷酸序列为序列表中序列7。
5.根据权利要求1-4中任一所述表达载体，其特征在于所述表达载体的核苷酸序列为序列表中的序列1。
6.制备权利要求1-5中任一所述表达载体的方法，包括将所述线性载体pcDNA6.2-GW/ EmGFP-miR的两个末端和所述双链DNA片段的两个粘性末端相连，并且使连接处形成限制性内切酶BsmB I的识别位点的步骤。
7.权利要求1-5中任一所述的表达载体在表达miRNA中的应用。
8.利用权利要求1-5中任一所述的表达载体表达miRNA的方法，包括如下步骤1)将所述表达载体用限制性内切酶BsmBI进行单酶切，回收大片段，获得用于表达 miRNA的线性骨架载体；2)将编码目的miRNA的双链DNA与步骤1)获得的所述线性骨架载体相连，获得用于表达所述目的miRNA的重组载体；所述编码目的miRNA的双链DNA满足如下A) -C)的条件A)所述编码目的miRNA的双链DNA中的正义链的序列组成为如下al)或a2)al)自5’端到3’端的方向依次为寡核苷酸序列I、所述目的miRNA的反向靶序列、所述目的miRNA的环序列、所述目的miRNA的正向靶序列；a2)自5’端到3’端的方向依次为寡核苷酸序列I、所述目的miRNA的反向靶序列、所述目的miRNA的环序列、所述目的miRNA的正向靶序列、脱氧核糖核苷酸C ；所述寡核苷酸序列I的序列为如下Al)-A3)中的任一种Al)5 ‘ -GCTC-3 ‘； A2)5' -TGCTC-3‘ ；A3)5' -ATGCTC-3‘；B)所述编码目的miRNA的双链DNA中的反义链的序列组成为如下bl)或1^2)bl)自5’端到3’端的方向依次为寡核苷酸序列II、所述目的miRNA的正向靶序列的反向互补序列缺失第9位和第10位核苷酸后所形成的序列、所述目的miRNA的环序列的反向互补序列、所述目的miRNA的反向靶序列的反向互补序列；b2)自5’端到3’端的方向依次为寡核苷酸序列II、所述目的miRNA的正向靶序列的反向互补序列缺失第9位和第10位核苷酸后所形成的序列、所述目的miRNA的环序列的反向互补序列、所述目的miRNA的反向靶序列的反向互补序列、寡核苷酸序列III ；所述寡核苷酸序列II的序列为如下Bi)或B2) :B1)5' -CCTG-3' ；B2)5' -TCCTG-3'； 所述寡核苷酸序列III的序列为如下Cl)或C2) :C1)5' -CA-3' ；C2)5' _C_3'；C)所述编码目的miRNA的双链DNA中的正义链与所述编码目的miRNA的双链DNA中的反义链反向互补后形成与所述线性骨架载体相匹配的粘性末端。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于所述编码目的miRNA的双链DNA中的正义链的序列组成自5’端到3’端的方向依次为5' -TGCTG-3'、所述目的miRNA的反向靶序列、所述目的miRNA的环序列、所述目的miRNA的正向靶序列；所述编码目的miRNA的双链 DNA中的反义链的序列组成自5’端到3’端的方向依次为5' -CCTG-3'、所述目的miRNA的正向靶序列的反向互补序列缺失第9位和第10位核苷酸后所形成的序列、所述目的miRNA 的环序列的反向互补序列、所述目的miRNA的反向靶序列的反向互补序列、脱氧核糖核苷酸C。
10.权利要求1-5中任一所述的表达载体在表达蛋白中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种用于表达miRNA和/或蛋白的表达载体及其应用。本发明所提供的表达载体是由线性载体pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR和两端各有一个粘性末端的双链DNA片段连接而成的环状表达载体；所述线性载体pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR的两个末端和所述双链DNA片段的两个粘性末端相连，并且两个连接处均形成限制性内切酶BsmB I的识别位点；所述DNA片段的内部还包括限制性内切酶Dra I的识别位点。实验证明，在表达miRNA方面，本发明所提供的表达载体为环形载体，可在大肠杆菌中大量扩增，克服了原始线性载体pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR一次性使用的缺陷，大大节约了实验成本；同时，本发明所提供的表达载体还可用于表达蛋白，克服了普通载体只能单一表达蛋白或表达miRNA的不足。
文档编号C12N15/63GK102517313SQ20111041664
公开日2012年6月27日 申请日期2011年12月14日 优先权日2011年12月14日
发明者曾毅, 李泽琳, 杨志平, 盛望, 陈学斌 申请人:北京工业大学