专利名称：一种培育转基因小麦的方法
技术领域：
本发明涉及植物基因工程领域中一种培育转基因植物的方法及其应用，特别涉及一种培育转基因小麦的方法及其应用。直量拉水小麦是最重要的粮食作物之一，是人类食物和营养的基本来源。
背景技术：
目前全世界小麦播种面积约2 .沈亿公顷，总产量约5 . 5亿吨。
发明内容
本发明的目的是提供一种简单、快速、实用的培育转基因小麦的方法，利用该方法培育转基因小麦不需经过组织培养和植株再生的过程。本发明所提供的培育转基因小麦的方法，是通过农杆菌的介导将外源基因导入小麦生长点，通过非组培遗传转化方法得到转基因小麦。生长点可为根尖生长点、茎尖生长点，优选为茎尖生长点。所述遗传转化的外植体为小麦种子23 — 27 “ C萌发48 — 72小时得到的茎尖生长点。携带有外源基因的农杆菌需先在80 — 120卿乙酞丁香酮中培养1 一 3小时，再在0 . 03 — 0 . 05 MPa真空度下，感染外植体8 一 12分钟。然后将被感染的外植体转入合适培养基中，如 MS培养基，在22 — 250C、14 一 16 / 10 — 8小时光周期下共培养2 — 4天得到转基因小麦幼苗。本发明的方法与其它培育转基因小麦方法的显著区别在于采用小麦生长点作为农杆菌介导的遗传转化的外植体，而不是未成熟胚或胚性愈伤组织或悬浮细胞，不需经过组织培养和植株再生的过程，从根本上克服了由于小麦基因型对转化后形成可育再生植株的限制。本发明通过对局部人工损伤的小麦生长点采用真空渗入技术进行农杆菌介导的遗传转化，获得了表达报告基因的转基因小麦，生长点转化率达到60 — 70 %，成苗率平均90 %，T。代种子卡那霉素抗性阳性率为16 — 21 %，T，代幼苗报告基因表达阳性率占所测植株的81 %。尤为重要的是克服了小麦遗传转化的瓶颈问题一基因型的限制。本发明所试材料的品种包括小麦金花、小麦京411、小麦4071，均获得上述效果。 本发明的方法转化效率高、操作简便、重复性好、不依赖于受体的基因型。本发明的方法可以培育出各种高产、优质和/或抗逆性强的小麦新种质非组培遗传转化方法可应用到其它受基因型限制大难以获得转基因植株的单子叶农作物中，可以培育高产、抗逆、优质的新型农作物。
具体实施例方式实施例1、转基因小麦的培育 1、小麦外植体的处理
(1 )将金花、京411和京4071三种小麦品种的小麦种子用10 %的次氯酸消毒 5分钟，再用70 %的乙醇处理10分钟，然后用无菌水冲洗3次。在一无菌大平皿中垫三层以无菌水浸湿的纱布，将经消毒处理的小麦种子置于平皿中25 〃 C黑暗中萌发48小时，得到待转化的小麦萌发种子。( 2 )在无菌条件下用解剖针将待转化的小麦萌发种子胚芽鞘划开，尽量暴露其生长点，以便于外源基因的导入。2、转化用农杆菌的培养
(1 )将过夜培养的农杆菌菌株LBA4404 / 3301，其中含CaMV 355启动子驱动的 ⑶S基因，Iml接种于IOOml含链霉素100 mg / L，卡那霉素50 mg / L和利福平50 mg / L的YEB培养基中，^OC，300 rpm振荡培养至菌液浓度为0D6。。。. =0.7
ο
(2 )在转化前向菌液中加入乙酞丁香酮至100卿，继续在^oc，300 rPm振荡培养2小时。将上述菌液分装于50ml的无菌三角瓶中，每瓶20ml。3、转化(1 )将步骤1的(2 )中的小麦生长点浸入步骤2的(2 )中的菌液中，侵染20分钟后，置于负压条件下，真空度0 . 04 Mpa，渗透10分钟。(2 )真空渗透处理后，倒除菌液，用无菌吸水纸将小麦外植体表面的菌液吸净，转入含梭节基青霉素的MS培养基中，22 — 250C ,16/8小时光周期下共培养3天。4、生长点转化后3天报告基因的瞬时表达及转化率检测
(1 )⑶S基因表达的组织化学检测将转化3天的小麦幼苗置于含1 %甲醛、 50mM pH 7 . 0的磷酸钠缓冲液和0 . 05 % TritonX 一 100的固定液中，室温下温和摇动30分钟；倒掉固定液，再以50mM磷酸钠缓冲液(pH 7 . 0 )洗3次；将幼苗转入含 2 InMX 一 Glue，50InM 磷酸钠缓冲液(pH 7 . 0 )和 0 . 05 % TritonX 一 100 的染色液中，37oC保温8小时；之后转移至75 %乙醇中脱色4小时，然后在解剖镜下观察。( 2 )报告基因表达结果小麦金花、小麦京411、小麦4071三种小麦品种转化后均有⑶S基因表达的蓝色显色反应。如表1所示，小麦金花、小麦京411和小麦4071 的表达率分别为61 . 3 %、64 . 3 %和65 . 8 %。5、生长点转化后的培育和成苗将共培养3天后的小麦幼苗移入以锉石为基质的花盆中，在25 〃 C、60 %相对湿度、16 / 8小时光周期的培养室中培养3 — 4周后成苗，然后转入自然光温室中栽种，约90 %的苗正常结实。5、代种子的筛选以50 mg / L卡那霉素对T。代种子进行筛选，经4小时浸泡后置于平皿中25 〃 C黑暗中萌发48小时，结果如表2所示，小麦金花、小麦京411和小麦4071的表达率分别为61 . 3 64 . 3 %和65 . 8 %。7、T，代报告基因表达的检测经卡那霉素筛选后萌发的种子转移到以侄石位为基质的花盆中，在25 “ C、60 %相对湿度、16 / 8小时光周期的培养室中培养。待长出第三片叶时，取第一片叶按照步骤4的(1 )中的方法检测报告基因的表达，报告基因表达阳性率占所测植株的81 % ( 22 / 27 λ
权利要求
1.一种培育转基因小麦的方法，其特征在于所述生长点为根尖生长点或茎尖生长点ο
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述遗传转化的外植体为小麦种子23 一 27 〃 C萌发48 — 72小时得到的茎尖生长点。
全文摘要
一种培育转基因小麦的方法,重点在生长点为根尖生长点或茎尖生长点。所述遗传转化的外植体为小麦种子23一27"C萌发48一72小时得到的茎尖生长点。
文档编号C12N15/82GK102517323SQ201110426780
公开日2012年6月27日 申请日期2011年12月19日 优先权日2011年12月19日
发明者弓贵明 申请人:弓贵明