专利名称：一种膳食锌生物有效性的评价模型及其建立方法
技术领域：
本发明提供的一种适应于谷物籽粒、锌强化剂和动物性食物中锌生物有效性的评价模型，同时还涉及一种该模型的建立方法。
背景技术：
膳食多样性、食品锌强化、补充锌强化剂是解决人体锌缺乏的重要途径。但近些年的调查发现，世界范围内仍有较大比例，尤其是儿童缺锌更为严重。我国2008年的调查表明，儿童头发锌低于正常者下限者仍高达60%，这一结果提醒我们应更多的关注膳食中锌对人体的实际生物有效性。由于涉及伦理道德和人体生命安全， 采用人体实验评价膳食中锌生物有效性受到了限制。近年来，细胞培养技术和相关生物技术的发展，使得用细胞模型评价锌对人体的生物有效性提供了保障。目前，锌生物有效性有的采用细胞内锌含量作为评价指标。由于这种模型缺乏锌向体内器官的转运和蓄积过程评价，从而与锌在人体内的吸收过程存在差异，并导致试验结果与锌实际生物有效性间存在差异。
发明内容
本发明的目的在于提供的一种膳食锌生物有效性的评价模型。本发明的目的还在于提供一种该膳食锌生物有效性的评价模型的建立方法。为了实现上述目的，本发明的技术方案采用了一种膳食锌生物有效性的评价模型，包括模型结构、细胞种类和评价指标，其中，评价指标为Caco-2细胞内锌含量，细胞转运锌量和内脏上皮细胞内锌含量。所述的模型结构为在培养板底部设置有插入槽，Caco-2细胞培养位置为插入槽底膜上，模型结构具备顶侧室(肠腔侧)和基底侧室(血浆侧)。所述的细胞种类包括Caco-2细胞，内脏上皮细胞。所述的内脏上皮细胞培养于培养板的基底侧。所述的内脏上皮细胞为原代培养的或继代培养的肝脏、肾脏上皮样生长的细胞。进一步地，本发明的技术方案还采用了一种膳食锌生物有效性的评价模型的建立方法，包括以下步骤(I) Caco-2 细胞培养；(2)内脏上皮细胞培养；(3)模型建立当步骤(I)和步骤(2)的细胞均达到试验要求的极性状态和结构形态后，将培养有Caco-2细胞的插入槽移入培养有内脏上皮细胞的六孔板中，联合培养24h ；(4)锌生物有效性试验将被评价食物样品采用传统的消化系统进行模拟消化，离心，获取上清液，将上清液与MEM液混合制成锌吸收试验液。同时做不含锌的对照组试验液。吸取I. 5mL锌吸收试验液滴入联合培养模型的Caco-2细胞层上，同时在内脏上皮细胞层加入等渗的MEM孵育液，于37°C,55转/min培养器中孵育2h ；
(5)指标测定分别收取Caco-2细胞、内脏上皮细胞、基底侧孵育液，用ICP-MS技术检测Caco_2细胞内锌含量、内脏上皮细胞内锌含量和基底侧孵育液中锌含量。用内脏上皮细胞内锌含量评价锌在内脏器官中的利用；用内脏上皮细胞内锌含量与基底侧孵育液中锌含量之和评价锌在体内的转运量；用Caco-2细胞内锌含量、内脏上皮细胞内锌含量、基底侧孵育液中锌含量之和评价膳食锌对人体的总吸收效率。步骤(I)所述的Caco-2细胞培养为将插入槽放入六孔培养板中。将细胞密度为3 X IO5的Caco-2细胞混合液I. 5mL滴入插入槽的底 膜上，同时，在基底侧加入2mL含胎牛血清10%的DMEM培养液。步骤(2)所述的内脏上皮细胞培养为将内脏上皮细胞培养于另一块六孔板的基底侧，并根据细胞生长特性，考虑与Caco-2细胞在培养时间进行调整(可适当提前、延后或同时培养)；若选用原代细胞培养，应以原代细胞培养为主，当原代细胞培养稳定后，再结合Caco-2细胞培养。本发明的模型能够准确、高效和全面的模拟锌在人体的吸收利用过程，为膳食中锌生物有效性的评价提供更合理和正确的方法；模型结构上与人体肠道吸收结构相似；本发明提供的模型即可评价膳食锌在肠道的吸收效率，又可评价锌在体内的利用效率；评价结果与锌实际生物有效性更接近。
具体实施例方式实施例I水稻籽粒锌对人体的生物有效性评价方法(I) Caco-2 细胞培养将插入槽放入六孔培养板中。将细胞密度为3 X IO5的Caco-2细胞混合液I. 5mL滴入插入槽的底膜上，同时，在基底侧加入2mL含胎牛血清10%的DMEM培养液；(2) 293T 细胞培养将人肾胚T (293T)细胞培养于另一块六孔板的基底侧，培养液与Caco-2细胞所用培养液相同；(3)模型建立将培养有Caco-2细胞的插入槽移入培养有293T细胞的六孔板中，联合培养24h ；(4)锌生物有效性试验将水稻籽粒蒸熟，磨碎，采用传统的消化系统进行模拟消化，离心，获取上清液，将上清液与MEM液混合制成锌吸收试验液；同时用等渗的MEM液作对照组。吸取I. 5mL锌吸收试验液和对照组溶液分别滴入联合培养模型的Caco-2细胞层上，同时在293T细胞层加入等渗的MEM孵育液，于37°C，55转/min培养器中孵育2h ；(5)指标测定分别收取Caco-2细胞、293T细胞、基底侧孵育液，用ICP-MS技术检测Caco-2细胞内锌含量、293T细胞内锌含量和基底侧孵育液中锌含量。用293T细胞内锌含量评价稻米籽粒锌在肾脏器官中的利用；用293T细胞内锌含量与基底侧孵育液中锌含量之和评价锌在体内的转运量；用Caco-2细胞内锌含量、293T细胞内锌含量、基底侧孵育液中锌含量之和评价稻米籽粒锌对人体的总生物有效性。
实施例2硫酸锌和甘氨酸锌中锌生物有效性评价方法(I) Caco-2 细胞培养将插入槽放入六孔培养板中。将细胞密度为3 X IO5的Caco-2细胞混合液I. 5mL滴入插入槽的底膜上，同时，在基底侧加入2mL含胎牛血清10%的DMEM培养液；⑵293T细胞培养将人肾胚T (293T)细胞培养于另一块六孔板的基底侧，培养液与Caco-2细胞所用培养液相同； (3)模型建立将培养有Caco-2细胞的插入槽移入培养有293T细胞的六孔板中，联合培养24h ；(4)锌生物有效性试验将硫酸锌和甘氨酸锌分别溶解于去离子水中，采用传统的消化系统进行模拟消化，离心，获取上清液，将上清液与MEM液混合制成锌吸收试验液。吸取I. 5mL锌吸收试验液滴入联合培养模型的Caco-2细胞层上，同时在293T细胞层加入等渗的MEM孵育液，于37°C, 55转/min培养器中孵育2h。同时做空白试验组；(5)指标测定分别收取Caco-2细胞、293T细胞、基底侧孵育液，用ICP-MS技术检测Caco-2细胞内锌含量、293T细胞内锌含量和基底侧孵育液中锌含量。比较硫酸锌组和甘氨酸锌组293T细胞锌含量，以评价不同锌化合物在人肾脏的利用；比较硫酸锌组和甘氨酸锌组293T细胞内锌含量和基底侧孵育液中锌含量，评价锌化合物向体内的总转运量；比较硫酸锌组和甘氨酸锌组Caco-2细胞内锌含量、293T细胞内锌含量、基底侧孵育液中锌含量总的差异。评价不同锌化合物在肠道的总吸收效率。
权利要求
1.一种膳食锌生物有效性的评价模型，其特征在于包括模型结构、细胞种类和评价指标，其中，评价指标为Caco-2细胞内锌含量,细胞转运锌量和内脏上皮细胞内锌含量。
2.根据权利要求I所述的膳食锌生物有效性的评价模型，其特征在于所述的模型结构为在培养板底部设置有插入槽，Caco-2细胞培养位置为插入槽底膜上，模型结构具备顶侧室(肠腔侧)和基底侧室(血浆侧)。
3.根据权利要求I所述的膳食锌生物有效性的评价模型，其特征在于所述的细胞种类包括Caco-2细胞，内脏上皮细胞。
4.根据权利要求3所述的膳食锌生物有效性的评价模型，其特征在于所述的内脏上皮细胞培养于培养板的基底侧。
5.根据权利要求3或4所述的膳食锌生物有效性的评价模型，其特征在于所述的内脏上皮细胞为原代培养的或继代培养的肝脏、肾脏上皮样生长的细胞。
6.一种膳食锌生物有效性的评价模型的建立方法，其特征在于包括以下步骤 (1)Caco-2细胞培养； (2)内脏上皮细胞培养； (3)模型建立将培养有Caco-2细胞的插入槽移入培养有内脏上皮细胞的六孔板中，联合培养24h ； (4)锌生物有效性试验 将被评价食物样品采用传统的消化系统进行模拟消化，离心，获取上清液，将上清液与MEM液混合制成锌吸收试验液。同时做不含锌的对照组试验液。吸取1.5mL锌吸收试验液滴入联合培养模型的Caco-2细胞层上，同时在内脏上皮细胞层加入等渗的MEM孵育液，于37 0C，55转/min培养器中孵育2h ； (5)指标测定 分别收取Caco-2细胞、内脏上皮细胞、基底侧孵育液，用ICP-MS技术检测Caco-2细胞内锌含量、内脏上皮细胞内锌含量和基底侧孵育液中锌含量。
7.根据权利要求6所述膳食锌生物有效性的评价模型的建立方法，其特征在于步骤(1)所述的Caco-2细胞培养为将插入槽放入六孔培养板中。将细胞密度为3X IO5的Caco_2细胞混合液I. 5mL滴入插入槽的底膜上，同时，在基底侧加入2mL含胎牛血清10%的DMEM培养液。
8.根据权利要求6所述膳食锌生物有效性的评价模型的建立方法，其特征在于步骤(2)所述的内脏上皮细胞培养为将内脏上皮细胞培养于另一块六孔板的基底侧，并根据细胞生长特性，考虑与Caco-2细胞在培养时间进行调整，可适当提前、延后或同时培养。
9.根据权利要求8所述膳食锌生物有效性的评价模型的建立方法，其特征在于若内脏上皮细胞为原代细胞时，应以原代细胞培养为主，当原代细胞培养稳定后，再结合Caco-2细胞培养。
全文摘要
本发明涉及一种膳食锌生物有效性的评价模型及其建立方法，该模型包括模型结构、细胞种类和评价指标，其中，评价指标为Caco-2细胞内锌含量，细胞转运锌量和内脏上皮细胞内锌含量。本发明的模型能够准确、高效和全面的模拟锌在人体的吸收利用过程，为膳食中锌生物有效性的评价提供更合理和正确的方法；模型结构上与人体肠道吸收结构相似；本发明提供的模型即可评价膳食锌在肠道的吸收效率，又可评价锌在体内的利用效率；评价结果与锌实际生物有效性更接近。
文档编号C12M1/00GK102676369SQ20111042714
公开日2012年9月19日 申请日期2011年12月19日 优先权日2011年12月19日
发明者何万领, 曹平华, 李元晓, 李旺, 李晓丽, 邓凯伟 申请人:河南科技大学