专利名称：马动脉炎病毒的液相芯片检测引物及检测方法
技术领域：
本发明属于动物病毒检测技术领域，具体涉及一种马动脉炎病毒的液相芯片检测引物及检测方法。
背景技术：
马病毒性动脉炎(Equine Viral Ateritis，EVA)是一种由马病动脉炎病毒 (Equine Ateritis Virus，EAV)引起，在马属动物之间通过呼吸道或生殖器官传播的传染病。马匹感染EAV后大部分呈亚临床感染，一部分成年马的流感样症状、怀孕母马发生流产，新生马驹发生间质性肺炎。约有30% -60%种公马感染EAV后持续带毒，精液中的病毒可传播给雌马，引起EAV的传播。该病在临疹上表现为发热、白细胞减少，常伴有眼睑水肿和四肢浮肿，其特征性病理变化为小动脉内膜变性和坏死。本病主要以美洲和欧洲为中心呈世界性分布，以小规模或中等规模的流行形式反复发生。澳大利亚虽然没有临床症状发生，但是通过对保存血清的检查表明，1975年澳大利亚就有EAV抗体阳性马。对1989-1992年收集的马血清检查结果表明，南非也有抗体阳性马。1996年日本发现EAV抗体阳性的赛马。1996年我国出口韩国的马匹中也发现了 EAV 抗体阳性马，但至今没有从马匹中分离到EAV。近年来，由于赛马业的发展和国外对食用马的需求，进出口马病的检测量不断增加。国内外研究者开发了多项马病快速检测诊断方法，如山东检验检疫局马病实验室研究的ELISA、PCR检测马鼻肺炎和马动脉炎，固相基因芯片技术检测五种马病等这些方法基本上实现了快速检测的需要。但是有些病还没有成熟的检测技术及试剂，如锥虫病、焦虫病等还需要用进口检测试剂。进口试剂和试剂盒特别昂贵，且使用时必须提前2个月左右定货， 会严重影响检测进程。此外，现有的快速检测方法中，ELISA、PCR等技术通量小，费时费力； 固相芯片技术可以实现高通量检测，但成本特别昂贵，无法在马病检测中应用。迫切需要一种高通量、低成本、快速特异、灵敏可靠检测方法。
发明内容
本发明的目的是提供马动脉炎病毒的液相芯片检测引物及检测方法，即一种操作简单、结果准确的马动脉炎病毒液相芯片检测方法，及其所用到的引物，从而弥补现有技术的不足。本发明为实现上述目的，采用液相芯片技术。该技术是在核酸水平上的一种检测技术，具有准确性好、灵敏度高的特点。其原理是将编码微球单个逐一通过检测通道时受到双色激光(如红色和绿色)同时照射，第一束激光激发微球的分类荧光，根据荧光编码确定微球的类别，即微球内部的两种荧光物质受激发后可发射两种不同波长的荧光，不同类别微球内这两种荧光物质比例不同，则荧光强度比例也不同，从而将不同的特异性反应区分开来；第二束激光激发报告分子上的荧光素，根据荧光强度确定微球上结合的报告分子的数量从而确定目标分子的数量(定量)。系统只记录与红色荧光同时出现的绿色荧光信号，
3不记录未结合的报告分子荧光信号，因此检测前无需洗脱未结合的报告分子。此外，利用流式细胞术中90°C角散射光可有效地消除微球聚集对结果造成的影响。各种荧光信号经分析软件进行数字化处理，可获得检测物的种类和数量。本发明中所涉及到的引物和探针序列如下正向引物dirct primer :5-CAACGGGTACACCGCAGTTGGT-3~ SEQ ID NO :1反向引物reverse pr imer :5-CGGACCCGCATCTGACCAAACA_3~ SEQ ID NO :2探针Probe :5~-CGGCGGCGACAGCCTACA-3~ SEQ ID NO :3。正向引物和反向引物5’端进行生物素标记；探针的5’端进行氨基化修饰。本发明的引物和探针用于检测马动脉炎病毒，其检测方法包括有1)检测样品 RNA的提取、2) RT-PCR扩增目的片段、3)寡核苷酸探针与微球共价偶联、4)探针与RT-PCR 扩增片段杂交和幻液相芯片仪分析步骤。其中步骤^RT-PCR反应的循环条件为第一阶段，反转录50°C :30min ；第二阶段，预变性94°C :3min ；第三阶段，扩增94°C :30s, 59°C :30s, 72°C :30s，30 个循环；第四阶段，延伸72°C :5min。本发明的检测方法能够对样品进行快速检测，从样品处理到出结果仅需4小时左右；由于采用了接近生物反应体系的液相芯片系统和特异性的探针，使该方法可与荧光定量PCR相媲美。本发明设计的引物与常见马属动物其他病毒不发生交叉反应，由于采用了液相反应体系，使该方法的特异性高于传统检测方法，大大杜绝了非特异性扩增造成的假阴性结果。本发明的方法提供了优化的操作程序，操作简单，具有良好重复性。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明的方法进行详细描述。本发明所用到的仪器耗材信息如下表面羧基化的荧光编码微球、鞘液购置于BD 公司，TMAC temtrameihyl-ammdnium chloride、Tris、SD S(10% sol μ tion)购置于美国 Sigma 公司，SPAE Str印tavidin-R-phycoerythrin 购于美国 Prozyme 公司，RNA 提取试剂盒、RT-PCR试剂盒购于大连宝生物公司。主要设备包括BD FACSArray液相芯片仪、梯度 PCR扩增仪、凝胶成像系统、Sigma高速冷冻离心机等。通过hternet登陆美国国立生物信息技术中心(NCBI)，查询检索已公布的马动脉炎病毒基因序列。利用I^rimer Premierf.O软件设计引物和探针，并最终筛选出一对具有高特异性的引物和探针，参见表1。表1设计的引物和预期目的片段大小
引物和探针序列ι增片段大小Primerl5’-biotm-CAACGGGTACACCGCAGTTGGT-3、145bpPrimer25’-biotin-CGGACCCGCATCTGACCAAACA-3’ProbeNH2-CGGCGGCGAC AGCCT AC A-3、
注5’ -Biotin表示5’端进行生物素标记；5、-NH2表示5’端进行氨基化修饰。本发明的检测方法如下1、检测样品RNA的提取采用大连宝生物公司的RNA提取试剂盒提取样品RNA，按照说明书的步骤进行操作，提取的样品电泳检测提取质量。2、RT-PCR扩增目的片段采用RNA提取试剂盒(大连宝生物公司)进行EAV RNA的提取。在0. 2mLPCR反应管中，依次加入 10 X RT-PCR by ffer，2. 5μ L、、dNTP (各 2. 5mmol/L)，2· 0 μ L、IOpmol/μ L 引物对，各 1 μ L、Inhibiter 0· 5 μ L、AMV XL 0· 5 μ L、AMV Taq (5M/μ L)，0· 25μ L、25mmol/ L MgCl2, 5. 0 μ L、RNA模板5. 0 μ L，加入双蒸水7. 25 μ L使反应体积达到25 μ L。在PCR仪 (Eppendorf Mastercycler Gradient)上进行 RT-PCR 扩增。优化并确定 RT-PCR 工作程序 500C 30min ；94°C 2min ；然后 94°C 30sec、59°C 30sec、72°C 30sec,30 个循环；最后 72°C延伸5min，4°C保温。扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳，在紫外凝胶图像分析系统(Alphamager 2200) 上观察、分析扩增产物。3、寡核苷酸探针与微球共价偶联1)将微球漩涡混合20s充分分散；取3 X IO6个微球(75 μ 1)，于1. 5ml离心管中 IOOOOg离心lmin，去上清；2)加入50 μ 1 0. lmol/L甲基咪唑溶液(ph4. 5)，漩涡混合，超声波处理 (30s_imin)；3)加入氨基化探针1. Onmol,漩涡混合；4)加入2. 5 μ L碳二亚胺溶液(IOmg的碳二亚胺粉末加入1. OmL的灭菌纯水，现用现配)充分混勻，室温避光孵育30min。5)重复 4) 一次。6)加入 1. Oml 0. 02% Tween-20，混勻，IOOOOg 离心 lmin，弃上清；7)加入 1. Oml 0. 1% SDS，混勻，IOOOOg 离心 lmin，弃上清；8) 0. lmol/L甲基咪唑溶液(ph4. 5) 100 μ L重悬微球，2_8°C避光保存待用。4、探针与RT-PCR扩增片段杂交杂交体系包换1.5yL探针偶联微球，33yL 1. 5 X TMAC杂交液，14. 5 μ LTE， 2. 5yL RT-PCR产物。混合均勻后于98°C变性lOmin，在选定温度下孵育15min，18000g离心aiiin去上清；加入50μ L用IXTMAC杂交液稀释的PE标记的链亲合素(1 500)，选定温度下孵育lOmin，18000g离心^iin去上清；加入50 μ L IX TMAC杂交液，漩涡混合使微球重悬，上BD FACSArray液相芯片仪对杂交后的微球进行分析。杂交温度的优化，杂交反应时间在15min条件下，根据探针的Tm值，选48°C、50°C、 52°C、54°C、56°C等5个温度梯度为研究对象，考察不同杂交温度下液相芯片的检测效果。5、液相芯片仪分析步骤利用BD FACSArray液相芯片仪对杂交微球进行分析，参与计数的荧光编码微球均 ^ 100个，表明用于计数的荧光编码微球数量有效，所产生的MFI值可信，各个荧光编码微球的空白对照MFI均< 500，表明结果有效，试验可以进行结果判定。
液相芯片定性比值结果(LQRR)等于样品校正后的MFI值(MFIS)与空白对照 MFI平均值(MFIB)的比值，即LQRR = MFIS/MFIB。如果LQRR彡3，判定为阳性样本；如果 2彡LQRR < 3，则判定为可疑；如果LQRR < 2，则判定为阴性。实施例1本发明的马动脉炎病毒液相芯片引物探针和检测方法的特异性分析1、材料为马动脉炎病毒(EAV)、马鼻肺炎病毒(EHV)、马流感病毒H3N8亚型、马流感病毒H7N7亚型和马焦虫；其中马动脉炎病毒作为阳性检测样品。2、马动脉炎病毒液相芯片检测方法的特异性试验利用本研究建立的液相芯片检测马动脉炎病毒的方法，提取马动脉炎病毒、马鼻肺炎病毒、马流感病毒H3N8亚型、马流感病毒H7N7亚型和马焦虫等的RNA或DNA，并进行扩增。将RT-PCR产物或PCR产物，用液相芯片检测体系进行检测。判断整个液相芯片检测体系对非目标物有无检测信号。3、结果分别以马动脉炎病毒(EAV)、马鼻肺炎病毒(EHV)、马流感病毒H3N8亚型(H3N8)、 马流感病毒H7N7亚型(H7N7)和马焦虫等的RT-PCR产物或PCR产物模板，进行液相芯片检测。结果(见表2)表明，对阳性样品马动脉炎病毒EAV的检测结果为阳性，而对非目标物扩增产物的检测值均为阴性，表明本发明的引物和探针在检测的时候不会产生假阳性或假阴性。表2液相芯片检测体系特异性验证
权利要求
1.一种马动脉炎病毒的液相芯片检测的引物和探针，其特征在于，引物和探针的核酸序列如下正向引物=SEQ ID NO 1 反向引物Γ SEQ ID NO 2 探针 Γ SEQ ID NO :3ο
2.如权利要求1所述的引物和探针，其特征在于所述的正向引物和反向引物5’端进行生物素标记；探针的5’端进行氨基化修饰。
3.一种液相芯片检测马动脉炎病毒的方法，其特征在于，是用权利要求2所述的引物和探针进行检测。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于包括有1)检测样品RNA的提取、2)RT-PCR扩增目的片段、幻寡核苷酸探针与微球共价偶联、4)探针与RT-PCR扩增片段杂交和幻液相芯片仪分析步骤。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于所述的步骤2)RT-PCR反应的循环条件为 第一阶段，反转录50°C :30min ；第二阶段，预变性94°C :3min ；第三阶段，扩增 94°C :30s, 59°C :30s，72°C :30s，30 个循环； 第四阶段，延伸720C :5min0
全文摘要
本发明涉及一种马动脉炎病毒的液相芯片检测引物及检测方法，本发明的检测方法能够对样品进行快速检测，从样品处理到出结果仅需4小时左右；由于采用了接近生物反应体系的液相芯片系统和特异性的探针，使该方法可与荧光定量PCR相媲美。本发明设计的引物与常见马属动物其他病毒不发生交叉反应，由于采用了液相反应体系，使该方法的特异性高于传统检测方法，大大杜绝了非特异性扩增造成的假阴性结果。本发明的方法提供了优化的操作程序，操作简单，具有良好重复性。
文档编号C12N15/11GK102424865SQ20111042698
公开日2012年4月25日 申请日期2011年12月19日 优先权日2011年12月19日
发明者岳志芹, 徐彪, 朱来华, 梁成珠, 王群, 肖西志, 赵玉然, 邓明俊, 郑小龙 申请人:山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心