专利名称：一种筛查牛退化性轴突病携带者的方法及其试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及畜牧业技术领域，具体地说是一种筛查牛退化性轴突病携带者的方法及其试剂盒。
背景技术：
退化性轴突病(Degenerative axonopathy)是牛的一种常染色体单基因控制的隐性遗传病。通过全基因组关联分析和单倍体型图最终确定是由位于牛16号染色体上的线粒体融合素2(MFN2)基因的一个点突变引起的(DrdgemUller C，Reichart U, Seuberlich T, et al. An unusual splice defect in the mitofusin 2 gene(MFN2)is associated with degenerative axonopathy in Tyrolean Grey cattle. PLoS One,2011,6 (4) el8931)。Dr0gemiiller等对44头患有退化性轴突病牛的DNA测序分析，结果都发现有一个共同的同义突变位点，SNP c. 2229C>T，它位于MFN2基因第18个外显子内。c. 2229C > T突变影响了一个CpG 二核苷酸，在哺乳动物中此位点有相当高的突变频率。c. 2229C > T 突变位点位于一个潜在的外显子剪接增强子(ESE)基序内。T的突变消除了剪接因子ASF/ SF-2 一个潜在的结合位点，同时，增强了与辅助因子剪接蛋白SC35结合的能力。c. 2229C > T突变影响MFN2基因转录的剪接，除了产生野生型转录本外，又产生了一个保留第18个内含子的新转录本。新转录本的第18个内含子前端提前引入了终止密码子，导致新转录本相对于野生型转录本缺少最后22个密码子的开放阅读框，表达的MFN2蛋白相对于野生型转录本缺少一个C末端。患有退化性轴突病的牛在1 1. 5月龄时，四肢开始显示出不断加重的运动失调， 而且后肢行动不稳键比前肢表现得更为突出。随着这些症状的加重，最终导致牛呈躺或斜靠体态。神经病理学发现受影响牛明显表现出两侧对称的轴突退化，使得背侧脊髓小脑束和薄束的轴突密度降低(Syring C，Drogemiiller C. Oevermann A, Pfister P, Henke D, et al.Degenerative axonopathy in a Tyrolean Grey calf. J Vet Intern Med,2010,24: 1519-1523)。许多患病的牛在8 10月龄被淘汰，给养牛业生产带来了巨大的经济损失。经系谱记录分析发现，这个突变位点最终可以追溯到1972年以前。DrSgemuller 等经研究发现，该病是由MFN2基因第20个外显子的一个碱基突变引起的(DriigemUller C, Reichart U, Seuberlich T, et al. An unusual splice defect in the mitofusin 2 gene(MFN2)is associated with degenerative axonopathy in Tyrolean Grey cattle. PLoS One, 2011,6 (4) :el8931)。MFN2基因编码线粒体融合素2蛋白，属于一种线粒体膜蛋白。野生型的MFN2编码757个氨基酸，它是锚定横跨在线粒体膜外的一种蛋白，蛋白的绝大部分位于细胞质内，包括N末端和C末端。该蛋白可以形成同源和异源二聚体。线粒体是一个非常有活力的细胞器，能够持续的融合和裂变。而MFN2介导的二聚化是线粒体的圈合和融合过程中一个必不可少的步骤。此外，MFN2也存在于内质网，并且在线粒体和内质网膜圈合过程中也是必需的。有报道认为，人的轴突神经病进行性神经性腓骨肌萎缩2A2 [Charcot-Marie-Tooth disease_2A2 (CMT2A2)是由于 MFN2 基因突变引起的(Verhoeven
3K, Claeys KG, Ziichner S,et al. MFN2 mutation distribution and genotype/phenotype correlation in Charcot-Marie-Tooth type 2. Brain,2006,129 :2093-2102 ；Calvo J, Funalot B,Ouvrier RA,Lazaro L,Toutain A,et al. Genotype-phenotype correlations in Charcot-Marie-Tooth disease type 2 caused by mitofusin 2 mutations. Arch Neurol, 2009,66 :1511-1516)。在具有轴突神经病进行性神经性腓骨肌萎缩2A2的病人中， 已报道大约有60种由于MFN2突变可引起蛋白质改变，病人表现轴突退化的特征，进而影响到了具有长轴突的外周神经元。在小鼠模型中，MFN2突变引起运动神经严重的轴突退化和损害线粒体的融合，进而导致神经元突起中线粒体分布不均勻。然而，线粒体的融合怎样影响神经元融合和轴突生存的机理仍然是不清楚的。一种假说是线粒体融合缺陷导致了线粒体DNA在细胞器间分布不规律进而导致了线粒体DNA损失和氧化磷酸化的破坏。损伤的线粒体变得形状不规则并且出现运动失调，从而导致了轴突内线粒体积聚。牛退化性轴突病是常染色体单基因突变控制的隐性遗传病，所以仅仅通过系谱分析来判定是否为退化性轴突病携带者是不准确的，而且只是群体上的推断，对单头牛而言， 其可靠性不强。因此，通过分子手段并且结合系谱分析开发一个简单、快速、可靠性强的检测携带者试剂盒，对于牛分子育种来说具有重要的实践意义，可以大大减少养牛业的经济损失。限制性片段长度多态性聚合酶链反应(PCR-RFLP)技术，是利用特异设计的PCR引物扩增目的模板，对PCR扩增片段进行酶切处理，以检测特定位点碱基突变、插入或缺失等多态性。其基本原理是用PCR扩增目的DNA，扩增产物再用特异性内切酶酶切成不同大小片段的DNA，然后进行凝胶电泳检测。由于不同等位基因的限制性酶切位点分布不同，产生不同长度的DNA片段条带，直接可以从凝胶图上分辨出来。方法简便，分型时间短。
发明内容
本发明的技术任务是解决现有技术的不足，提供一种筛查牛退化性轴突病携带者的方法及其试剂盒。本发明的技术方案是按以下方式实现的，该一种筛查牛退化性轴突病携带者的方法及其试剂盒本发明目的一是利用PCR-RFLP技术，解决现有技术的不足，设计一对筛查牛退化性轴突病携带者的专用引物。筛查退化性轴突病携带者的专用引物对命名为MFN2F和 MF職。本发明目的二是提供一种筛查退化性轴突病携带者的方法。其方法是利用待测牛的DNA为模板，用发明的专用引物对MFN2F和MFN2R进行PCR扩增，然后对PCR产物进行回收，用特异性限制性内切酶TspRI进行酶切，对酶切后的产物进行凝胶检测，根据凝胶结果进行判定。如果酶切后凝胶DNA样品片段大小为307bp的为正常牛；DNA片段为307bp、 225bp和82bp的检测牛为退化性轴突病携带者；DNA片段为225bp和82bp的检测牛为患有退化性轴突病牛。待测牛DNA样品来源丰富且操作简单，可以从牛新鲜或冷冻的血液、精液、组织样品中提取。一种筛查牛退化性轴突病携带者的方法，以待测牛的基因组DNA为模板，设计上游引物和下游引物对其进行PCR扩增反应，然后回收PCR扩增片段，用!^stDigest限制酶 TspRI进行酶切，在酶切反应体系酶切后进行凝胶检测，酶切后凝胶检测酶切DNA片段为 307bp的待测牛为正常牛；酶切后DNA片段为307bp、225bp和82bp的检测测牛为退化性轴突病携带者；酶切后DNA片段为225bp和82bp的检测牛为患退化性轴突病牛。一种筛查牛退化性轴突病携带者所设计的PCR扩增引物，根据NCBI中MFN2基因序列设计上游引物MFN2F序列为=SEQ ID NO. 1，下游引物MFN2R序列为=SEQ ID NO. 2。PCR扩增反应采用25 μ 1 PCR扩增反应体系为模板DNA(100ng/μ 1) 1 μ 1，上游引物 MFN2F、下游引物 MFN2R 各(10 μ mol/L) 0. 5 μ 1，2 X Taq PCRMasterMix 12. 5μ1，用双蒸水(ddH20)补至 25 μ 1。PCR扩增反应条件为94°C变性^iin ；然后94°C变性30s，60°C退火30s，72°C延伸 30s，这一步共35个循环；72°C保持IOmin ；4°C保存。酶切反应体系采用15 μ 1 TspRI酶切反应体系为PCR扩增产物5 μ 1 ； IOXFastDigest 缓冲液 1 μ 1 ；FastDigest 限制酶 iTspRI 0. 5 μ 1 ；ddH20 8. 5 μ 1，酶切反应条件为65°C消化30min。酶切片段用质量浓度为3. 0 4. 0%琼脂糖凝胶电泳。一种筛查牛退化性轴突病携带者的试剂盒，该试剂盒是上、下游引物(ΙΟμπιοΙ/ L) ；2XTaq PCR MasterMix ；IOXFastDigest 缓冲液；FastDigest 限制酶 TspRI ；双蒸水 (ddH20) ；50bp DNA Ladder Marker中的一种以上数量的试剂。25 μ 1 PCR 反应体系包括DNA(100ng/y 1)1μ 1，上，下游引物(10ymol/L)各 0. 5 μ 1，2 X Taq PCR MasterMix 12. 5 μ 1，双蒸水(ddH20)补至 25 μ 1。25 μ 1反应体系的PCR程序94°C变性^iin ；然后94°C变性30s，60°C退火30s， 72°C延伸30s，这一步共35个循环；72°C保持IOmin ；4°C保存。15 μ 1酶切反应体系PCR扩增产物5 μ 1 ； 10 X FastDigest缓冲液1 μ 1 ； FastDigest 限制酶 TspRI 0. 5 μ 1 ；ddH20 8. 5 μ 1，酶切反应条件为65°C消化 30min。本发明目的三是提供一种筛查牛退化性轴突病携带者的试剂盒。试剂盒包括以下试剂其中ZXiTaq PCR MasterMix (含染料)是由 Taq DNA Polymerase (0. 05units/ μ 1)、MgCl2 (4mM)、dNTPs (0. 4mM)构成。(1) 一对筛查牛退化性轴突病携带者的专用引物上下游引物MFN2F和下游引物 MFN2R(10ymol/L)；(2)2XTaq PCR MasterMix ；(3)IU/μ L FastDigest TspRI ；(4) IOXFastDigest 缓冲液；(5) ddH20 ；(6) 10 % SDS (十二烷基磺酸钠)；(6)50bp DNA Ladder Marker。本发明与现有技术相比所产生的有益效果是本发明提供了筛查牛退化性轴突病携带者所用的一对专用弓丨物及方法。本发明是根据退化性轴突病患病牛MFN2基因(NCBI参考序列NC_007314. 3) g. 24029C > T突变，产生了 TspRI限制性酶切位点的原理，从而建立起筛查牛退化性轴突病携带者的PCR-RFLP方法。通过分析后设计针对含有突变位点的引物，特异性扩增出307bp的牛MFN2基因含有上述位点的片段(扩增片段中只含有突变位点处的一个TspRI酶切位点)，再经限制性内切酶TspRI酶切后，凝胶电泳后产生307bp的DNA条带为正常牛；DNA片段为307bp、225bp和 82bp的检测牛为退化性轴突病携带者；DNA片段为225bp和82bp的检测牛为退化性轴突病牛。本发明筛查方法操作简单、快捷、费用低廉、可靠性高。同时根据筛查方法开发出相应地检测试剂盒，使操作更加简单化、快速、灵敏、可靠性强，一般生产中常规实验室都有条件完成，这一发明可以早期淘汰退化性轴突病携带牛，可以大大减少养牛业的损失，在牛的分子育种中应用前景广阔，能够产生可观的经济效益和良好的社会效益。
附图1是本发明的PCR产物扩增的1. 5 %琼脂糖凝胶电泳图；附图2是本发明的MFN2基因分型的3 %琼脂糖凝胶电泳图；图中Maker 1 空白对照；Maker 2 正常牛；Maker 3 携带牛；Maker 4 患病牛。附图3是本发明的实施例二的正常牛MFN2基因测序图；附图4是本发明的实施例二的携带牛MFN2基因测序图；附图5是本发明的实施例二的患病牛MFN2基因测序图。
具体实施例方式下面结合附图对本发明的一种筛查牛退化性轴突病携带者的方法及其试剂盒作以下详细说明。实施例11.采用酚-氯仿抽提法从牛血液中提取基因组DNA，包括荷斯坦奶牛DNA80头，鲁西黄牛63头，瑞士褐牛18头。设计特异性引物用于扩增牛MFN2基因片段，所用的引物序列为上游引物MFN2F 序列为=SEQ ID NO. 1 5 ‘ -AAGCCCGAGTTTATTTCC-3‘下游引物MFN2R 序列为=SEQ ID NO. 2 5 ‘ -GCACTGTCCTCCCCACA-3‘2.根据上述检测牛退化性轴突病携带者的试剂盒，利用以下步骤扩增牛MFN2基因片段，扩增的片段用质量浓度为1. 5%琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图1所示。(I)PCR 反应体系:DNA(100ng/y 1)1μ 1,上，下游引物(10ymol/L)各 0· 5μ 1， 2 X Taq PCR MasterMix 12. 5 μ 1，用双蒸水(ddH20)补至 25 μ 1。Q)PCR 反应条件94°C变性 ^iin ；94°C变性 30s，60°C退火 30s，72°C延伸 30s，这一步共35个循环；72°C保持IOmin ；4°C保存。(3)扩增产物的电泳检测5 μ IPCR扩增产物，加上上样缓冲液1 μ 1。电泳检测。 检测结果为，1个泳道为空白对照，无扩增产物；2-6个泳道为牛DNA样品检测结果，均扩增出单一的条带，大小为307bp，与预期的片段大小一致。
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3. PCR产物的酶切与产物检测(1) 15 μ 1酶切反应体系PCR扩增产物5 μ 1 ； 10 X FastDigest缓冲液1 μ 1 ； FastDigest 限制酶 iTspRI 0. 5 μ 1 ；ddH20 8. 5 μ L· 65°C，酶切 30min。(2)在酶切产物中加入SDS (十二烷基磺酸钠)，在反应体系中的终浓度为0. 1%， 65 °C，酶切 IOmin。(3)凝胶电泳检测用质量浓度为3%凝胶对酶切后DNA 15 μ 1进行电泳检测；电压 100V ；时间 50min。4.基因分型与结果分析正常个体和携带者个体的基因分型结果如下表所示。表1.牛MFN2基因分型结果
权利要求
1.一种筛查牛退化性轴突病携带者的方法，其特征在于以待测牛的基因组DNA为模板，设计上游引物和下游引物对其进行PCR扩增反应，然后回收PCR扩增片段，用 FastDigest限制酶TspRI进行酶切，在酶切反应体系酶切后进行凝胶检测，酶切后凝胶检测酶切DNA片段为307bp的待测牛为正常牛；酶切后DNA片段为307bp、225bp和82bp的检测测牛为退化性轴突病携带者；酶切后DNA片段为225bp和82bp的检测牛为患退化性轴突病牛。
2.—种筛查牛退化性轴突病携带者所设计的PCR扩增引物，其特征在于根据NCBI中 MFN2基因序列设计上游引物MFN2F序列为SEQ ID NO. 1，下游引物MFN2R序列为SEQ ID NO. 2。
3.根据权利要求1所述的一种筛查牛退化性轴突病携带者的方法，其特征在于PCR扩增反应采用25 μ 1 PCR扩增反应体系为模板DNAdOOng/ μ 1) 1 μ 1，上游引物MFN2F、下游引物 MFN2R 各(10ymol/L)0. 5μ 1，2 X Taq PCRMasterMix 12. 5 μ 1，用双蒸水(ddH20)补至 25 μ 1。
4.根据权利要求1所述的一种筛查牛退化性轴突病携带者的方法，其特征在于PCR扩增反应条件为94°C变性^iin ；然后94°C变性30s，60°C退火30s，72°C延伸30s，这一步共 35个循环；72°C保持IOmin ；4°C保存。
5.根据权利要求1所述的一种筛查牛退化性轴突病携带者的方法，其特征在于酶切反应体系采用15 μ 1 TspRI酶切反应体系为PCR扩增产物5μ 1 ；IOXFastDigest缓冲液 1 μ 1 ；FastDigest 限制酶 iTspRI 0. 5 μ 1 ；ddH20 8. 5 μ 1，酶切反应条件为:65°C消化 30min。
6.根据权利要求1所述的一种筛查牛退化性轴突病携带者的方法，其特征在于酶切片段用质量浓度为3. 0 4. 0%琼脂糖凝胶电泳。
7.—种筛查牛退化性轴突病携带者的试剂盒，其特征在于该试剂盒是上、下游引物 (10ymol/L) ；2XTaq PCR MasterMix ;10XFastDigest缓冲液；FastDigest 限制醇TspRI ； 双蒸水(ddH20) ；50bp DNA Ladder Marker中的一种以上数量的试剂。
全文摘要
本发明提供一种筛查牛退化性轴突病携带者的方法及其试剂盒，属于畜牧业技术领域，该方法以待测牛的基因组DNA为模板，设计上游引物和下游引物对其进行PCR扩增反应，然后回收PCR扩增片段，用FastDigest限制酶TspRI进行酶切，在酶切反应体系酶切后进行凝胶检测，酶切后凝胶检测酶切DNA片段为307bp的待测牛为正常牛；酶切后DNA片段为307bp、225bp和82bp的检测测牛为退化性轴突病携带者；酶切后DNA片段为225bp和82bp的检测牛为患退化性轴突病牛。该筛查方法操作简单、快捷、费用低廉、可靠性高，这一发明可以早期淘汰退化性轴突病携带牛，可以大大减少养牛业的损失。
文档编号C12N15/11GK102424847SQ201110440150
公开日2012年4月25日 申请日期2011年12月26日 优先权日2011年12月26日
发明者仲跻峰, 张燕, 李建斌, 李秋玲, 李荣岭, 杨宏军, 王玲玲, 王秀革, 王长法, 赵秀新, 鞠志花, 黄金明, 齐超 申请人:山东省农业科学院奶牛研究中心