专利名称：一种海南湍蛙抗微生物肽Hainanenin-1及其基因、分离纯化、化学合成和应用的制作方法
技术领域：
本发明提供一种来源于海南瑞娃(Amolops hainanensis)的广谱抗微生物肽Hainanenin-1及其基因、分离和化学合成方法和在生物制药领域的应用，属于生物医学技术领域。
背景技术：
随着抗生素的广泛、大量使用，病原微生物对抗生素所产生的耐药性亦逐渐提高，已成为感染性疾病治疗的难点，尤其近期出现“超级病菌”的威胁，均迫使人们去寻找新型的抗微生物制剂。近期的研究发现，多肽抗生素具有广谱的抗菌活性，同时具有“传统抗生素”无法比拟的优越性:如在最小作用浓度时，快速而广谱地杀灭微生物(包括目前临床抗药菌)；对真菌也有抑制作用；不会诱导抗药菌株的产生；对于局部感染和全身感染都有效，有希望成为新一代抗菌剂，其研制目前受到广泛重视。同时抗菌肽还具有分子量小，稳定性高、不易产生抗药性力等特点。抗菌肽是生物体内经诱导产生的一类具有生物活性的小分子多肽，抗菌肽广泛存在于细菌、植物和动物体中，是宿主免疫防御系统的一个重要组成部分。与传统的抗生素不同，两栖类皮肤抗菌肽是通过干扰原核细胞膜结构导致质膜通透性增大，从而引起抑菌或杀菌作用，病原体对其不易产生抗药性。两栖类抗菌肽除了具有高效、广谱且不易产生耐药性的抗菌活性外，还具有抗肿瘤，病毒，原虫等活性，且对人体正常细胞几乎无作用。因此，在耐抗生素病原菌株不断出现，病毒和肿瘤等疾病对类健康造成极具威胁的 今天，抗菌肽将有望成为新一代的抗病原微生物及肿瘤的药物。据国内外文献报道，已从各种生物来源分离得到不同的活性多肽，而且有些已进入临床治疗。如从爪蟾(Xenopus Iaevis)皮肤分泌液获得的活性多肽Magainin具广谱抗微生物作用，同时具有抗肿瘤活性，在美国已获准作为广谱抗菌药物，其基因工程产品已进入三期临床；Intrabiotics公司生产的活性多肽IB-367已获准用于治疗癌症病人因多种细菌感染而引起的口腔溃瘍一期临床试验；Applied Microbiology公司与Astra公司合作用活性多肽nisin治疗胃溃瘍的临床试验也取得良好的疗效。我国拥有丰富的两栖类动物资源，它是中国生物资源的重要组成部分，其中很多物种具有食用或药用等价值，具有很大的开发利用潜力。两栖动物由于长期生活在潮湿、阴暗、微生物大量滋生的环境下，在长期自然进化过程中形成了三套防御机制:(1)物理屏障，粘液腺分泌大量糖蛋白和蛋白聚糖，包裹在皮肤外表面，阻碍病原菌的侵入；(2)获得性免疫系统，两栖动物皮肤中含有抗体IgG ； (3)先天免疫系统，主要由大量的抗菌肽构成。目前，对两栖类中蛙类抗菌肽尤其是皮肤和肠道抗菌肽研究的最清楚。自Zasloff从水蛙皮肤中分离到Magainins后，相继从不同的蛙类中分离到许多具有广谱的抑菌活性的抗菌月太家方矣(如 Dermaseptins、Temporins、Ranatuerins、Brevinins、Tigerinins), 一些还具有独特的抗真菌活性。我国对两栖类药物的应用有悠久的历史，但对其活性成分和药理性质的研究主要集中于生物碱等有机小分子，对其皮肤活性肽类物质的研究还鲜有报道。海南瑞娃(Amolops hainanebsis)为娃科瑞娃属的两栖动物,是中国的特有物种,分布于海南等地。本发明的海南瑞娃(Amolops hainanensis)环状抗菌肽Hainanenin-l分子量小，结构简单，仅含一个二硫键，方便化学合成及基因工程制备。相比较两栖动物来源的已报道的其他家族抗菌肽，Hainanenin-1抗微生物活性更强，且具有广谱的抗微生物活性，对革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌和真菌均有活性，其中包括大量临床分离耐药菌株，此外还具有溶血性低有益特点，均使Hainanenin-1成为外用抗菌药物开发的优良模板。
发明内容
本发明提供一种具有很强的抗微生物活性的来源于海南湍蛙(Amolopshainanensis)的一种抗微生物肽Hainanenin-1及其基因、分离纯化、化学合成和应用。为了实现本发明的目的，本发明提供了如下技术方案:海南瑞娃抗微生物肽Hainanenin-1是从两栖类海南瑞娃皮肤分泌液中先经Sephadex G-50凝胶过滤，然后反相高压液相层析(RP-HPLC)分离得到的一种C端含有七元Rana Box的环状多肽，分子量为2278.90道尔顿，等电点为9.50。多肽全序列一级结构为:苯丙氨酸-丙氨酸-亮氨酸-甘氨酸-丙氨酸-缬氨酸-苏氨酸-赖氨酸-亮氨酸-亮氨酸-脯氨酸-丝氨酸-亮氨酸-亮氨酸-半胱氨酸-蛋氨酸-异亮氨酸-苏氨酸-精氨酸-赖氨酸-半胱氨酸。含有3个碱性氨基酸残基(I个精氨酸和2个赖氨酸)，无酸性氨基酸残基，静电荷为+3，说明它是 一种碱性多肽。第十五位和第二十一位的的半胱氨酸形成分子内二硫键。构建了海南瑞娃(Amolops hainanensis)皮肤cDNA文库，从中筛选得到Hainanenin-1的前体序列，基因测序结果表明编码海南瑞娃(Amolops hainanensis)Hainanenin-1前体的基因由321个核苷酸组成，自5’端至3’端序列为:I ATGTTGCCCT TGAAGAAATC CATGTTACTC CTTTTCTTCC TTGGGACCAT CAACTTATCT 61CTCTGTGAGCAAGAGAGAGA TGCCGAAGAA GAAAGAAGAG ACGATGAAGA TAAAAGGGAT121 GTTGAAGTGG AAAAACGATT TGCATTAGGT GCGGTTACTA AGCTTTTGCC ATCACTGTTA181 TGTATGATTA CCAGAAAATG TTGAAGCTTG AGCTGGAAAT CATCTGATGA GAAATATAAT24ITTAGCTAAAT GCACATCAGA TATCTTATAA AAAATAAAAA TTCTCACATA TAAAAAAAAA 301AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA编码海南瑞娃(Amolopshainanensis)成熟肽 Hainanenin-l 为第 139-201 位核昔酸，其氛基酸序列为=PhelAla2Leu3Gly4Ala5Val6Thr7Lys8Leu9Leuic1ProllSer12Leu13Leu14Cys15Metl6Ile17Thr18Arg19Lys20Cys21 (FALGAVT KLLPSLLCMITRKC)。Hainanenin-1的化学合成方法:根据编码海南瑞娃(Amolops hainanensis)抗菌肽Hainanenin-l成熟肽的氨基酸序列，用自动多肽合成仪合成其全序列；通过HPLC反相柱层析脱盐纯化，并确定其纯度大于95% ;用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALD1-T0F-MS)测定其分子量。化学合成得到的高纯度Hainanenin-1抗微生物肽可以溶于灭菌超纯水,用于药理活性检测。
本发明的有益效果在于从海南湍蛙皮肤分泌物冻干粉中分离纯化得到抗微生物肽Hainanenin-l,从已构建海南瑞娃(Amolops hainanensis) cDNA文库中克隆得到编码抗微生物肽Hainanenin-1前体的基因,通过化学合成方法得到成熟肽Hainanenin-1。该环状抗菌肽Hainanenin-1分子量小，结构简单，仅含一个二硫键，方便化学合成及基因工程制备。相比较两栖动物来源的已报道的其他家族抗菌肽，Hainanenin-l抗微生物活性更强，且具有广谱的抗微生物活性，对革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌和真菌均有活性，其中包括大量临床分离耐药菌株，此外还具有溶血性低有益特点，均使Hainanenin-l成为外用抗菌药物开发的优良模板。
图1A为本发明海南瑞娃(Amolops hainanensis)抗微生物肽Hainanenin-l的SephadexG-50凝胶过滤柱层析图。箭头所示为活性峰。图1B为本发明海南瑞娃(Amolops hainanensis)抗菌肽Hainanenin-l反相高压液相色谱图。箭头h所示为Ha inanenin-l。
具体实施例方式下面结合技术方案详细叙述本发明的具体实施例，但本发明的内容并不局限于此。实施例1Hainanenin-1的分离纯化:选取健康状况良好的成年海南瑞娃(A.hainanensis)(η = 5)，用超纯水淋洗背部。采用电刺激法收集皮肤分泌物，用电击器对蛙背部皮肤进行电刺激，电压10V，电击时间3ms，经刺激后，将皮肤分泌物用0.9%的生理盐水冲洗至干净的容器内，12000rpm离心20min，弃上清、冷冻干燥后保存。_20°C保存备用。第一步Sephadex G_50凝胶过滤层析:0.9g A.hainanensis背部皮肤分泌物冻干粉用 IOml0.1M 磷酸盐(Na2HPO4-NaH2PO4, pH 6.0)缓冲液溶解，12000rpm 离心 IOmin,取上清液上样于已平衡好的Sephadex G-50凝胶排阻色谱柱(1.6cm x 90cm, AmershamBioscience),用同样缓冲液洗脱,流速3mL/10min,用自动部分收集器收集3mL/管，220nm检测并收集各峰检测抗菌活性，冻干备用。第二步反相高压液相层析(RP-HPLC)为:S印hadex G-50凝胶排阻色谱分离得到的活性成分的峰重新溶解于纯水中，4°C, 12000rpm离心15min,取上清液,用0.45 μ m滤膜过滤，收集滤液上样于经含1%。三氟乙酸的超纯水充分平衡的C18反相柱(Hypersil BDSC18, 30cm X 0.46cm)用乙腈(含1%。三氟乙酸)构成的洗脱系统进行梯度洗脱，215nm检测多肽浓度。收集得到的各峰，冻干浓缩，用灭菌的去离子水重新溶解并进行抗菌活性检测。第三步一级结构分析纯化的Hainanenin-1分子量测定采用电喷雾四级杆飞行时间串联质谱法(ES1-Q-TOF-MS,Biosystems/MDS Sciex多伦多,加拿大)。等电聚焦电泳测定等电点，用自动氨基酸测序仪测定氨基酸序列结构。实施例2抗微生物肽Hainanenin-l前体基因的克隆及基因测序，包括:米用AxyPrepTM Multisource Total RNA Miniprep Kit 提取海南瑞娃(Amolopshainanensis)皮肤总RNA,利用Creator SMART cDNA library建库试剂盒构建海南瑞娃(Amolops hainanensis)皮肤 cDNA 文库。PrimeScript Reverse Transcriptase 反转录合成cDNA第一链，引物为:正向SMARTer V Oligonucleotide:5' -MGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACXXXXX-3'(X = undisclosed base in the proprietary SMARTer oligo sequence)反向3’ In-Fusion SMARTer CDS Primer:5’ -CGGGGTACGATGAGACACCATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN-3’ (N = A, C, G, or T ；V =A, G, or C)。利用Advantage DNA Polymerase 合成第二链，引物为:正向 5’ -primer:5' -AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3'。反向引物同为 3，In-Fusion SMARTer CDS Primer。设计一条特异性正向引物(Pl)和一条反向非特异性通用引物(3’ -primer),以海南瑞娃(Amolops hainanensis)皮肤cDNA文库为模板，PCR扩增Hainanenin-1前体的cDNA。正向Pl:5，-CCAAAGATGTTSMCCWYGAAG-3，(M = A or C ；ff = A or T ；Y = C or T)反向非特异性通用引物为3’ -primer,其序列为:5' -CGGGGTACGATGAGACACCAT-3 '所获阳性单克隆进行基因核苷酸序列测定，pMD 19-Tvector测序 通用引物:正向M13F:5' -CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3'；反向Ml3R: 5' -GAGCGGATAACAATTTCACACAGG-3'；具体步骤如下:第一步、AxyPrepTMMultisource Total RNA Miniprep Kit 提取海南瑞娃(Amolops hainanensis)皮肤总RNA (以下实验所用器具和试剂均经过处理,无RNase):A.从新鲜宰杀的海南瑞娃(Amolops hainanensis)背部剪下一小块皮肤组织,放入液氮预冷的细胞冻存管中，然后迅速放入液氮中保存；B.将保存在液氮中的组织材料取出，放入预冷的研钵内，迅速充分研磨，期间不断向研钵内加入少许液氮，研磨成粉末，加入400 μ I Buffer R_I,用注射器反复抽吸8_10次，转入1.5ml离心管(试剂盒提供)中。加入150μ1 Buffer R-1I，漩涡振荡15_30s，12, 000 X g 离心 5min。C.将离心后的上清转移至新的1.5ml离心管中，加入250 μ I异丙醇，混合均匀。将制备管置于2ml离心管(试剂盒提供)中，转移步骤4中的混合液到制备管中，6，000 Xg离心lmin。弃滤液，将制备管置回到2ml离心管中，制备管中加入500μ I Buffer WlA,12，000 Xg离心lmin。弃滤液，将制备管置回到2ml离心管中，制备管中加入700 μ I BufferW2，12，000 Xg离心lmin ;以同样的方法再用700 μ I Buffer W2洗涤一次。弃滤液，将制备管置回到2ml离心管中，12，OOOXg离心lmin。将制备管放入一干净的1.5ml离心管(试剂盒提供)中，在制备管膜中央加70-100 μ I Buffer TE。室温静置lmin，12，000Xg离心lmin,洗脱得RNA。第二步、Creator SMART cDNA library 建库试剂盒构建海南瑞娃(Amolopshainanensis)皮肤 cDNA 文库:第一链的合成(mRNA反转录):
A.在新的0.2ml PCR管(无DNase和RNase)中配制下列混合液:
权利要求
1.一种海南瑞娃抗微生物肽Hainanenin-Ι,其特征在于,是一种从海南瑞娃皮肤分泌液中分离出来的C端含有七元Rana Box的环状多肽，分子量为2278.90道尔顿，等电点为9.50，多肽全序列一级结构为:苯丙氨酸-丙氨酸-亮氨酸-甘氨酸-丙氨酸-缬氨酸-苏氨酸-赖氨酸-亮氨酸-亮氨酸-脯氨酸-丝氨酸-亮氨酸-亮氨酸-半胱氨酸-蛋氨酸-异亮氨酸-苏氨酸-精氨酸-赖氨酸-半胱氨酸。
2.—种海南瑞娃抗微生物肽Hainanenin-1的分离纯化方法,其特征在于，电刺激海南湍蛙收集皮肤分泌液离心去除沉淀，冷冻干燥后经S^hadex G-50凝胶过滤柱层析和反相高压液相色谱后分离纯化后得到。
3.—种海南瑞娃抗微生物肽Hainanenin-1的化学合成方法,其特征在于,根据编码海南瑞娃(Amolops hainanensis)抗微生物肽Hainanenin_5成熟肽的氨基酸序列,用自动多肽合成仪合成其全序列；通过HPLC反相柱层析脱盐纯化，并确定其纯度大于95% ;用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALD1-TOF-MS)测定其分子量。
4.一种海南瑞娃抗微生物肽Hainanenin-1的基因，其特征在于，抗微生物肽Hainanenin-1前体的基因由320个核苷酸组成，自5’端至3’端序列为:IATGTTGCCCT TGAAGAAATC CATGTTACTC CTTTTCTTCC TTGGGACCAT CAACTTATCT61 CTCTGTGAGC AAGAGAGAGA TGCCGAAGAA GAAAGAAGAG ACGATGAAGA TAAAAGGGAT121 GTTGAAGTGG AAAAACGATT TGCATTAGGT GCGGTTACTA AGCTTTTGCC ATCACTGTTA181 TGTATGATTA CCAGAAAATG TTGAAGCTTG AGCTGGAAAT CATCTGATGA GAAATATAAT241 TTAGCTAAAT GCACATCAGA TATCTTATAA AAAATAAAAA TTCTCACATA TAAAAAAAAA301 AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA 编码海南瑞娃成熟肽Hainanenin-1为第139-201位核苷酸,其氨基酸序列为The1Ala2Leu3Gly4Ala5Val6Thr7Lys8Leu9Leui0ProllSeri2Leui3Leui4Cysi5Metl6Ile17Thr18Arg19Lys20Cys21 (FALGAVT KLLPSLLCMITRKC)。
5.权利要求1所述的海南瑞娃抗微生物肽Hainanenin-1具有抗微生物感染的作用，能够作为制备病原微生物感染疾病的治疗药物。
6.权利要求3所述的海南瑞娃抗微生物肽Hainanenin-1基因的应用，其特征在于，Hainanenin-1抗微生物肽具有很强的抗微生物作用，溶于灭菌超纯水，用于药理活性检测。
全文摘要
一种海南湍蛙的抗微生物肽Hainanenin-1及其基因，分离纯化、化学合成和应用，属于生物医学技术领域。Hainanenin-1是电刺激海南湍蛙收集皮肤分泌液离心，冻干后经凝胶过滤柱层析和RP-HPLC后纯化后得到的一种C端含有七元环的小肽，分子量为2278.90，等电点9.50。其一级结构为苯丙氨酸-丙氨酸-亮氨酸-甘氨酸-丙氨酸-缬氨酸-苏氨酸-赖氨酸-亮氨酸-亮氨酸-脯氨酸-丝氨酸-亮氨酸-亮氨酸-半胱氨酸-蛋氨酸-异亮氨酸-苏氨酸-精氨酸-赖氨酸-半胱氨酸。编码Hainanenin-1前体基因由320个核苷酸组成，其中编码成熟肽部分的为第139-201位核苷酸。Hainanenin-1作为制备病原微生物感染疾病的治疗药物被应用，具有广谱的抗微生物活性，同时还具有溶血性低的特点。
文档编号C12N15/12GK103172721SQ20111044018
公开日2013年6月26日 申请日期2011年12月26日 优先权日2011年12月26日
发明者于海宁, 王义鹏, 冯菲菲, 广慧娟, 何伟玉 申请人:大连理工大学