专利名称：一种用于诊断Xp11.2易位性肾癌的探针组合及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于荧光原位杂交探针应用领域，涉及一种用于诊断Xpll. 2易位性肾癌的探针组合及其在制备Xpll. 2易位性肾癌诊断试剂中的应用。
背景技术：
2004年WHO对1997年肾细胞癌病理组织学分类进行了修改，新增了 Xpll. 2易位 /TFE3基因融合相关性肾癌(Xpll.2易位性肾癌)，这一罕见类型肿瘤。虽然其总体发病率很低，但在儿童肾癌患者中约1/3为此类肾癌，并且回顾性研究表明此类肿瘤在我国并不罕见。本项目申请人于2007年在国内首次用免疫组化的方法诊断并报道了 11例该肿瘤。 最新的研究表明，Xpll. 2易位性肾癌预后要比非Xpll. 2易位性肾癌预后差。并且不同基因类型Xpll. 2易位性肾癌的预后有所区别。此外，有明确证据表明Xpll. 2易位性肾癌的患者对血管内皮生长因子受体(vascular endothelial growth factor receptor,VEGFR) 或哺乳动物雷帕霉素(mammalian target of rapamycin, mTOR)分子靶向治疗敏感。另有研究表明，MET酪氨酸激酶为ASPL-TFE3融合基因的靶基因，并有望成为Xpll. 2易位性肾癌的治疗靶点。因此根据基因型，来精确诊断此类肿瘤显得十分重要。该肿瘤的分子病理特征是存在包含Xpll. 2在内的染色体易位，最终都导致包含 TFE3转录因子基因在内的基因融合。目前至少有7种不同的易位形式被报道，但明确位点的只有 5 种，包括 t(X ；1) (pll. 2 ；q21)，导致 PRCC 和 TFE3 基因融合；t(X ；17) (pll. 2 ；q25)， 导致ASPL 与 TFE3 基因融合；t(X ；1) (pll. 2 ；p34)，导致PSF和 TFE3 基因融合；inv (X) (pll ； ql2)，导致 Non0(p54nrb)和 TFE3 基因融合；t(X ；17) (pll. 2 ；q23)，导致 CLTC-TFE3 基因融合。目前认为由于启动子的变换，这些融合基因最终高表达TFE3融合蛋白。因此应用免疫组化检测细胞核TFE3融合蛋白是目前诊断Xpll. 2易位性肾癌重要方法之一。但其缺点是该方法容易受到多种因素影响，如组织固定时间、组织修复方式、抗体克隆号以及人为的判读因素等等。使得结果可能出现假阳性或假阴性。尤其是当组织学形态不典型时诊断往往更加困难。此外，通过对融合基因mRNA的研究发现，该类肿瘤所有融合或易位的节点均位于外显子的起始点或终点，因此我们无法获知DNA水平的融合和易位节点，也就不能在DNA水平用PCR的方法检测融合基因。由于该肿瘤相对少见，工作中较难获得新鲜组织样本，因此采用RT-PCR方法检测TFE3融合基因，或通过观察细胞核型来判断融合基因类型的诊断方法并不多见，其操作也不便捷。更精确且便捷的分子病理诊断方法有待于进一步建立。染色体荧光原位杂交(FISH)始于传统的细胞遗传学和DNA技术的结合，快速灵敏、特异性好，可以检测隐匿或微小的染色体畸变以及复杂核型；还可以使用多种荧光标记，显示DNA片段及基因之间的相对位置与方向，空间定位精确。此外，FISH的方法，可以在石蜡包埋的样本上进行回顾性研究，大大降低了对研究样本的要求。目前，利用荧光原位杂交(FISH)诊断该肿瘤的方法国外报道较少，国内尚未见报道。国外文献中的类似探针
[1]Argani P, Aulmann S, Karanjawala Z, Fraser RB, Ladanyi M, Rodriguez MM. Melanotic Xpl 1 translocation renal cancers -.a distinctive neoplasm with overlapping features of PEComa, carcinoma, and melanoma. Am J Surg Pathol. 2009 Apr ；33 (4) :609-619.S Aulmann, T Longerich, P Schirmacher, G Mechtersheimer & R Penzel Detection of the ASPSCR1-TFE3 gene fusion in paraffin-embedded alveolar soft part sarcomasHistopathology 2007,50,881-886.所用探针RPCI11-211H10，RPCI11-58H17，RPCI11-122 N23, RPCI-57A11 (着丝粒端)RPCIl 1-552E4，RPCI11-344N17, RPCI11_7;35G22 (端粒端).评价该探针使用了较多的克隆片段费用昂贵，且只在2例Xpll. 2易位/TFE3基因融合相关性肾癌和5例腺泡状软组织肉瘤中验证过。[2]Zhong M, De Angelo P, Osborne L, Keane-Tarchichi Μ, Goldfischer Μ, Edelmann L, Yang Y, Linehan WM, Merino MJ, Aisner S, Hameed Μ. Dual-color, break-apart FISH assay on paraffin-embedded tissues as an adjunct to diagnosis of Xpll translocation renal cell carcinoma and alveolar soft part sarcoma. Am J Surg Pathol. 2010 Jun ；34(6) :757-766.所用探针RPll-404P16(458kb)andRPl 1-416B14 (182kb)端粒端 RPll-528A24(116kb)and RP11-58H17 (182kb)着丝粒端评价该探针的克隆片段大小不一，最大的和最小的相差300多1Λ，容易产生原位杂交条件的异质性。且只在5例Xpll. 2易位/TFE3基因融合相关性肾癌和2例腺泡状软组织肉瘤中验证过。
发明内容
本发明的目的是针对上述技术问题提供一种用于诊断Xpll. 2易位性肾癌的探针组合。本发明另一个目的是提供上述探针组合在制备Xpll. 2易位性肾癌诊断试剂中的应用。本发明再一个目的是提供含有上述探针组合的诊断试剂盒。本发明的目的是通过下列技术方案实现的一种用于诊断Xpll. 2易位性肾癌的探针组合，该组合为BAC克隆片断(或者叫 BAC 克隆探针)RP11-58H17，RP11-352D11，RP11-416B14，RP11-107C19。所述的探针组合，其中RP11-58H17和RP11-352D11定位于TFE3着丝粒一侧，二者标记为相同的任意一种颜色的荧光；RP11-416B14和RP11-107C19定位于TFE3端粒一侧， 二者标记为相同但与着丝粒一侧标记的颜色不同的荧光。所述的探针组合，其中RP11-58H17和RP11-352D11均标记为绿色荧光， RP11-416B14和RP11-107C19均标记为红色荧光；标记的荧光颜色可以互换。所述的探针在制备Xpll. 2易位性肾癌诊断试剂中的应用。一种Xpll. 2易位性肾癌诊断试剂盒，其特征在于该试剂盒包含权利要求1所述的探针。
以下是本发明技术方案详细的说明本发明采用的探针组合与现有技术不同，是基于对染色体上TFE3基因两端的不同的BAC克隆片段结合位点的分布位置、大小等情况的分析而采取的优选方案。本发明中，TFE3着丝粒一侧BAC克隆片段为RPl 1-58H17 (片段长度2001Λ) 和RP11-352D11 (片段长度175kb)，TFE3端粒一侧BAC克隆片段为RP11_416B14(片段长度1821Λ)和RP11-107C19(片段长度1601Λ)，这些片段为细菌人工染色体 (Bacterial artificial chromosome，BAC)克隆，其在人类染色体上的定位已经公开， 分别为 RP11_58H17(X 染色体 49444577-49644633) X 染色体、RP11-352D11 (X 染色体 49071535-49246795)、RP11_416B14 (X 染色体 48465815-48648142)、RP11_107C19 (X 染色体 48172092-48332445) TFE3 基因的定位为(X 染色体 48771185-487879 )。BAC 克隆片段与 TFE3 基因的链接顺序为 RP11-58H17，RP11-;352D11，TFE3，RP11-416B14，RP11-107C19(从着丝粒侧向端粒侧方向)。TFE3基因与染色体上结合的BAC克隆片段之间以及相邻BAC克隆片段之间保持一定距离而不会重叠(本发明中最大为2831Λ，最小为981Λ)。这样，由于采用的BAC克隆片段大小相近(本发明中最大和最小之间相差仅为401Λ)，两端BAC克隆片段之间最远距离控制在15001Λ以内，彼此之间存在适当的间隔，使得在进行荧光观察时，端粒侧两个BAC克隆片段显示一种荧光，如红色，着丝粒侧两个BAC克隆片段显示另一种荧光，如绿色，在非 Xpll. 2易位性肾癌时，TFE3基因不断裂，红绿两种荧光靠得比较近，观察时出现红绿融合信号(表现为红绿相连或黄色信号点)，而在Xpll. 2易位性肾癌时，TFE3基因断裂，导致红绿两种荧光离得比较远，观察时无需放大即可见到分离较远的红绿两种信号，很容易观察。在X染色体TFE3基因每端连接2个标记同种颜色的荧光的BAC克隆片段是为了增强荧光强度及范围，通过实验观察，2个BAC克隆片段的荧光强度及范围已经足够观察， 既避免了 1个BAC克隆片段可能出现荧光强度不够范围过小的情形，又避免了采用多个BAC 克隆片段会导致荧光范围较分散容易产生干扰并且成本也较高的弊端。选择这4种BAC克隆片段有以下几个方面的考虑①这几个BAC克隆片段大小相近，带来的好处是每一端的荧光强度保持一致，防止一端过强而另一端过弱而影响观察； 另外可使原位杂交条件保持一致性。②结合位置使相邻BAC克隆片段之间能够保持适当的距离，能够增强每一端荧光强度及范围。③可使TFE3基因两端BAC克隆片段最远距离控制在15001Λ之内，两种荧光颜色之间存在TFE3基因，使得在TFE3基因未断裂时呈现融合信号(如表现为红绿相连或黄色信号点)，而在TFE3基因断裂时两种荧光颜色分离比较远，很容易观察。否则，若TFE3基因两端BAC克隆片段最远距离过大，如超过15001Λ甚至更大， 则无论TFE3基因是否断裂，均观察到明显分离的两种荧光，就很难判断是否存在Xpll. 2易位性肾癌。BAC克隆片段标记荧光便于采用荧光显微镜观察，方便直观。当然，BAC克隆片段也不限于标记荧光，采用其他检测技术时可以标记成对应检测技术所用的标记物。本发明的有益效果本发明根据Xpll. 2易位性肾癌的特点，设计结合在TFE3基因两端的荧光标记DNA 探针组合，在石蜡包埋组织切片的基础上进行原位杂交，检测融合及分离信号，可大大提高诊断该类肿瘤的准确率。为分子靶向治疗提供依据。根据我们的实验结果，该探针组合诊
5断的特异性和敏感性均达到了 100%，且操作对象只需要在石蜡包埋组织切片上进行，时间仅为两个工作日。采用本发明提供的探针组合进行检测Xpll. 2易位性肾癌，不但方便、快速、可靠而且成功率高，可用于制备Xpll. 2易位性肾癌诊断试剂盒，为Xpll. 2易位性肾癌的快速准确的诊断提供了新的工具。
图1 :BAC克隆探针定位模式图。图2 3例Xpll. 2易位性肾癌融合基因的检测图。其中图A，图B RT-PCR结果示3例肿瘤组织及癌旁组织均检测出一条大小约 190-bp ASPL-TFE3融合基因条带(图A)和另一条大小约200_bpTEF3_ASPL融合基因条带(图B)；图C测序结果显示17号染色体和X染色体存在平衡性易位，ASPL-TFE3融合基因大小为195-bp(ASPL外显子7与TFE3外显子4相连)。TEF3-ASPL融合基因大小为 218-bp (TFE3外显子3与ASPL外显子8相连)。图3 组织芯片的平面图。图4 正常女性肾组织每个细胞核内可见2个红绿融合信号(箭头所指红绿重叠部分表现为黄色，放大后观察实为靠得很近的红绿信号)，代表2条X染色体均完整。图5 正常男性肾组织每个细胞核内可见1个红绿融合信号(箭头所指红绿重叠部分表现为黄色，放大后观察实为靠得很近的红绿信号)，代表1条X染色体完整。图6 男性乳头状肾细胞癌中每个细胞核内可见1个红绿融合信号(箭头所指红绿重叠部分表现为黄色，放大后观察实为靠得很近的红绿信号)，未见红绿分离信号。图7 男性肾透明细胞癌中每个细胞核内可见1个红绿融合信号(箭头所指红绿重叠部分表现为黄色，放大后观察实为靠得很近的红绿信号)，未见红绿分离信号。图8 (男性)Xpll. 2易位性肾癌肿瘤组织细胞核内可见1对红绿分离信号(无需放大即可清楚地观察到红绿信号分离较远)，代表一条X染色体TFE3基因断裂。图9 (女性)Xpll. 2易位性肾癌肿瘤组织细胞核内箭头所指可见1个红绿融合信号(红绿重叠部分表现为黄色，放大后观察实为靠得很近的红绿信号)和1对红绿分离信号(无需放大即可清楚地观察到红绿信号分离较远)，代表一条X染色体完整而另一条X染色体TFE3基因断裂。
具体实施例方式以下通过实施例对本发明作进一步的阐述。实施例中所述的探针即BAC克隆片段，也可以叫BAC克隆探针。实施例1 :DNA探针组合的制备选择能够在X染色体TFE3基因两端分别连接的2个BAC克隆片段，控制两端探针之间最远距离在15001Λ以内，BAC克隆片段之间保持一定距离不重叠，片段大小相近。克隆片段出处为EmpireGenomics公司的人类BAC克隆中心(http //www. empiregenomics. com/helixhq/clonecentral/search/human)。TFE3 着丝粒一侧 BAC 克隆片断为 RPll-58H17(200kb)和 RP11-352D11 (175kb)，TFE3 端粒一侧 BAC 克隆片断为 RPll-416B14(182kb)和 RP11-107C19 (160kb)。BAC 克隆片段与 TFE3 基因的链接顺序为RP11-58H17, RP11-352D11，TFE3, RP11-416B14，RP11-107C19。探针组合的定位结构如图 1 所示。利用缺口平移方法将端粒侧的二个BAC克隆片段标记成相同的任意一种颜色的荧光，优选红色荧光，将着丝粒侧的二个BAC克隆片段标记成相同但与着丝粒一侧标记的颜色不同的荧光，优选绿色荧光；两端标记的荧光颜色可以互换。该方法为本领域技术人员所熟知(标记荧光的BAC克隆片段由美国EmpireGenomics公司提供)。TFE3着丝粒一侧两个BAC克隆片段在荧光显微镜下为一个绿色荧光信号，代表TFE3基因着丝粒侧。TFE3端粒一侧两个BAC克隆片段在荧光显微镜下为一个红色荧光信号，代表TFE3基因端粒侧。两端标记的荧光颜色可以互换。正常情况下红绿信号相连或重叠为融合信号，在Xpll. 2易位性肾癌时，由于X染色体TFE3基因断裂易位使得红绿信号分离。进一步，可将制备的探针组合采用荧光原位杂交方法，在Xpll. 2易位性肾癌、非 Xpll. 2易位性肾癌和癌旁组织中验证其定位和/或诊断效果是否可靠。实施例2 荧光原位杂交过程一、标本的组织芯片构建收集南京军区南京总医院诊断肾细胞癌51例。由两位经验丰富的病理医生参照 WHO 2004泌尿及男性生殖系统分类标准、免疫组化TFE3阳性、及RT-PCR检测融合基因结果(图2A、B、C，51例患者中有3例是在mRNA层面得到了诊断，与本实验结果相互对应更能体现出本实验的可靠性)，重新进行诊断评估，结果最终诊断Xpll. 2易位性肾癌M例、透明细胞癌9例、乳头状肾癌17例(其中散发性乳头状肾癌16例，VHL病相关性乳头状肾癌 1例)、不能分类的肾细胞癌1例。将以上标本(包括癌和癌旁组织)制作成组织芯片(图 3)。二、荧光原位杂交 组织芯片3 μ m厚切片，在脱蜡后，依次置于100 %、85 %、70 %乙醇中各2min，随后浸入去离子水中，100°C水浴15min。将组织切片放入胃蛋白酶K溶液(0. Ig胃蛋白酶，40ml 0. OlM HCL)37°C，15min ；2 X SSC (氯化钠、柠檬酸钠)漂洗2次，各5min，切片置于0. Imol/ L HCl中室温浸泡lOmin，用2XSSC漂洗2次，各5min;经70%、85%、100%乙醇各脱水 2min，于空气中干燥；在组织区域加IOul上述荧光标记的探针的混合液(其中每个探针各 0.5μ 1，4个探针共2μ 1，另加8μ 1的杂交缓冲液，杂交缓冲液在购买荧光标记探针时由 EmpireGenomics公司提供，内含人类Cotl DNA)，加盖玻片，用橡皮胶封边；放入原位杂交仪(GeneAmp In Situ PCR System 1000)中 88°C变性6min后 37°C过夜(16h)；移去盖玻片， 将玻片置于0. 4 X SSC (氯化钠、柠檬酸钠、0. 3 % NP-40)溶液中，69 °C漂洗Imin ； 2 X SSC (氯化钠、柠檬酸钠、0. 1%ΝΡ-40)溶液中漂洗lmin，70%乙醇;3min，室温暗处干燥；靶区域滴加 10 μ 1 4'，6-二脒基-2-苯基吲哚 , 6-diamidino-2-phenylindole DAPI)，用盖玻片封片后，再用荧光显微镜观察结果。结果判定正常细胞X染色体，男性标本可见1个红绿融合信号，女性可见2个红绿融合信号，表现为红绿相连或黄色信号点。肿瘤细胞，男性标本可见一对红绿分离的异常信号，女性可见一个正常的融合信号和一对异常的红绿分离信号。为排除假阳性和假阴性，每个样本计数100个细胞，只有当4个荧光信号(女性)或2个荧光信号(男性)均存在时，才纳入计数对象(在女性，无论正常和肿瘤我们都会看到4个单信号(两绿和两红)，只不过在正常女性红绿信号是成对融合的，看上去是两个融合信号，但实际是由四个单信号组成。 在肿瘤中见到一个融合信号和一对红绿分离的单信号，表面上看是3个信号，但实际还是由4个单信号组成的)。红绿荧光信号之间的距离大于一个信号宽度时计为分离信号。当异常信号大于10%时记为阳性。以上结果判断方法依据市面上多数类似的商业化探针所行使的评判标准，如Vysis公司和Dako公司的探针使用方法。结果我们对51例肾癌进行检测，其中Xpll. 2易位性肾癌M例、透明细胞癌9例、乳头状肾癌17例(其中散发性乳头状肾癌16例，VHL病相关性乳头状肾癌1例)、不能分类的肾细胞癌1例。结果M例Xpll. 2易位性肾癌均检测出异常分离信号，其阳性细胞数范围在20% -85% (荧光显微镜无法给出100个细胞的视野供人观察，因此20% -85%的数据只能考多次计数得来)，其余肿瘤及癌旁正常肾组织均未检测出异常信号(图2-9给出了组织芯片、男性及女性Xpll. 2易位性肾癌代表性阳性图片、其余肿瘤如透明细胞癌和乳头状肾癌的阴性图片、男女正常肾组织的阴性图片)。说明使用该探针检测Xpll. 2易位性肾癌的特异性和敏感性同为100%敏感性=真阳性/所有Xpll. 2易位性肾癌肿瘤病人数X 100% 真阳性病例 /24Xpll. 2易位性肾癌=100% ；特异性=真阴性/所有非Xpll. 2易位性肾癌肿瘤病人数X100%;27真阴性病例 /27非Xpll. 2易位性肾癌肿瘤病人。评价本组探针使用的克隆片段相对较少，且克隆片段大小相对一致，最大和最小之间相差仅为401Λ。在设计上即考虑到了经济性又考虑到了原位杂交条件的一致性。此外，在本实验中TFE3双色破裂分离荧光原位杂交探针的特异性和敏感性均达到了 100%。利用 FISH技术，使用TFE3双色破裂分离荧光原位杂交探针来诊断Xpll. 2易位性肾癌。快速、可靠且成功率高，是诊断Xpll. 2易位性肾癌的一项新技术，值得推广。实施例3 =Xpll. 2易位性肾癌诊断试剂盒试剂盒中含有实施例1所述的探针组合，该探针组合的特征主要是(1)TFE3着丝粒一侧BAC克隆探针为RP11_58H17(片段长度200kb)和 RP11-352D11 (片段长度1751Λ)，标记绿色荧光。这两个探针在荧光显微镜下为一个绿色荧光信号，代表TFE3基因着丝粒侧。(2) TFE3端粒一侧BAC克隆探针为RP11_416B14(片段长度182kb)和 RP11-107C19(片段长度160kb)，标记红色荧光。这两个探针在荧光显微镜下为一个红色荧光信号，代表TFE3基因端粒侧。(3)正常情况下红绿信号相连或重叠为融合信号，在Xpll. 2易位性肾癌时，由于X 染色体TFE3基因断裂易位使得红绿信号分离。
8
权利要求
1.一种用于诊断Xpll. 2易位性肾癌的探针组合，其特征在于该探针组合为BAC克隆片断 RP11-58H17，RP11-352D11，RP11-416B14，RP11-107C19。
2.根据权利要求1所述的探针组合，其特征在于RP11-58H17和RP11-352D11定位于 TFE3着丝粒一侧，二者标记为相同的任意一种颜色的荧光；RP11-416B14和RP11-107C19定位于TFE3端粒一侧，二者标记为相同但与着丝粒一侧标记的颜色不同的荧光。
3.根据权利要求2所述的探针组合，其特征在于RP11-58H17和RP11-352D11均标记为绿色荧光，RP11-416B14和RP11-107C19均标记为红色荧光；标记的荧光颜色可以互换。
4.权利要求1所述的探针在制备Xpll.2易位性肾癌诊断试剂中的应用。
5.一种Xpll. 2易位性肾癌诊断试剂盒，其特征在于该试剂盒包含权利要求1所述的探针。
全文摘要
本发明属于属于荧光原位杂交探针应用领域，公开了一种用于诊断Xp11.2易位性肾癌的探针组合及其应用。该探针组合为BAC克隆片断RP11-58H17，RP11-352D11，RP11-416B14，RP11-107C19。该探针组合诊断Xp11.2易位性肾癌的特异性和敏感性均达到了100％，方便、快速、可靠而且成功率高，可用于制备Xp11.2易位性肾癌诊断试剂。
文档编号C12N15/11GK102424848SQ20111044021
公开日2012年4月25日 申请日期2011年12月26日 优先权日2011年12月26日
发明者刘标, 周晓军, 王璇, 饶秋, 马恒辉 申请人:中国人民解放军南京军区南京总医院