专利名称：家蚕肠道内中性蛋白酶产酶菌株、其中性蛋白酶基因和原核表达载体及制备方法
技术领域：
本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及家蚕肠道内中性蛋白酶产酶菌株、其中性蛋白酶基因和原核表达载体及制备方法。
背景技术：
蚕是产生较大经济效益和社会效益的重要经济昆虫，家蚕作为一种重要的经济动物与鳞翅目昆虫研究模型，具有生长快、周期短的特点，但是蚕业生产过程中一直存在着叶丝转化率较低等问题，蚕肠道益生菌产酶有助于家蚕更好地消化食物，并有一定的抑制病原菌生长作用，因而研究蚕肠道菌及其产酶并对产酶基因进行原核表达分析，在改善蚕肠微生态环境及蚕人工饲料开发上有一定意义。家蚕肠道微生物的研究始于20世纪60年代，90年代后报导逐渐增多，李蒙英等分离出部分家蚕肠道菌并运用生理生化方法进行了鉴定；易发平等研究了家蚕肠道微生物好氧菌群，袁志辉、田贞华等结合分子操作技术对家蚕肠道细菌群体进行了较全面的分析研究。高绘菊等对家蚕肠道产消化酶菌株进行了筛选。相辉、鲁兴盟等的研究将利于了解菌群在家蚕生理、代谢中的作用及蚕病的解决。国内外关于枯草芽孢杆菌产蛋白酶的研究报导目前较多，国内的研究主要集中在对酶蛋白进行分子克隆与诱导表达。许波、白玮等从枯草芽孢杆菌中克隆出中性蛋白酶基因，构建了表达载体并在酵母中成功地实现产酶基因的高效表达。罗文华等成功获得了高纤溶酶活性的重组表达菌。Fatemeh, Priya Pillai, Ayse, Elif Orhan, Hiroyuki 等分别获得不同来源的枯草芽孢杆菌蛋白酶并进行了纯化。另有学者分离出具较强纤溶蛋白酶活性的枯草芽孢杆菌并纯化该酶得到了分子量为27. 5kD的酶蛋白，为一枯草杆菌蛋白酶家族的丝氨酸蛋白酶。关于益生菌的饲料添加试验，孙雪奇等从家蚕肠道内筛选出多株好氧及兼性厌氧微生物，选用部分菌种配成混合菌液，在家蚕4龄最后一天进行添食试验，结果家蚕发病率明显降低，全茧量和茧层量均有较大提高，证明了蚕肠道产酶菌作为益生菌使用的可行性。蛋白质为蚕必须的营养成分之一，蛋白酶可帮助蚕食物中的蛋白质成分更好地消化吸收。幼龄家蚕中肠消化液中消化酶缺乏，因此将产酶益生菌添加到家蚕人工饲料中或涂抹于桑叶表面喂食家蚕，将有利于蚕充分消化吸收蛋白质、淀粉等营养物质，提高饲料效率。对家蚕肠道菌产酶基因进行分析研究，将有利于进一步提高蚕用微生态制剂的应用潜力。
发明内容
枯草芽孢杆菌为常用的产蛋白酶益生菌，该菌所产酶类在工业生产方面应用较多，但在蚕用益生菌方面鲜见报导。本发明对家蚕肠道产蛋白酶细菌菌株进行了筛选分离， 对筛选出的产蛋白酶细菌菌株进行16SrDNA法分析鉴定其种属，对得到的枯草芽孢杆菌中性蛋白酶基因进行克隆并在大肠杆菌表达系统中进行原核表达分析。为进一步纯化和鉴定目的蛋白及研究其功能奠定了一定的试验基础。本发明的目的是为了解决目前在家蚕肠道内枯草芽孢杆菌研究不足的问题，本发明公开了家蚕肠道内中性蛋白酶菌株及其制备方法。本发明的第二个目的在于公开了由上述家蚕肠道内中性蛋白酶菌株中的中性蛋白酶产酶基因以及由该中性蛋白酶产酶基因构建的原核表达载体及其制备方法。本发明的技术方案如下—种家蚕肠道内中性蛋白酶产酶菌株，其中，所述家蚕肠道内中性蛋白酶产酶菌株的16Sr DNA如序列表1所示。上述技术方案中所述的产酶菌株中的中性蛋白酶基因序列，其中，所述中性蛋白酶基因的基因序列如序列表2所示。包含上述技术方案中所述的中性蛋白酶基因的原核表达载体。包含上述技术方案中所述的中性蛋白酶基因的原核表达载体pET28a-npr。上述技术方案中所述的家蚕肠道内中性蛋白酶产酶菌株的制备方法，包括下述步骤(1)、随机取家蚕951品种五龄幼虫10只，充分饥饿(不少于Mh)后待用；(2)、将步骤(1)中的蚕体浸入体积浓度75%乙醇中体表消毒后，移入无菌水中漂洗2次，无菌操作取出肠道内容物，捣碎后移入NA液体培养基中，进行富集培养；培养条件 120r/min, 28°C，18h，培养2次，将第2次富集液按10倍稀释法稀释后分别取0. 2mL涂布于 NA固体培养基上，于培养箱中培养；(3)将经步骤( 培养出的菌落用划线法分离成单个菌落，将所得的菌种进行平板接种，于培养箱中培养48h ；(4)、用接种针取纯化后的菌种点接在预先准备好的NA酪蛋白筛选培养基上，出现产酶透明圈的即为筛选所得家蚕肠道内中性蛋白酶产酶菌株。上述技术方案中所述的中性蛋白酶基因的制备方法，包括下述步骤(1)、分别设计三对引物序列，以家蚕肠道内中性蛋白酶产酶菌株基因组 DNA为模板进行扩增，得到三段中性蛋白酶基因序列，三对引物分别为PrimerZl 5 ‘-GCACGTGCTAGGGGCGTTGG-3，，PrimeZ2 :5 ‘-ACGGTCAGCCAGCCTGCTCT-3，；PrimerZ3 5 '-CATTGTGGGTTTAGGTAAGAUrimerZhS ’-CGGGCAGACTGAATGAGA-3 ’ ；PrimerZ5 5 '-TGCTGTTTTTGGCCGCTCCGT-S', PrimerZ6 5 ‘-CAGACACTCCCGCCAGCAGC-3’ ；O)、将上述扩增所得的三段中性蛋白酶基因序列进行拼接得到完整的中性蛋白酶编码区基因序列。上述技术方案中所述的原核表达载体pET28a-npr的制备方法，包括下述步骤(1)、利用引物Irimer npr-B,Primer npr_X，以权利要求6制备所得的产中性蛋白酶基因序列为模板，PCR扩增家蚕肠道内中性蛋白酶基因的ORF片段，其中I^rimer npr-B 5’-CAGGATCCATGAGTTTATCAATCAGCCT-3’，Primer npr-X 5’-GACCTCGAGTTACAATCCAACAGCAT TCC-3，所述PCR 反应条件94 °C, IOmin ；94 °C, 35s, 59 °C,40s, 72 °C, 120s, 35 个循环； 72°C, IOmin ；Q)、PCR产物经纯化后连入pEASY Tl载体，转化大肠杆菌TransTl，选取阳性克隆进行扩大培养并提取质粒；(3)、提取所得的质粒与pET-观(a+)载体均以BamHI和B10I限制性内切酶分别进行酶切后，再进行连接反应，得到原核表达载体pET28a-npr。本发明具有以下有益效果本发明筛选出的家蚕肠道内中性蛋白酶产酶菌株，其作用非常广泛，它们可产中性蛋白酶等多种酶类，具抑菌作用。
1、图1为家蚕肠道内中性蛋白酶产酶菌株NA酪蛋白培养基试验组筛选结果；2、图2为家蚕肠道内中性蛋白酶产酶菌株不含酪蛋白培养基对照组筛选结果；3、图3为枯草芽孢杆菌显微镜观察单个菌体图片；4、图4为细菌16SrDNA通用引物PCR扩增产物；5、图5为菌株951NA4号菌的16S rDNA序列N-J法系统发育树；6、图6为菌株951NA4号中性蛋白酶基因序列的N-J法系统发育树图；7、图 7 为 pET28a_npr 表达产物 SDS-PAGE 分析。
具体实施例方式为使本发明的技术方案便于理解，以下结合具体实施方式
对本发明作进一步的说明。一、材料1. 1. 1家蚕肠道样品家蚕Bombyx mori 951品种由安徽农业大学蚕学教研室提供或市场购买，由桑叶喂养至五龄蚕作为供试材料。1. 1. 2试验用培养基NA培养基；NA酪蛋白筛选培养基NA培养基添加1. 0%的酪蛋白，pH为7. 2 7. 8 ;LB培养基；高压灭菌后备用。1. 1. 3主要试剂及质粒K1201型UNIQ-10柱式细菌基因组DNA提取试剂盒，DNA分子量标记，PCR扩增试剂等购自上海生工生物工程有限公司；dNTPs、感受态细胞TranS5 α、 pEASY Tl、Transetta等购自TransGen公司；质粒抽提试剂盒和凝胶回收试剂盒AP-GX-50， 购自Axygen公司；PET-28 (a+) Vector购自Novagen公司；BamHI和XhoI限制性内切酶，T4 连接酶，PMD19-T Simple Vector等购自Takara公司，其它试剂均为国产分析纯试剂。实施例一家蚕肠道内中性蛋白酶产酶菌株的制备1、制备方法1. 1、家蚕肠道菌产蛋白酶菌株的筛选随机取家蚕951品种五龄幼虫10只，充分饥饿(不少于Mh)，将蚕体浸入体积浓度75%乙醇中体表消毒后，移入无菌水中漂洗2次， 无菌操作取出肠道内容物，捣碎后分别移入NA液体培养基中，进行富集培养，培养条件 120r/min, 28°C，18h，培养2次，将第2次富集液按10倍稀释法稀释至适当浓度后取0. 2mL 涂布于NA固体培养基上，于培养箱中培养；将培养出的单一菌落用划线分离法分离， 直至经显微镜观察为单一菌体，试管斜面保存备用；将分离纯化的菌种进行平板接种，于
培养箱中培养48h;接种针取纯化后的菌种点接在预先准备好的NA酪蛋白培养基平板上进行产酶菌种筛选。1. 2、蛋白酶活性的测定参照福林-酚法，反应底物为酪素溶液。1. 3、产酶细菌基因组DNA的提取取对数期的培养液，离心收集菌体，用柱式细菌基因组DNA提取试剂盒，提取对数生长期细菌的总DNA。1. 4、16SrDNA序列的PCR扩增及克隆测序用引物27f_1492r扩增分离菌16SrDNA 序列。PCR 反应条件为94 °C, IOmin ；94 °C, 35s, 54 °C,40s, 72 °C,90s, 35 个循环；72 °C, 10min，l%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。PCR产物经凝胶电泳分离后，利用胶回收试剂盒进行产物的回收和纯化。然后将目的基因片段与PMD-19T载体连接，转入Dffia感受态细胞中培养。筛选出阳性克隆，送上海Initrogen公司测序。1. 5、16SrDNA序列分析及数据处理利用I^rimerS. 0,DNAStar软件包设计引物和分析序列；NCBI数据库中的BLAST，ClustalW及hterproscan等工具用于序列比对和同源性分析；采用MEGA4. 0软件中的Neighbor-joining方法构建系统进化树，SignalP3. OServer 预测信号肽。2、结果2. 1、蛋白酶产酶菌株的筛选及酶活力的检测如图1和图2所示，图1中NA酪蛋白培养基试验组出现产酶透明圈，而图2中对照组培养基成分不含酪蛋白，因而无透明圈产生。从试验组中挑选形态较典型的1株菌， 编号为951NA4号，LB液体培养基富集培养后，取上清液用福林酚法测定酶活力。结果得到 951NA4号菌菌富集培养上清液酶活力值为24. 2U ^L4，和图1所示的酶解透明圈直径表示的酶解能力较为一致，同时也表明该酶分泌到菌体细胞外具有一定的稳定性。2. 2产酶菌株的鉴定2. 2. 1形态特征观察将分离纯化的产蛋白酶菌株接种于LB固体斜面培养基上培养18h，制作细菌涂片，革兰氏染色后进行显微镜镜检，图3所示的结果表明产酶菌951NA4号菌镜检为革兰氏阳性菌，显微镜下呈直杆状，两端钝圆，非对数期菌体观察时可看到孢囊中部有椭圆形的芽孢，无孢囊明显膨胀，无伴孢晶体，菌落形态特征如表1显示，651NA4号菌在NA培养基上的生长速度较快，菌落特征基本符合枯草芽孢杆菌的菌落特征。表1家蚕肠道分离菌菌落特征
一生长速度菌落特征
, , s菌落表商浅黄色，干燥s不透明，有褶皱钦突
、:_:—_________:______________二二:___________起，边缘不规_3______________________—_________________2. 2. 2产蛋白酶细菌菌株基因组DNA的提取及16SrDNA通用引物PCR扩增取培养至对数期(6h)的产蛋白酶细菌的菌体，提取基因组DNA，1%琼脂糖凝胶电泳检测两株菌16SrDNA通用引物PCR扩增产物结果如图4所示，其中图4中M代表 SM1051Marker, 1、2、3和4均代表951NA4号菌，PCR扩增得到的基因片段较为完整，片段大小约为1500bp，大小和理论值较符合。经过胶回收的16SrDNA片段克隆后送生物公司进行序列测定。2. 2. 3PCR扩增产物测序结果比对及进化树绘制951NA4号菌的16SrDNA序列大小为1521bp，在NCBI上用Blast程序比较分析，前 100个结果与芽孢杆菌属枯草芽孢杆菌有97 % -99 %的同源性，如图5所示将GenBank中与该菌株相似性较高的6个菌株构建系统进化树。其中图5中加 符号为本发明筛选出的菌株，根据序列分析及系统发育树构建结果，综合考虑菌株的形态学特征及16SrDNA序列比对结果，鉴定951NA4号菌为芽孢杆菌属枯草芽孢杆菌。实施例二、家蚕肠道内中性蛋白酶基因的制备(一)、家蚕肠道内中性蛋白酶基因片段的克隆设计3对引物分段扩增家蚕肠道内中性蛋白酶基因=PrimerZl 5 ‘-GCACGTGCTAGGGGCGTTGG-3，，PrimeZ2 5 ’-ACGGTCAGCCAGCCTGCTCT-3’ ；PrimerZ3 5 ‘-CATTGTGGGTTTAGGTAAGA-3’， PrimerZ4 5 '-CGGGCAGACTGAATGAGA-3' ；PrimerZ5 5 '-TGCTGTTTTTGGCCGCTCCGT-S', PrimerZ6 5 ‘-CAGACACTCCCGCCAGCAGC-3’，以上引物均由上海英骏生物公司合成，以家蚕肠道内中型蛋白酶产酶菌株基因组DNA为模板进行扩增，PCR反应条件94°C，5min ；94°C, 35s, 59°C, 40s，72°C，90s，35个循环；72°C，lOmin，1 %琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。胶回收及目的基因克隆过程同实施例一中的1. 4，阳性克隆菌液送上海hitrogen公司测序。(二)、产酶基因克隆测序结果分析及系统发育树绘制将该家蚕肠道内中型蛋白酶产酶菌株的三段中性蛋白酶基因克隆测序结果拼接后得到的完整中性蛋白酶基因序列， 系统发育树绘制方法同实施例一中的1. 5。将951NA4号菌株中性蛋白酶基因克隆测序结果拼接去载体后全长为2644bp，在 NCBI中比对分析表明，与枯草芽孢杆菌mobA-nprE等中性蛋白酶基因有77% -98%的同源性，对其编码区序列分析，基因序列如序列表2所示，编码的氨基酸序列如表3所示，并构建了如图6所示的系统进化树。通过对I^rimerB和ft~imerX引物扩增的基因片段进行序列分析、比对和拼接，获得了枯草芽孢杆菌中性蛋白酶基因的ORF序列。其ORF长度为1521bp， 编码506个氨基酸。通过生物软件预测蛋白的等电点和分子量大小分别为6. 895和60kD， 将此酶蛋白命名为npr。npr蛋白与其它细菌的蛋白酶基因编码的蛋白全长序列相似度介于91%和100%之间，而核酸序列的相似度在99%左右。构建的系统进化树(图6)表明， 该酶蛋白氨基酸序列与枯草芽孢杆菌mobA-nprE具有较高的同源性。图6中加 符号为本发明克隆得到的中性蛋白酶基因序列，根据序列分析及系统发育树构建结果，综合考虑该基因序列在GenBank的比对结果，鉴定该克隆所得的1份基因序列为枯草芽孢杆菌产中性蛋白酶基因序列。由图6还可看出，本研究所得到的家蚕肠道内中性蛋白酶基因序列与枯草杆菌(AF012^5. 1)mobA-nprE中性蛋白酶基因序列同源性最高。实施例三、中性蛋白酶产酶基因序列的原核表达载体(一 )、原核表达载体的构建以实施例二中的完整中性蛋白酶基因序列的基因组DNA为模板，利用引物 Primernpr-B, Primer npr_X扩增家蚕肠道内中性蛋白酶基因的ORF片段。其中Primer npr_B :5，~CAGGATCCATGAGTTTATCAATCAGCCT~3’，Primer npr-X :5，-GACCTCGAGTTACAATCCAACAGCATTCC-3，(下划线部分分别为 BamHI 和 XhoI 酶切位点)，PCR 反应条件94°C, IOmin ；94°C, 35s, 59 °C,40s, 72°C, 120s, 35个循环；72°C，lOmin。PCR产物经纯化后连入pEASY Tl载体，转化大肠杆菌TransTl。 选取阳性克隆进行扩大培养并提取质粒，后与pET48(a+)载体均以BamHI和B10I限制性内切酶分别进行酶切反应后连接，得到重组表达质粒pET28a-npr，转化大肠杆菌 Transetta (DE3)，提取质粒，经PCR和酶切鉴定表明目的基因表达载体pET28a-npr构建成功，再通过对连有目的基因片段的重组质粒进行测序表面读码框正确无误。
(二)、重组蛋白的表达与鉴定将重组表达质粒pET28a-npr转化宿主菌"Transetta (DE!3)，涂布含卡那霉素的选择性LB平板进行筛选。对转化子进行菌液PCR检测，得到的阳性克隆菌液接入LB液体培养基37°C摇床培养池左右，分别加入不同浓度的IPTG诱导重组蛋自的表达，诱导4h后离心收集菌体。菌体经PBS悬浮后，用超声波进行破碎(300W，20min，超声3s，间隔k)，提取大肠杆菌总蛋白进行SDS-PAGE电泳分析。结果如图7所示(图7中1 =Transetta(DE3)菌体蛋白；2 未经IPTG诱导的蛋白样品；3-8 IPTG诱导浓度分别是0. 2mM, 0. 4mM,0. 6mM,0. 8mM, 1. OmM和1. 2mM时的重组蛋白的表达；M 蛋白分子量标准)插入有外源片段的重组质粒pET28a-npr经IPTG诱导后，在预期蛋白分子量60kD左右位置有1条明显蛋白条带，而未诱导的转化重组质粒和空载体转化子均未出现相应的蛋白条带。表明重组质粒pET28a-npr在"Transetta^E； )中可诱导表达枯草杆菌中性蛋白酶蛋白。通过调整IPTG终浓度(0.2、0.4、0.6、0.8、L0、L2mmol · L-1) 还发现，预期分子量60kD左右的蛋白浓度几乎无变化，表明IPTG诱导浓度不同，对目标蛋白的表达量无明显影响，但在无IPTG诱导时，目的蛋白未见表达。将阳性转化子菌液及其对照菌再次富集培养后在不同浓度IPTG诱导下25°C摇床 150rpm发酵培养，福林-酚法测表达得到的酶蛋白活力。各种处理的菌发酵液相应的蛋白酶活力值如表2，结果表明本试验研究克隆得到的枯草杆菌中性蛋白酶基因在原核表达系统中成功诱导表达出有一定酶活的目的蛋白产物。同时由表2还可发现，0. 2mM/L浓度的 IPTG诱导表达的单一中性蛋白酶酶活力值与2. 1中野生型的枯草芽孢杆菌产蛋白酶(包括所有蛋白酶组分)活力值已经接近，可见本研究所构建的表达系统具有高效的表达效率。表2产酶活力测定结果
权利要求
1.一种家蚕肠道内中性蛋白酶产酶菌株，其特征在于所述家蚕肠道内中性蛋白酶产酶菌株的16Sr DNA如序列表1所示。
2.权利要求1所述的菌株中的中性蛋白酶基因，其特征在于所述中性蛋白酶基因序列如序列表2所示。
3.包含权利要求2所述的中性蛋白酶基因的原核表达载体pET28a-npr。
4.权利要求1所述的家蚕肠道内中性蛋白酶产酶菌株的制备方法，包括下述步骤(1)、随机取家蚕“951”品种品种五龄幼虫10只，充分饥饿(不少于Mh)后待用；O)、将步骤(1)中的蚕体浸入体积浓度75%乙醇中体表消毒后，移入无菌水中漂洗2次，无菌操作取出肠道内容物，捣碎后移入NA液体培养基中，进行富集培养；培养条件 120r/min, 28°C，18h，培养2次，将第2次富集液按10倍稀释法稀释后分别取0. 2mL涂布于 NA固体平板培养基上，于培养箱中培养；(3)将经步骤( 培养出的菌落用划线分离法分离，经显微镜镜检为单一菌体，将所得的菌种进行平板接种，于培养箱中培养48h ；(4)、用接种针取纯化后的菌种点接在预先准备好的NA酪蛋白筛选培养基上，出现产酶透明圈的即为筛选所得家蚕肠道内中性蛋白酶菌株。
5.权利要求2所述的中性蛋白酶基因序列的制备方法，包括下述步骤(1 )、分别设计三对引物序列，以家蚕肠道内中性蛋白酶产酶菌株基因组 DNA为模板进行扩增，得到三段中性蛋白酶基因序列，引物分别为JrimerZl 5 '-GCACGTGCTAGGGGCGTTGGS-', PrimeZ2 5 ‘-ACGGTCAGCCAGCCTGCTCT-3‘ ；PrimerZ3 5 '-CATTGTGGGTTTAGGTAAGAUrimerZhS ‘-CGGGCAGACTGAATGAGA-3‘ ；PrimerZ5 5 ‘-TGCTGTTTTTGGCCGCTCCGT-3，，PrimerZ6 :5 ‘-CAGACACTCCCGCCAGCAGC-3 ‘；O)、将上述扩增所得的三段中性蛋白酶基因序列进行拼接得到完整的中性蛋白酶基因序列。
6.权利要求3所述的原核表达载体pET28a-npr的制备方法，包括下述步骤(1)、利用引物I^rimernpr_B、Primer npr_X，以权利要求4制备所得的中性蛋白酶产酶菌株基因组DNA为模板，PCR扩增家蚕肠道内中性蛋白酶基因的ORF片段，其中ft~imer npr-B :5’ -CAGGATCCATGAGTTTATCAATCAGCCT-3’，Primer npr-X 5' -GACCTCGAGTTACAATCCAACAGCATTCC-3’ ；所述 PCR 反应条件94°C, IOmin ；94°C，35s，59 °C，40s，72 °C，120s，35 个循环；72 °C, IOmin ；(2)、PCR产物经纯化后连入pEASYTl载体，转化大肠杆菌TransTl，选取阳性克隆进行扩大培养并提取质粒；(3)、将pET48(a+)与提取所得的质粒均以BamHI和B10I限制性内切酶进行双酶切， 将目的酶蛋白基因与pET-观(a+)载体进行连接反应，得到原核表达载体pET28a-npr。
全文摘要
本发明家蚕肠道内中性蛋白酶产酶菌株、其中性蛋白酶基因和原核表达载体及制备方法，属于基因工程技术领域。所述家蚕肠道内中性蛋白酶产酶菌株是对家蚕肠道内菌体进行富集培养，用NA酪蛋白筛选培养基进行筛选获得的。同时通过基因工程技术对菌株的DNA进行扩增、筛选得到中性蛋白酶基因，将该中性蛋白酶基因连接入pET-28(a+)构建了原核表达载体pET28a-npr。本发明筛选出的家蚕肠道内中性蛋白酶产酶菌株及其所产蛋白酶，属于动物饲料级微生物与酶制剂，具有较强的应用前景。
文档编号C12N1/02GK102533598SQ20111044021
公开日2012年7月4日 申请日期2011年12月19日 优先权日2011年12月19日
发明者刘朝良, 刘金阳, 朱保建, 李大辉, 杨文静, 王在贵, 魏国清 申请人:安徽农业大学