专利名称：猪flj小干扰rna表达载体的构建、鉴定法及用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种猪FLJ基因小干扰RNA(SiRNA)有效表达载体的构建、鉴定及用途，属于生物和现代农业技术领域的应用技术。
背景技术：
FLJ基因是本课题组通过基因芯片技术筛选获得的与猪肌内脂肪沉积密切相关的新基因。人类FLJ是2003年测序筛选出来的新基因，功能尚未确定。本本课题组根据猪FLJ 基因已知的EST序列，通过RACE技术，克隆得到FLJ全长cDNA序列，FLJ基因全长cDNA序列有2793bp(GenBank登录号EU030283)，其中包括 3bp 5'非编码区(5‘ -untranslated region, 5 ‘ -UTRs)、714bp 编码区(coding region, CDs)和 1796bp 的 3 ‘非编码区 (3' -UTR)，编码区翻译237个氨基酸(GenBank登录号ABS29571) ；BLAST结果表明，FLJ氨基酸序列序列与人、鼠同源性分别达到99%，84%。这为后续研究FLJ基因的功能奠定分子生物学基础。RNA干扰(RNAi)技术作为一种新的基因阻断技术，具有低成本、高效性及高特异性等特点，能特异、高效地抑制特定基因的表达，已经成为研究基因功能的一种有力工具。 由于干扰载体pSilencer 4. I-CMV neo可以方便用于目的基因siRNA表达载体的构建，从而可以特异性的使特定目的基因沉默，功能丧失，因此干扰载体pSilencer 4. I-CMV neo可以作为一种强有力的研究工具，用于功能基因组的研究。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种猪FLJ有效小干扰RNA表达载体，以及该小干扰RNA表达载体的用途。为了解决上述技术问题，本发明提供一种猪FLJ有效小干扰RNA表达载体的构建方法，包括以下步骤1)、根据载体的信息和靶序列设计(并合成)3对含9个核苷酸的loop环的siRNA 引物，该9个核苷酸为TTCAAGAGA ；2) ,RNAi表达载体的构建siRNA引物退火后与双酶切的RNAi载体连接转化，得到 RNAi表达载体的重组质粒。作为本发明的猪FLJ小干扰RNA表达载体的构建方法的改进，步骤1)为根据步 FLJ全长基因序列，筛选并设计3对siRNA引物；该3对siRNA引物分别为引物1 SENSE 5 ‘ -GATCC CTGTCGCTGGCCGACAGCA TTCAAGAGA TGCTGTCGGCCAGCGACAGTT A-3'ANTISENSE 5 ‘ -AGCTT AACTGTCGCTGGCCGACAGCA TCTCTTGAA TGCTGTCGGCCAGCGACAG G-3‘引物2:
SENSE 5 ‘ -GATCC GCTGTTCATGCCCCGCAGC TTCAAGAGA GCTGCGGGGCATGAACAGCTT A-3'ANTISENSE 5 ‘ -AGCTT AAGCTGTTCATGCCCCGCAGC TCTCTTGAA GCTGCGGGGCATGAACAGC G-3‘引物3:SENSE 5 ‘ -GATCC GGACGTCTACGGCTACTCC TTCAAGAGA GGAGTAGCCGTAGACGTCCTT A-3'ANTISENSE 5 ‘ -AGCTT AAGGACGTCTACGGCTACTCC TCTCTTGAA GGAGTAGCCGTAGACGTCC G-3‘作为本发明的猪FLJ小干扰RNA表达载体的构建方法的进一步改进，步骤2)为 将pSilencer 4. 1-CMV neo质粒进行BamH I和Hind III双酶切后，与siRNA引物退火后得到的DNA片段连接，采用热激转化大肠杆菌。本发明还同时提供了对利用上述方法构建所得的猪FLJ有效小干扰RNA表达载体进行鉴定的方法通过抗生素筛选，将阳性克隆采用测序鉴定；测序引物为CMV-F 5' -AGGCGATTAAGTTGGGTA-3‘。本发明还同时提供了利用上述方法构建所得的猪FLJ小干扰RNA表达载体的用途用于研究FLJ基因对猪肌内脂肪沉积的影响。作为本发明的猪FLJ小干扰RNA表达载体的用途的改进，包括以下步骤(1)将含FLJ的siRNA表达载体的大肠杆菌扩培后，提取高纯转染级质粒；(2)将含FLJ的siRNA表达载体的高纯转染级质粒转染猪肌内脂肪细胞，37°C,5% 的(X)2中保温4 他后更换不含抗生素的培养基；(3)转染4 后，分析siRNA表达载体对FLJ及脂肪代谢关键功能基因FAS、ATGL、 HSL表达的影响，研究FLJ基因的功能。本发明的猪FLJ小干扰RNA表达载体的构建方法及其用途，具有以下有益效果本发明根据FLJ基因全长cDNA序列，然后根据pSilencer 4. I-CMV neo载体信息和靶序列设计并合成3对siRNA引物，siRNA引物经退火后与双酶切的pSilencer 4. I-CMV neo载体连接转化大肠杆菌DH5 α，构建得到RNAi表达载体的重组质粒，经筛选和条件优化后，构建好的RNAi表达载体对FLJ基因具有较好的干扰效果。本发明是利用RNAi技术， 开拓了目前研究猪脂肪代谢调控和基因功能研究的新思路。此法所用的RNAi表达载体 pSilencer4. I-CMV neo vector方便易得，载体构建方法简单、可行，同时构建的RNAi表达载体能够特异、高效地抑制FLJ基因的表达，是研究FLJ基因功能的一种强有力的研究技术，为开展FLJ基因在猪肌内脂肪沉积和肌肉发育中的功能研究具有重要的意义。
下面结合附图对本发明的具体实施方式
作进一步详细说明。图1是siRNA引物退火后电泳检测图；图2是各干扰载体的测序比对图(A :fsl测序比对图；B :fs2测序比对图；C :fs3 测序比对图)；图3是各干扰载体对FLJ mRNA表达的影响图(*表示P < 0. 05)；
A图为FLJ基因荧光定量溶解曲线；B图为不同干扰载体对FLJ m RNA表达的影响(wt 对照组；ns 阴性对照组；fsl、 fs2和fs3 转染FLJ-siRNA实验组)；图4是有效干扰载体fsl对脂肪代谢相关基因表达影响图(*表示P < 0. 05)；A图为FAS、ACC、ATGL和HSL基因荧光定量溶解曲线；B图为fsl对脂肪代谢相关基因表达影响(wt 对照组；ns 阴性对照组；fsl 转染 FLJ有效干扰载体组)；图5是CLA和有效干扰载体fsl对脂肪合成代谢关键功能基因FAS表达的影响图 (A 对照组；B :fsl干扰组；C =CLA处理组；D =CLA和fsl共同处理组；柱状图上标相同字母表示差异不显著，不同字母表示差异显著P < 0. 05)。
具体实施例方式实施例1、猪FLJ的SiRNA表达载体的构建与鉴定，依次进行以下步骤1、靶序列选择根据猪FLJ全长基因序列，遵循Tuschl规则和Cenix规则设计并筛选FLJ的siRNA靶序列(括号内表示位于FLJ基因核苷酸序列位置)FSl target sequence :5，-AACTGTCGCTGGCCGACAGCA-3，(第 137_157bp)FS2 target sequence :5，-AAGCTGTTCATGCCCCGCAGC-3，(第 181_201bp)FS3 target sequence :5，-AAGGACGTCTACGGCTACTCC-3，(第 286_306bp)选择9个核苷酸的loop环“TTCAAGAGA”，根据载体的信息和靶序列设计并合成 siRNA引物。合成引物的结构顺序为
5'- β·///酶切位点接头 +正义链+TTCAAGAGA +反义链+ ///W///酶切位点接头 -3'所得的3对shRNA弓丨物分别为fsl SENSE :5 ' -GATCC CTGTCGCTGGCCGACAGCA TTCAAGAGA TGCTGTCGGCCAGCGACAGTT A-3'ANTISENSE 5 ' -AGCTT AACTGTCGCTGGCCGACAGCA TCTCTTGAA TGCTGTCGGCCAGCGACAG G-3'fs2 SENSE :5 ' -GATCC GCTGTTCATGCCCCGCAGC TTCAAGAGA GCTGCGGGGCATGAACAGCTT A-3'ANTISENSE :5 ' -AGCTT AAGCTGTTCATGCCCCGCAGC TCTCTTGAA GCTGCGGGGCATGAACAGC G-3'fs3 SENSE :5 ' -GATCC GGACGTCTACGGCTACTCC TTCAAGAGA GGAGTAGCCGTAGACGTCCTT A-3'ANTISENSE :5 ' -AGCTT AAGGACGTCTACGGCTACTCC TCTCTTGAA GGAGTAGCCGTAGACGTCC G-3'
2、引物退火将上述3对引物分别进行如下操作将合成好的引物稀释至lOOpmol/yL，取正反义链引物各4yL、10X退火缓冲液 4μ L和无酶水^yL,进行退火，退火条件为100°C水浴20min，自然冷却至室温。然后琼脂糖凝胶电泳检测退火反应结果。引物退火结果如下(如图1所示)从而表明退火成功。3、将含有pSilencer 4. I-CMV质粒的大肠杆菌接种到LB培养基中，37°C，200rpm 摇床培养过夜，然后利用小批量提取上述质粒，再将质粒进行BamH I和Hind III双酶切， 反应条件为37°C水浴16h或4°C酶切过夜，然后琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果，当双酶切后的载体经琼脂糖凝胶电泳后，条带大小相对为酶切质粒变小，即酶切成功。即可割胶回收线性化的载体。4、插入片段(步骤2所得的退火产物)和载体片段(步骤3双酶切后的载体)用 T4DNA连接酶4°C连接过夜，连接产物转化DH5 α感受态细胞，37°C培养过夜；得到RNAi表达载体的重组质粒。5、将步骤4)所得的RNAi表达载体的重组质粒经IPTG和X_gal抗性初步筛选后， 挑取白色单菌落接种于3ml液体LB培养基中(含Amp lOOng/ml)，37°C振荡培养12h，进行克隆测序鉴定。阳性克隆测序及序列比对鉴定结果表明(如图2所示)，与插入的序列完全一致， 证明FLJ基因的siRNA表达质粒构建成功，即，获得猪FLJ的重组干扰载体。这为进一步研究FLJ基因的功能及调控脂肪代谢的作用途径打下基础，也为通过 RNAi技术研究动物脂肪沉积奠定基础。实施例2、有效siRNA筛选1、利用Lipofectamine 2000介导将第实施例1构建筛选得到的猪FLJ的重组干扰载体及无关序列(阴性对照)和空白对照分别转染猪肌内脂肪细胞。转染前一天，胰酶消化细胞并计数，细胞铺板，使其在转染日密度为80% 90%，DMEM细胞培养基中含10%胎牛血清，不含抗生素；对于每孔细胞，使用50 μ 1无血清培养基(0ΡΤΙ-ΜΕΜ I培养基)稀释 4 μ gDNA ；对于每孔细胞，使用 50 μ 1 OPTI-MEM I 培养基稀释 10 μ 1 Lipofectamine 2000 试剂。Lipofectamine 2000稀释后，在30min内同稀释的DNA混合(保温时间过长会降低活性)；混合稀释的DNA和稀释的Lipofectamine 2000,在室温保温20min (复合物可以在室温保持他稳定)；直接将复合物加入到每孔中，摇动培养板，轻轻混勻，每处理重复 6次。如果在无血清条件下转染，使用含血清的正常生长培养基进行细胞铺板，在加入复合物前移去生长培养基，替换无血清培养基；在37°C，5%的C02中保温4 他后更换不含抗生素的完全培养基；在细胞中加入复合物4 后，分析检测干扰效果。2、干扰效果检测转染48h后，用Trizol Reagent提取细胞中总RNA，采用 Real-time定量PCR方法检测猪FLJ基因表达水平。结果为FLJ 干扰载体(FLJ-siRNA)筛选转染 FLJ-siRNA (fsl，fs2，fs3) 48h 后，荧光定量 PCR检测结果显示，与对照相比，阴性对照组FLJ基因的表达没有明显的变化；fsl转染组、 fs2转染组和fs3转染组的FLJ基因mRNA水平分别降低71. 76% (P < 0. 01) ,53. 82% (P < 0. 01)和65. 07% (P < 0. 01)；其中，fsl抑制效果最好。
本发明筛选出了能够有效干扰猪FLJ基因表达的SiRNA干扰载体，这将为进一步探讨猪FLJ基因在猪脂肪代谢和脂肪沉积中的功能奠定实验基础。实施例3、FLJ-siRNA (fsi)对脂肪代谢关键功能基因表达的影响选取实施例2筛选得到抑制效果最好的fsl的SiRNA表达载体，按照实施例2的反应体系，检测其对目的基因表达的抑制作用。将猪肌内脂肪细胞传代培养4 后，使其在转染日密度达80-90% (体积密度)进行处理。实验分成三个组对照组(wt)，转染空载体，FLJ-siRNA组(neg)，转染有效重组干扰载体fsl (fsl)，每个处理6个重复。Real-time 定量PCR检测脂肪代谢关键功能基因FAS、ACC、ATGL和HSL的mRNA表达情况。结果如下转染fsl干扰FLJ基因表达后，显著降低了脂肪合成关键基因FAS、 ACC基因的表达，但同时也显著降低了脂肪分解关键基因ATGL、HSL基因的表达，提示，抑制 FLJ基因表达后，能显著降低脂肪代谢的速率，因此不仅降低了脂肪合成代谢关键功能基因表达，同时也降低了脂肪分解代谢关键功能基因表达。推测FLJ基因可能是调控脂肪酸转运至细胞进行本地脂肪沉积的关键基因，其表达水平的高低能显著影响整体脂肪代谢的速率。如图4(A)。实施例4、FLJ功能及其对脂肪代谢的影响将普通的猪肌内脂肪细胞传代培养24h后，使其在转染日密度达80-90%进行处理。试验分成4个处理组对照组(A)；转染空载体(B) ；CLA处理组即DMEM/F12培养基 +20ug/L CLA(C) ；fsl干扰组(D)，每个处理6个重复。转染4 后收集脂肪细胞，检测对FLJ 基因mRNA水平的影响，并进一步探讨对脂肪代谢关键功能基因ATGL和HSL基因mRNA表达的影响。备注说明FLJ-siRNA组(D)，同实施例3中的转染有效重组干扰载体fsl (fsl)而得。结果如下CLA处理与FLJ-siRNA有效干扰载体转染共同作用对FLJ基因表达的影响结果表明，添加CLA能显著升高脂肪合成关键基因FAS，这与前人研究结果相一致。而CLA与干扰FLJ基因表达共同作用结果表明，干扰FLJ基因能显著抑制CLA对脂肪关键功能基因FAS 表达的增加作用，降低了脂肪细胞中的脂滴沉积。提示，FLJ基因在外源CLA转运至细胞进行本地脂滴合成过程中发挥着重要的正调控作用。最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
权利要求
1.猪FLJ有效小干扰RNA表达载体的构建方法，其特征是包括以下步骤1)、根据载体的信息和靶序列设计3对含9个核苷酸的loop环的siRNA引物，所述9 个核苷酸为TTCAAGAGA ；2)、RNAi表达载体的构建siRNA引物退火后与双酶切的RNAi载体连接转化，得到 RNAi表达载体的重组质粒。
2.根据权利要求1所述的猪FLJ有效小干扰RNA表达载体的构建方法，其特征是所述步骤1)为根据猪FLJ全长序列，筛选并设计3对siRNA引物；所述3对siRNA引物分别为引物1:SENSE 5‘ -GATCCCTGTCGCTGGCCGACAGCATTCAAGAGATGCTGTCGGCCAGCGACAGTTA-3‘ANTISENSE 5 ‘ -AGCTTAACTGTCGCTGGCCGACAGCATCTCTTGAATGCTGTCGGCCAGCGACAG G-3'；引物2 SENSE 5‘ -GATCCGCTGTTCATGCCCCGCAGCTTCAAGAGAGCTGCGGGGCATGAACAGCTTA-3‘ANTISENSE 5 ‘ -AGCTTAAGCTGTTCATGCCCCGCAGCTCTCTTGAAGCTGCGGGGCATGAACAGC G-3'；引物3 SENSE 5‘ -GATCCGGACGTCTACGGCTACTCCTTCAAGAGAGGAGTAGCCGTAGACGTCCTTA-3‘ANTISENSE 5 ‘ -AGCTTAAGGACGTCTACGGCTACTCCTCTCTTGAAGGAGTAGCCGTAGACGTCCG-3'
3.根据权利要求2所述的猪FLJ有效小干扰RNA表达载体的构建方法，其特征是所述步骤2)为将pSilencer4. I-CMV neo质粒进行BamHI和HindIII双酶切后，与siRNA引物退火后得到的DNA片段连接，采用热激转化大肠杆菌。
4.对如权利要求1 3任一方法构建所得的猪FLJ有效小干扰RNA表达载体进行鉴定的方法，其特征是通过抗生素筛选，将阳性克隆采用测序鉴定；测序引物为CMV-F 5' -AGGCGATTAAGTTGGGTA-3‘。
5.如权利要求1 3任一方法构建所得的猪FLJ有效小干扰RNA表达载体的用途，其特征是用于研究FLJ基因对猪肌内脂肪沉积的影响。
6.根据权利要求5所述的猪FLJ小干扰RNA表达载体的用途，其特征是包括以下步骤1)、将含FLJ的siRNA表达载体的大肠杆菌扩培后，提取高纯转染级质粒；2)、将含FLJ的siRNA表达载体的高纯转染级质粒转染猪肌内脂肪细胞或其他哺乳动物细胞，37°C，5%的C02中保温4 他后更换不含抗生素的培养基；3)、转染4 后，分析siRNA表达载体对FLJ及脂肪代谢关键功能基因FAS、ACC、ATGL、 HSL基因表达的影响，从而研究FLJ基因的功能。
全文摘要
本发明公开了一种猪FLJ有效小干扰RNA表达载体的构建方法，包括以下步骤1)、根据载体的信息和靶序列设计3对含9个核苷酸的loop环的siRNA引物，9个核苷酸为TTCAAGAGA；2)、RNAi表达载体的构建siRNA引物退火后与双酶切的RNAi载体连接转化，得到RNAi表达载体的重组质粒。本发明还同时提供了对利用上述方法构建所得的猪FLJ有效小干扰RNA表达载体进行鉴定的方法。本发明还同时提供了利用上述方法构建所得的猪FLJ有效小干扰RNA表达载体的用途用于研究FLJ基因对猪肌内脂肪沉积的影响。
文档编号C12N15/85GK102517328SQ20111044012
公开日2012年6月27日 申请日期2011年12月25日 优先权日2011年12月25日
发明者伍婷, 汪以真, 袁章琴 申请人:浙江大学