专利名称：农用抗生素多氧霉素p及其生物合成方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种农用抗生素多氧霉素P及其生物合成方法与应用。
背景技术：
多氧霉素是由可可链霉菌(Sti^ptomyces cacaoi)产生的核苷肽类抗生素，由核苷和肽基两部分通过肽键缩合而成(
图1)。由于它在结构上与几丁质合成酶的天然底物 UDP-N-乙酰葡萄糖胺类似，因此能够竞争性地抑制几丁质的合成，从而抑制真菌、昆虫等的生长。多氧霉素已经作为ー种重要的农用抗真菌抗生素进行了大规模的应用，用于防治稻瘟病、梨黒斑病、苹果斑点落叶病和白粉病、烟草赤星病、蔬菜白粉病、菌核病等真菌性植物 ラ丙ゼ。尼可霉素(Nikkomycin)是由圈卷产色链霉菌(Streptomyces ansochromogenes 7100)产生的ー种核苷肽类抗真菌抗生素，结构与多氧霉素非常类似(图1)。在尼可霉素生物合成途径中，SanN催化肽基部分的前体吡啶酰CoA形成吡啶醛。在sanN基因阻断突变株(AsanN)中，由于肽基部分合成的阻断而丧失了产生尼可霉素的能力，但是核苷部分的合成不受影响。且在多氧霉素生物合成基因簇中，并不存在sanN的同源基因，不会由于同源基因的互补导致尼可霉素的恢复产生，从而降低了分离纯化的难度。多氧霉素的核苷部分为5-氨基己糖醛酸以N-糖苷键连接尿嘧啶，在尿嘧啶C-5 位经常有甲基、羧基、羟甲基等修饰。而其肽基部分N端氨基酸为CP0AA，C端氨基酸为Ρ0ΙΑ， 它们分別以肽键与核苷部分相连，形成多种多氧霉素组分(多氧霉素A-M)。这些多氧霉素组分均易溶于水，难溶于甲醇、乙醇、丁醇、丙酮、氯仿、苯、乙醚等常见有机溶剤。不同结构的多氧霉素对不同真菌的抑制作用存在差异。因此，为了扩大多氧霉素的抑菌谱范围，合成新的多氧霉素组分是必要的。
发明内容
本发明的ー个目的是提供ー种化合物。本发明提供的化合物，其结构式为如下式1
权利要求
1. ー种化合物，其结构式为如下式1
2.ー种制备权利要求1所述化合物的方法，包括如下步骤发酵圈卷产色链霉菌(Sti^ptomyces ansochromogenes) 7100 Δ sanN/pol，收集发酵产物，即得到权利要求1所述化合物；所述圈卷产色链霉菌(Sti^ptomyces ansochromogenes) 7100 Δ sanN/pol 为将质粒 pPOL导入圈卷产色链霉菌sanN阻断突变株Δ sanN中得到的重组菌。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在干所述圈卷产色链霉菌(Sti^ptomyces ansochromogenes) 7100 Δ sanN/pol 的保藏号为 CGMCC No. 5520 ；所述发酵的温度为观で，所述发酵时间为4天-6天；所述发酵为震荡培养，所述震荡培养的转速为220rpm，所述震荡培养的旋转半径为30mm。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于在所述收集发酵产物的步骤后，还包括如下步骤1)将所述发酵产物离心取上清液、过滤，收集滤液；2)将步骤1)得到的滤液经乙酸乙酯萃取，收集水相，浓縮，得到浓缩液；3)将步骤幻得到的浓缩液经吸附树脂纯化，收集流穿液；4)将步骤幻得到的流穿液经阳离子交換树脂纯化，收集洗脱液；5)将步骤4)得到的洗脱液经无水乙醇沉淀、离心、沉淀溶解、过滤，收集滤液1；6)将步骤幻得到的滤液1经HPLC纯化，收集洗脱液，得到权利要求1所述的化合物。
5.根据权利要求2-4中任一所述的方法，其特征在于步骤1)中，所述离心的时间为5min-10min，所述离心的离心カ为4000g_8000g ；所述过滤采用孔径为3mm滤纸；步骤幻中，所述乙酸乙酯和所述滤液的体积比为1 3，萃取3次；所述浓缩为旋转蒸发浓缩；步骤幻中，所述吸附树脂纯化为将所述浓缩液经大孔吸附树脂HP20分离，收集流穿液；所述分离的流速为15ml/min ；步骤4)中，所述阳离子交換树脂纯化为将所述流穿液经强酸性阳离子交換树脂Dowex 50WX 2分离，用0. 4M氨水洗脱，所述洗脱流速为8ml/min-10ml/min ；步骤5)中，所述沉淀的温度为4°C，所述沉淀的时间为12h，所述离心的温度为4°C，所述离心的离心カ为8000g-13000g，所述离心的时间为20min ；所述溶解采用的溶剂为水，所述过滤采用2.2μπι微孔滤膜；步骤6)中，所述HPLC纯化为将所述滤液1经HPLC分离，用体积比为90 10的三氟乙酸水溶液和甲醇组成的混合物进行洗脱，收集洗脱液为收集15. Omin-15. 5min的洗脱液； 所述洗脱的流速0. 3ml/min，所述三氟乙酸溶液为体积浓度为1%。的三氟乙酸水溶液。
6.根据权利要求2-5中任一所述的方法，其特征在于步骤1)中，在所述过滤前，还包括将所述上清液调PH值至4. 5后静置12h的步骤；在所述步骤3)和步骤4)间，还包括将所述流穿液调pH至4. 5的步骤；在步骤4)和步骤5)之间，还包括将所述洗脱液调解pH值至4.5的步骤。
7.一种重组菌，为将质粒pPOL导入圈卷产色链霉菌sanN阻断突变株AsanN中得到的重组菌。
8.圈卷产色链霉菌(Sti^ptomycesansochromogenes) 7100 Δ sanN/pol，其保藏号为 CGMCC No. 5520。
9.一种抑菌剂，其活性成分为权利要求1所述的化合物或权利要求2-6中任一所述的方法中的所述圈卷产色链霉菌(Str印tomyces ansochromogenes) 7100 Δ sanN/pol发酵产物或权利要求7所述的重组菌或权利要求8所述的圈卷产色链霉菌(Streptomyces ansochromogenes)7100 Δ sanN/pol CGMCC No. 5520 ；所述菌具体为长柄链格孢 OUternaria longipes)。
10.权利要求1所述的化合物或权利要求2-6中任一所述的方法中的所述圈卷产色链霉菌(Streptomyces ansochromogenes) 7100 Δ sanN/pol发酵产物或权利要求7所述的重组菌或权利要求8所述的圈卷产色链霉菌(Str印tomyces ansochromogenes) 7100 Δ sanN/ pol CGMCC No. 5520在抑菌和/或制备抑菌剂中的应用；所述菌具体为长柄链格孢 OUternaria longipes)。
全文摘要
本发明公开了一种农用抗生素多氧霉素P及其生物合成方法与应用。本发明提供了的化合物，其结构式为如下式1本发明还提供了一种制备上述化合物的方法，包括如下步骤发酵重组菌7100ΔsanN/pol，收集发酵产物，即得到上述化合物；上述重组菌7100ΔsanN/pol为将pPOL导入圈卷产色链霉菌sanN阻断突变株中得到的重组菌。本发明的实验证明，本发明提供了一种新的化合物——多氧霉素P，其为发酵重组菌7100ΔsanN/pol制备得到的发酵产物，该化合物具有抑制真菌生长的活性。
文档编号C12R1/465GK102532277SQ20111044111
公开日2012年7月4日 申请日期2011年12月26日 优先权日2011年12月26日
发明者李磊, 李金娥, 谭华荣 申请人:中国科学院微生物研究所