专利名称：犬星状病毒的半套式rt-pcr检测方法
技术领域：
本发明涉及生物技术，具体涉及一种犬星状病毒的半套式RT-PCR检测方法。
背景技术：
星状病毒是无囊膜的单股正链RNA病毒，呈五角或六角的星形，属于星状病毒科。星状病毒于1975年首次由Madeley和Cosgrove等用电镜检测胃肠炎患儿粪便中发现。犬星状病毒最早是在1980年时Willians用电镜观察腹泻犬粪便时发现的。星状病毒可引起人类、犬、猫、水豹等多种动物呕吐、腹泻、发热等症状，特别是婴幼儿、幼龄动物、老人以及免疫功能低下者。目前，世界各地均已有星状病毒感染的报道，在志愿者和自然感染者的研究中均已证实星状病毒感染与腹泻密切相关。星状病毒早期检测是以电镜观察和酶联免疫技术为基础，近年来随着分子生物学技术的应用，RT-PCR方法成为检测星状病毒的重要手段，但它们在特异性、敏感性等方面都存在一定的局限性。为此，本研究根据套式RT-PCR原理，建立了一种快速、准确、特异的犬星状病毒检测方法，为临床症状中的星状病毒的快速诊断及其隐性感染的诊断提供基础。
发明内容
本发明的目的，在于克服现有技术的不足之处，提供一种犬星状病毒的半套式RT-PCR检测方法。本发明的技术方案是一种犬星状病毒的半套式RT-PCR检测方法是，将检测样品进行预处理后，提取总RNA ；将总RNA逆转录到cDNA ；通过半套式RT-PCR反应获得扩增产物；取扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定；若检测样品在预定分子量大小的位置出现特异性扩增条带，则判定为阳性，否则为阴性。所述的半套式RT-PCR反应的引物设计如下外套引物上游引物P1 L5 ‘ -CAANTCACAACCCAAAACAAA-3 ‘；下游引物P2 L5' -CATTCACTTGGTCAAACACAGTC-3 ‘；内套引物上游引物 Pl L5' -CAANTCACAACCCAAAACAAA-3 ‘；下游引物P3 R5' -TTTTNACNATCACTGCTAGNGA-3 ‘。上述犬星状病毒的半套式RT-PCR检测方法具体包括以下步骤A、样品总RNA的提取将样品悬浮于PBS溶液中，取200ul样品悬液上清先通过一个孔径为0. 45ul的过滤器进行过滤以除去真核、细菌大小的粒子，然后向样品悬液上清中加入ImL Trizol,室温静置lOmin，使核蛋白复合物完全变性；再加入200ul氯仿，剧烈震荡15s，在室温静置lOmin，后于4°C 12000rpm离心lOmin，取上清0. 75mL转移到EP管中，加入0. 75mL异丙醇，室温静置5-lOmin，后于4°C 12000rpm离心lOmin，移去上清，加入ImL 75%酒精清洗沉淀，后于4°C 7500rpm离心5min，弃去酒精，得到含有样品的总RNA的沉淀，将含有样品的总RNA的沉淀于室温干燥3-5min，加入30ul DEPC水；
B、cDNA 的合成采用试剂盒将总RNA逆转录到cDNA 提取的总RNA 5ul、Anchored Oligo (dT) 18lul、2XReaction BufferIOul> TransScript RT Enzyme Mix Iul 禾口 RNase-free Water3ul混勻，42°C孵育30min，85°C加热5min失活反转录酶，得到cDNA，置于_20°C备用；C、PCR 扩增外套PCR扩增以1. Oul cDNA为模板，引物使用PU P2，先95°C预变性5min ；紧接着 94°C 40s、54°C 30s,72°C 40s，循环 30 次；再 72°C延伸 10min，4°C保存；内套 PCR 扩增以1. Oul外套PCR反应产物为模板，引物使用PU P3，先95°C预变性5min ；紧接着94°C 40s、56°C 30s,72°C 40s，循环30次；再72°C延伸lOmin，得到PCR扩增产物，4°C保存。D、电泳鉴定取5ulPCR扩增产物，用1 %琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察扩增结果，与2000bp标准分子量对照，如在480bp处出现特异性扩增条带，则判定检测结果为阳性，否则为阴性。步骤C中所述的外套PCR扩增和内套PCR扩增所用的试剂均为5ul 10 X buffer、5. Oul IOmM dNTP、3. Oul 25mmol/LMgCl2、0. 5ul 5U/ulTaq 酶、1. 2ul lOumol/L 上游引物、1. 2ul lOumol/L下游引物和33. Iul灭菌双蒸水。本发明与传统方法相比，本发明的积极效果在于检测周期大大缩短，特异性和灵敏度得到了很大提高，可检测到Ipg左右的样品核酸，克服了常规检测方法检测周期长、灵敏度低的缺点。
图1为实施例中犬星状病毒半套式RT-PCR特异性实验结果；图2为实施例中犬星状病毒半套式RT-PCR敏感性实验结果；图3为实施例中DNA Marker DL20001 %琼脂糖凝胶电泳图像。
具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。实施例犬粪便中星状病毒的检测一、引物设计以犬星状病毒基因的保守片段为靶目标设计引物，引物序列如下外套引物上游引物P1 L5 ‘ -CAANTCACAACCCAAAACAAA-3 ‘下游引物P2 L5' -CATTCACTTGGTCAAACACAGTC-3 ‘ 内套引物上游引物 P1 L5 ‘ -CAANTCACAACCCAAAACAAA-3 ‘下游引物P3 R5' -TTTTNACNATCACTGCTAGNGA-3 ‘二、犬粪样中病毒总RNA的提取取3g犬粪样悬浮于500ul PBS溶液中，取200ul粪便悬液上清先通过一个孔径为0. 45ul的过滤器进行过滤以除去真核、细菌大小的粒子。200ul粪便悬液上清中加入ImLTrizol。室温静置lOmin，使核蛋白复合物完全变性。加入200ul氯仿，剧烈震荡15s。使上述混合物在室温静置lOmin，后于4°C 12000rpm离心lOmin。将上清0. 75mL转移到EP管中，加入0. 75mL异丙醇。室温静置5-10min，后于4°C 12000rpm离心lOmin。移去上清，加入ImL 75%酒精(DEPC水配置)清洗沉淀，后于4°C 7500rpm离心5min。弃去酒精，将RNA沉淀于室温干燥3-5min。加入30ul DEPC水。三、cDNA的合成提取总 RNA 5ul, Anchored Oligo (dT) 18 lul, 2XReaction Buffer IOul,TransScript RT Enzyme Mix lul, RNase-free Water 3ul，轻轻混勻，42°C孵育30min，85°C加热5min失活反转录酶，所获cDNA置于_20°C备用。四、半套式RT-PCR检测方法的建立和优化1、半套式RT-PCR反应条件的优化通过对反应体系中不同的Mg2+、弓丨物浓度、dNTP浓度、模板浓度、Taq酶浓度、退火温度等实验结果进行比较，经优化后确定的50ul最佳反应体系如表1所示表 权利要求
1.一种犬星状病毒的半套式RT-PCR检测方法，其特征在于将检测样品进行预处理后，提取总RNA ；将总RNA逆转录到cDNA ；通过半套式RT-PCR反应获得扩增产物；取扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定；若检测样品在预定分子量大小的位置出现特异性扩增条带，则判定为阳性，否则为阴性。
2.根据权利要求1所述的犬星状病毒的半套式RT-PCR检测方法，其特征在于所述的半套式RT-PCR反应的引物设计如下外套引物上游引物 P1 L5' -CAANTCACAACCCAAAACAAA-3 ‘；下游引物 P2 L5' -CATTCACTTGGTCAAACACAGTC-3 ‘；内套引物上游引物 P1 L5' -CAANTCACAACCCAAAACAAA-3 ‘；下游引物 P3 R5' -TTTTNACNATCACTGCTAGNGA-3 ‘。
3.如权利要求1或2所述的犬星状病毒的半套式RT-PCR检测方法，其特征在于具体包括以下步骤A、样品总RNA的提取将样品悬浮于PBS溶液中，取200ul样品悬液上清先通过一个孔径为0. 45ul的过滤器进行过滤以除去真核、细菌大小的粒子，然后向样品悬液上清中加入ImL Trizol，室温静置lOmin，使核蛋白复合物完全变性；再加入200ul氯仿，剧烈震荡15s，在室温静置lOmin，后于4°C 12000rpm离心lOmin，取上清0. 75mL转移到EP管中，加入0. 75mL异丙醇，室温静置5-lOmin，后于4°C 12000rpm离心lOmin，移去上清，加入ImL 75%酒精清洗沉淀，后于40C 7500rpm离心5min，弃去酒精，得到含有样品的总RNA的沉淀，将含有样品的总RNA的沉淀于室温干燥3-5min，加入30ul DEPC水；B、cDNA的合成采用试剂盒将总RNA逆转录到cDNA 提取的总RNA 5ul、Anchored Oligo (dT) 18 lul、2 X Reaction BufferlOul>TransScript RT Enzyme Mix lul 禾口 RNase-free Water 3ul 混勻，42°C孵育30min，85°C加热5min失活反转录酶，得到cDNA，置于_20°C备用；C、PCR扩增外套PCR扩增以1. Oul cDNA为模板，引物使用PI、P2，先95°C预变性5min ；紧接着940C 40s,540C 30s,72 °C 40s，循环 30 次；再 72°C 延伸 lOmin，4°C保存；内套 PCR 扩增以1. Oul外套PCR反应产物为模板，引物使用PU P3，先95°C预变性5min ；紧接着94°C 40s、56°C 30s,72°C 40s，循环30次；再72°C延伸lOmin，得到PCR扩增产物，4°C保存。D、电泳鉴定取5ulPCR扩增产物，用1 %琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察扩增结果，与2000bp标准分子量对照，如在480bp处出现特异性扩增条带，则判定检测结果为阳性，否则为阴性。
4.如权利要求3所述的犬星状病毒的半套式RT-PCR检测方法，其特征在于步骤C中所述的外套PCR扩增和内套PCR扩增所用的试剂均为5ul 10Xbuffer、5. Oul IOmM dNTP、3. Oul 25mmol/LMgCl2、0. 5ul 5U/ulTaq 酶、1. 2ul lOumol/L 上游引物、1. 2ul lOumol/L 下游引物和33. Iul灭菌双蒸水。
全文摘要
本发明提供了一种犬星状病毒的半套式RT-PCR检测方法，包括如下步骤1.以犬星状病毒基因的保守片段为靶目标设计引物，2.将检测样品处理后提取总RNA，3.将总RNA逆转录到cDNA，四、通过半套式RT-PCR方法检测样品中的犬星状病毒。本发明克服了传统技术中的不足之处，具有灵敏度高、特异性好、简便、快速等特点，适用于犬星状病毒的病原学诊断和流行病学研究。
文档编号C12R1/93GK102559927SQ20111044071
公开日2012年7月11日 申请日期2011年12月23日 优先权日2011年12月23日
发明者华修国, 崔立, 朱爱玲, 杨曦 申请人:上海交通大学