利用光合作用生产替代能源的基因工程蓝藻的制作方法

专利名称：：利用光合作用生产替代能源的基因工程蓝藻的制作方法
技术领域：
：本发明涉及可再生能源和生物
技术领域：
。具体的，本发明涉及通过对野生蓝藻的基因工程改造制备具有通过光合作用高效生产替代能源的能力的蓝藻，以及使用所述蓝藻生产替代能源的方法。
背景技术：
：石化能源为国民经济与社会发展的重要物质基础，但石化能源具有稀缺性和不可再生性，随着时间的推移，其价格必将因储量的减少和开采量的下降而上涨。中国为能源消费大国，对石化能源的高度依赖所带来的环境、气候变化问题以及能源供给矛盾长期制约着中国经济的发展。2008年，中国能源消费结构中煤炭占近70%。根据海关总署的统计数据，2008年中国石油净进口量已超过2亿吨，占石油消费总量的52%。据专家预测，未来中国的石油和天然气供应将出现更大的供需缺口。此外，中国的电力行业高度依赖煤炭资源，是造成威胁着电力供应的“煤炭矛盾”长期存在的根本原因之一。因此，可再生能源在中国具有长远的发展潜力和广阔的市场前景，其使用不仅可为中国经济的发展提供有力的保障，也可成为中国经济的新的增长点。国内市场对于可再生能源投资和消费的增加是我国扩大内需的新动力。此外，可再生能源产业的发展必然对相关产业的发展起到带动作用，这将使我国的国民经济结构更加合理。进入21世纪以来，国际原油价格居高不下，太阳能、风能、潮汐能等开发利用成本居高不下，而各国对环境保护的要求在不断的提高，因此，如何开发替代能源的问题受到各国普遍关注。许多国家将加快发展可再生能源作为发展替代能源的重要战略，生物能源是其中发展最快的领域。目前的液体生物燃料主要有生物燃料乙醇和生物柴油。在我国人多地少的特殊背景下，生物燃料的快速发展面临着粮食安全和土地淡水资源紧缺问题。现有技术通过燃料乙醇产业作为替代能源，但是，随着燃料乙醇产量增加，粮食供给短缺和价格上涨导致以粮食为原料的生物能源产业不能持续性发展。近几年大力发展的非粮燃料乙醇和生物质发电产业同样受到我国客观条件的制约，难以满足大规模替代化石燃料的规模和成本要求。以木薯、甜高粱、纤维素为原料的燃料乙醇产业从本质上说是以种植业为基础的，需要大规模投入可耕地、淡水、化肥以获得较高产量，而这些资源在我国均为稀缺资源，用于替代化石能源将对我国整体资源环境造成巨大压力。因此，迫切需要开发不占用可耕地、淡水、化肥资源的新型生物能源技术，为我国可再生能源产业发展提供具备现实可行性的手段，切实有效减少二氧化碳排放，替代化石能源使用，促进基于化石能源的传统工业体系向基于可再生能源的绿色工业体系转化。对微生物进行基因工程改造来生产能源是能源产业中的一个发展方向。但现有技术中，工业上主要是利用具有乙醇代谢途径的异养微生物，例如酵母和大肠杆菌等。发明名称为“突变酵母的乙醇产生”的中国专利98808832.0公开了培养呼吸缺陷型酵母细胞，通过基因工程方法令其具有至少一种呼吸所需的在生长培养基中无功能和/或被抑制的核基因或其产物。该方法可用于燃料乙醇的生产或用于酒精饮料的生产。发明名称为“基因修饰酵母物种和使用基因修饰酵母的发酵方法”的中国专利200480019052.8公开了用外源木糖异构酶基因转化酵母细胞。额外的基因修饰增强了所转化的细胞将木糖发酵成乙醇或者其产物的能力。那些修饰包括缺失非特异或特异的醛糖还原酶基因、缺失木糖醇脱氢酶基因和/或超表达木酮糖激酶。该方法可用于燃料乙醇的生产或用于酒精饮料的生产。发明名称为“大肠杆菌乙醇发酵工程菌及其应用”的中国专利200710177003.2公开了一种耐乙醇的大肠杆菌乙醇发酵工程菌。经多代的定向筛选得到了高耐乙醇的大肠杆菌突变株，并在所述突变株中转入了运动发酵单胞菌的乙醇脱氢酶基因II和丙酮酸脱羧酶基因，得到了一种新型耐乙醇的大肠杆菌乙醇发酵工程菌。该工程菌在用五碳糖和六碳糖做底物发酵生产乙醇时，在高浓度乙醇下依然能够保持较高的发酵速率，而且有较高的乙醇转化率。然而现有技术都是利用本身具有乙醇代谢途径的异养微生物来生产乙醇。蓝藻是一种自养微生物，是目前地球上最广泛的生物体。蓝藻的细胞质中都有内膜系统。蓝藻的细胞质中具原始的片层结构，片层上分布有光合色素叶绿素a和藻胆素(包括藻蓝素和藻红素两种)及类胡萝卜素。蓝藻的叶绿素可以进行光合作用，并且其细胞可以提供光合作用所需的能量，所以蓝藻可以进行光合作用，产生自己所需要的物质，即可以自养。但是，自然存在的光合细菌蓝藻通常不能利用阳光和二氧化碳合成乙醇，仅在避光和无氧条件下通过发酵产生少量乙醇。因此，工业上需要一种简单、廉价、能够充分利用自然的阳光、水、工厂排放气中的二氧化碳和不能种植农作物的土地来大量生产乙醇的方法。
发明内容本发明以蓝藻为宿主，将外源乙醇代谢途径的丙酮酸脱羧酶基因和乙醇脱氢酶基因导入蓝藻的染色体，形成具有稳定遗传性状和较高乙醇产率的基因工程菌株，使得改造的蓝藻菌株能够利用阳光、水和二氧化碳生产替代能源产品。本发明还对基因工程菌株进行适应咸水的定向诱导进化，从而使得改造的蓝藻菌株能够利用阳光、水和二氧化碳生产乙醇。本发明还提供了制备基因工程蓝藻的方法，其包括将外源丙酮酸脱羧酶基因和乙醇脱氢酶基因，并整合到蓝藻染色体上。本发明还提供了基因工程蓝藻通过光合作用利用阳光、水和二氧化碳制备乙醇的方法。本发明提供了一种基因工程蓝藻，其含有能够利用光合作用生产乙醇的基因修饰。通过基因修饰，令不能通过光合作用合成乙醇的蓝藻具备能够通过光合作用，利用阳光、水和二氧化碳大量生产乙醇的能力。本发明提供了一种利用光合作用生产乙醇的基因工程蓝藻，其含有整合到染色体上的外源丙酮酸脱羧酶基因和乙醇脱氢酶基因。外源丙酮酸脱羧酶基因和乙醇脱氢酶基因在蓝藻细胞内分别编码具有丙酮酸脱羧酶活性和乙醇脱氢酶活性的蛋白。本发明使用的宿主是蓝藻，其可以是集胞藻(Synechocystis)、隐球藻属(Aphanocaps)、鱼腥藻属(Anobaena)、念珠藻属(Nostoc)、颤藻属(Oscillatoria)、聚球藻属(Synechococcus)、球藻属(Gloeocapsa)、阿格藻属(Agmmenellumm)、双歧藻属(Scytonema)或鞭枝藻属(Mastigocladus)。本发明的蓝藻优选为集胞藻(Synechocystissp.)。在本发明的一个方面，采用的宿主是集胞藻PCC6803。本发明的基因工程蓝藻含有整合到染色体上的编码丙酮酸脱羧酶和乙醇脱氢酶的核酸。丙酮酸脱羧酶广泛存在于豆质植物、麻黄等植物、酿酒酵母属(Saccharomycesspecies)、曲霉属等真菌中，另外运动单胞菌(Zymomonasmobilis)、醋杆菌属(Acetobacterspecies)中也都含有丙酮酸脱羧酶。不同来源的丙酮酸脱羧酶,性质略有不同。本领域已知丙酮酸脱羧酶是一种四聚体，分子量约为250kD左右，其亚基有两种(a、￠),^亚基的分子量比a亚基的分子量高约5%。PDC的两个亚基首先形成紧密的二聚体，再由两个二聚体形成松散的四聚体。其催化机理为，丙酮酸脱羧酶的催化中心为一个ylide域(ylide-ThDP)，yIide-ThDP攻击丙酮酸的羧基，生成C2a-乳酸-ThDP，此时ThDP上的噻唑环在脱羧后作为电子受体而转化为共振稳定的烯胺，当加入电子给体C2-羟乙基-ThDP时，生成ylide-ThDP并同时释放乙醛。当底物与酶混合时，底物首先是通过氢键形式结合到ThDP中噻唑环的下面，然后底物旋转至适当角度使得底物离催化中心ylide-ThDP一定距离(3.81±0.19)A，甲基基团离ylide-ThDP为(3.93±0.33)A时，ThDP的S端的N上的质子就会进攻底物生成乳酸-ThDP，而与此同时，Asp27就会去质子化。不同来源的丙酮酸脱羧酶，其编码序列和活性有所不同。已经对各种来源的丙酮酸脱羧酶进行了测序和活性研究，发现不同来源的丙酮酸脱羧酶的序列有所区别，但也具有很多保守的区域和活性位点。其中，如Genebank报道的，运动单胞菌的丙酮酸脱羧酶具有如SEQIDNO.I的氨基酸序列，其基因pdc具有如SEQIDNO.2的核酸序列。不同来源的丙酮酸脱羧酶的序列有所区别，但都具有对应于SEQIDNO.I的氨基酸序列，其中存在保守序列和活性位点。乙醇脱氢酶(Alcoholdehydrogenase,简称ADH)大量存在于人和动物肝脏、植物及微生物细胞之中，是一种含锌金属酶，具有广泛的底物特异性，其分子由两个亚基组成，其中一个位于酶的活性中心，另一个起稳定四级结构的作用。乙醇脱氢酶够以烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)为辅酶，催化伯醇和醛之间的可逆反应CH3CH20H+NAD+—CH3CH0+NADH+H+。在人和哺乳动物体内，乙醇脱氢酶与乙醛脱氢酶(ALDH)构成了乙醇脱氢酶系，参与体内乙醇代谢。作为生物体内主要短链醇代谢的关键酶，它在很多生理过程中起着重要作用。它是一种广泛专一性的含锌金属酶。乙醇脱氢酶乙醇氧化体系是在肝脏中代谢酒精的一条主要途径。不同来源的乙醇脱氢酶，其编码序列和活性有所不同。已经对各种来源的乙醇脱氢酶进行了测序和活性研究，发现不同来源的乙醇脱氢酶的序列和活性有所区别。其中，如Genebank报道的，念珠藻属的其中一种乙醇脱氢酶ADHB具有如SEQIDNO.3的氨基酸序列，其基因adhB具有如SEQIDNO.4的核酸序列。不同来源的乙醇脱氢酶的序列有所区别，但可具有对应于SEQIDNO.3的氨基酸序列，其中存在保守序列和活性位点。本发明中使用的丙酮酸脱羧酶和乙醇脱氢酶包括不同生物中筛选和基因工程修饰得到的丙酮酸脱羧酶和乙醇脱氢酶。筛选或经过基因工程修饰的丙酮酸脱羧酶和乙醇脱氢酶在蓝藻中进行活性测试和确认。对丙酮酸脱羧酶和乙醇脱氢酶的基因工程修饰包括对该蛋白或基因的氨基酸或核苷酸进行突变、删除或增加。本发明提供了一种利用光合作用生产乙醇的基因工程蓝藻，其含有整合到染色体上的外源基因，所述外源基因为丙酮酸脱羧酶基因和乙醇脱氢酶基因，其中所述丙酮酸脱羧酶基因编码的丙酮酸脱羧酶具有对应于SEQIDNO.I的氨基酸序列，以及所述乙醇脱氢酶基因编码的乙醇脱氢酶具有对应于SEQIDN0.3的氨基酸序列。在本发明的一个方面，本发明的基因工程蓝藻染色体整合的丙酮酸脱羧酶基因编码的丙酮酸脱羧酶具有(I)对应于SEQIDNO.I的氨基酸序列，或(2)在上述氨基酸序列中还引入了一个或几个氨基酸的取代、缺失、插入、增加或倒位后所得的氨基酸序列，并具有丙酮酸脱羧酶的活性。在本发明的一个方面，本发明的基因工程蓝藻染色体整合的乙醇脱氢酶基因编码的乙醇脱氢酶具有(I)对应于SEQIDNO.3的氨基酸序列，或(2)在上述氨基酸序列中还引入了一个或几个氨基酸的取代、缺失、插入、增加或倒位后所得的氨基酸序列，并具有丙酮酸脱羧酶的活性。在本发明的一个方面，本发明的基因工程蓝藻中所述丙酮酸脱羧酶基因选自来源于运动发酵单胞菌、酵母、蓝藻和大肠杆菌的丙酮酸脱羧酶基因，优选来源于运动发酵单胞菌。在本发明的一个方面，本发明的基因工程蓝藻中所述乙醇脱氢酶基因选自来源于运动发酵单胞菌、酵母、蓝藻、嗜热醋酸菌、绿屈挠菌、聚球藻的乙醇脱氢酶基因，优选来源于念珠藻属。在本发明的一个方面，本发明的基因工程蓝藻中含有整合到染色体上的外源丙酮酸脱羧酶基因和外源乙醇脱氢酶基因，所述外源丙酮酸脱羧酶基因选自来源于运动发酵单胞菌，并且所述外源乙醇脱氢酶来源于念珠藻属。在本发明的一个方面，基因工程蓝藻带有的所述丙酮酸脱羧酶基因具有SEQIDNO.2的碱基序列的多核苷酸，或是与SEQIDNO.2的碱基序列或其互补碱基序列组成的多核苷酸在严格条件下杂交的多核苷酸。在本发明的一个方面，基因工程蓝藻带有的所述外源乙醇脱氢酶基因具有SEQIDNO.4的碱基序列的多核苷酸，或是与SEQIDNO.4的碱基序列或其互补碱基序列组成的多核苷酸在严格条件下杂交的多核苷酸。在本发明的一个方面，本发明的基因工程蓝藻产生的乙醇由细胞中扩散到培养液中。本发明的基因工程蓝藻的培养液中溶液乙醇浓度达到0.5g/L以上，优选的，达到I.5到5g/L。在本发明的一个方面，本发明的基因工程蓝藻保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏号为CGMCCNo.5347。本发明的基因工程蓝藻可以在淡水中或盐水中培养和生产乙醇，生产乙醇的效率达到0.5g/L，优选的，达到I.5到5g/L。淡水是指含盐量小于0.5g/L的水。另外，本发明的基因工程蓝藻也可以进行适应咸水的定向诱导进化，培育能利用盐水生产乙醇的菌株。咸水是指溶解有较多氯化钠(NaCl)(通常同时还有其它盐类物质)的水，主要包括海水、湖泊(咸水湖)或人工培养系统的水。本发明中，咸水中盐浓度为为1%，优选3%，最优选5%重量或以下。本发明的基因工程蓝藻经过适应咸水的定向诱导，可以在淡水或盐浓度为1%，优选3%，最优选5%重量或以下的咸水水体进行培养生产乙醇，因此可以在近海或部分咸水湖进行培养和生产。本发明的基因工程蓝藻可以利用低浓度二氧化碳气体或其水溶液为碳源生产乙醇。本发明的基因工程蓝藻可以直接利用空气中的二氧化碳。另外，传统的二氧化碳应用领域例如饮料、焊接、制冷、强化石油开采等要求二氧化碳浓度在80-90%以上，而以煤为主要燃料的火力发电厂排放的烟道气中二氧化碳浓度较低(8-15%)，不能直接用于传统二氧化碳应用领域。本发明的基因工程蓝藻可以直接利用和消耗低浓度二氧化碳的气体，例如来自发电厂的烟道气。本发明的蓝藻利用的二氧化碳气体或其水溶液中二氧化碳浓度大于0.5。本发明还提供了制备基因工程蓝藻的方法，其包括将外源丙酮酸脱羧酶基因和乙醇脱氢酶基因，以及表达丙酮酸脱羧酶和乙醇脱氢酶基因所需启动子导入蓝藻，并整合到染色体上。现代基因工程技术中存在把外源基因转化到蓝藻和整合到染色体上的技术。蓝藻外源基因表达载体是其中一种有效的方法。为使外源目的基因的有效转化及表达，已构建了一系列穿棱质粒表达载体和基因整合平台系统，如pZL、pPKE2、pPKET等。在这些表达载体上组装了多种含有不同启动子的基因表达盒。应用较多的有噬菌体PL和PR启动子及蓝藻藻蓝蛋白cpcB2A2操纵子启动子和热休克基因groESL等。常用的包括松驰质粒复制起始点的穿梭质粒，在监操细胞中有较闻的基因拷贝数，提闻了目的基因闻效表达的可能性。外源基因进入到蓝藻可能发生以下情况1.与表达载体一起游离于染色体外进行转录；2、外源基因整合到染色体上并进行转录；3、外源基因整合到染色体上后不转录，表现为基因沉默。因此，需要对外源基因的表达进行检测。外源基因的表达包括转录和翻译两个阶段。因此，外源基因表达产物的检测过程就是对特异性mRNA和蛋白质的检测。对mRNA检测的主要方法为Northern杂交法，检测特异性蛋白质的方法包括生化反应检测法、免疫学检测法和生物学活性检测法等。本发明的制备基因工程藻类包括以下主要步骤。通过PCT或合成的方法获得目的基因或目的核苷酸片段，包外源丙酮酸脱羧酶基因、外源乙醇脱氢酶基因，启动子和/或抗性标记基因等核苷酸片段。将带有目的基因的DNA片段连接到能够独立复制并具有选择标记的载体上，如质粒、噬菌体和病毒等，以形成重组DNA分子。DNA片断与载体的连接方式主要有同聚末端连接、粘性末端连接、平齐末端连接及人工接头分子连接。重组DNA必须进入宿主细胞DNA中，才能得到扩增和表达。根据载体的性质不同，可采用转染、转化、转导等方式，将重组DNA分子导入宿主细胞内，并使其大量繁殖。应用于蓝藻遗传转化的供体DNA大体可分为三类第一类是直接利用未修饰的外源质粒，可将外源DNA导入蓝藻。第二类是利用自身染色体或基因组，通过同源重组作为插入突变的有效方法。第三类是使用穿梭载体。穿梭质粒可以含有蓝藻质粒复制起点，能够以复制子形式独立存在。穿梭质粒还可以带有与蓝藻基因组相同的序列，从而在进入蓝藻后与发生染色体同源重组，从而稳定存在和表达。本发明中的外源基因是通过载体导入蓝藻的，载体中包括整合到染色体上的外源丙酮酸脱羧酶基因和外源乙醇脱氢酶的核酸部分和启动子。其中所述外源丙酮酸脱羧酶基因编码的蛋白具有对应于SEQIDNO.I的氨基酸序列，以及其中所述外源乙醇脱氢酶基因编码的乙醇脱氢酶具有对应于SEQIDNO.3的氨基酸序列。在本发明的一个方面，基因工程蓝藻带有的所述丙酮酸脱羧酶基因具有SEQIDNO.2的碱基序列的多核苷酸，或是与SEQIDNO.2的碱基序列或其互补碱基序列组成的多核苷酸在严格条件下杂交的多核苷酸。在本发明的一个方面，基因工程蓝藻带有的所述外源乙醇脱氢酶基因具有SEQIDNO.4的碱基序列的多核苷酸，或是与SEQIDNO.4的碱基序列或其互补碱基序列组成的多核苷酸在严格条件下杂交的多核苷酸。在本发明的一个方面，所述载体带有的其中启动子为来源于蓝藻的Prbc启动子、光诱导启动子、硝酸盐诱导启动子或温度诱导启动子，优选为Prbc启动子。在本发明的一个方面，提供了一种具有上述特征的载体，所述载体包括抗生素标记(优选抗性基因Q片段)，启动子(例如Prbc启动子)，丙酮酸脱羧酶基因pdc和乙醇脱氢酶基因adhB片段。本发明提供的另一种具有上述特征的载体是用于转化蓝藻的穿梭质粒，所述载体带有抗生素标记(优选抗性基因Q片段)、启动子(例如Prbc启动子)、丙酮酸脱羧酶基因pdc和乙醇脱氢酶基因adhB。所述载体还可包括蓝藻基因组片段，从而使得所述丙酮酸脱羧酶和所述启动子在转换蓝藻后可重组到蓝藻的染色体上。图I为构建本发明基因工程蓝藻的示意图。图2为本发明基因工程蓝藻在培养液中的生物量、乙醇含量和时间的关系图。具体实施例方式本发明将在下面的实施例中进一步说明。应当理解，尽管这些实施例说明了本发明的优选实施方案，但仅是以例证的方式给出的。根据上面的论述和这些实施例，本领域的技术人员可以确定本发明的基本特征，并在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可对本发明做出多种改变和修饰，以使其适用于多种用法和条件。因此，除了那些本文所示和描述的那些之外，根据前文所述，本发明的各种修改形式对本领域的技术人员来说将是显而易见的。这些修改形式也旨在属于所附权利要求书的范围内。实施例I带有抗生素标记、启动子和运动单胞菌丙酮酸脱羧酶pdc基因的载体PXT117的获得采用商购的pET28b(Novagen,美国)做为构建的载体。rbc启动子(即Prbc)核酸序列是根据已报道的集胞藻属的序列信息(如Genebank的BA000022.2，X65960.I)合成，其序列如SEQIDNo.5所示。丙酮酸脱羧酶pdc基因的核酸序列是根据已报道的运动单胞菌的pdc基因的核酸序列(如Genebank的X59558.I)合成，其序列如SEQIDNo.2所示。为了克隆到pET28b以及后期的构建需要，合成时在Pdc基因序列的3’端增加SpeI位点，NotI位点。另外采用带有抗壮观霉素和抗链霉素的抗性基因的omegainterposon,即Q片段(参见Prentki,P.,andH.M.Krisch；1984；InvitroinsertionalmutagenesiswithaselectableDNAfragment；Gene29:303-313；以及XiaomingTan,LunYaoetc.,2011,Photosynthesisdrivenconversionofcarbondioxidetofattyalcoholsandhydrocarbonsincyanobacteria,MetabolicEngineering13,169-176)作为抗性标记。合成的Q片段的序列如SEQIDNo.6所示。将Q片段，启动子Prbc和pdc基因顺次连接克隆到pET28b载体上，通过抗性筛选得到质粒PXT117。pXT117结构参见图I。通过PCR核查，确认得到带有Q-Prbc-pdc的插入片段的质粒。质粒pXT117转化大肠杆菌DH5a(大肠埃希氏菌，Escherichiacoli),该含有质粒PXT117的大肠杆菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，北京市朝阳区北辰西路I号院3号，保藏日期为2011年10月14日，保藏号为CGMCCNo.5348。实施例2念珠藻的乙醇脱氢酶adhB序列的获得根据已报道的念珠藻的adhB序列的DNA序列(如Genebank的BA000019)，合成SEQIDNo.4的核酸序列。为了克隆到PXT117，在合成时在该序列的5’和3’端分别添加SpeI位点和NotI位点。实施例3载体的获得对实施例I获得的pXTl17和实施例2得到的adhB片段分别用SpeI和NotI进行双酶切，连接后得到PXT125。pXT125结构参见图I。通过凝胶电泳和测序，确认得到带有Q-Prbc-pdc-adhB插入片段的质粒。实施例4带有抗生素标记、启动子、运动单胞菌pdc基因和念珠藻adhB基因的用于转化蓝藻的穿梭质粒的获得用SphI和NotI双酶切pXT125，补平粘性接口，回收约5.8kb的片段(即Q-Prbc-pdc-adhB的片段)。用EcoRI酶切质粒pKWl188SL，该质粒转化大肠杆菌DH5a(大肠埃希氏菌，Escherichiacoli),保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，北京市朝阳区北辰西路I号院3号，保藏日期为2011年10月14日，保藏号为CGMCCNo.5349。其构建和结构参见XiaomingTan,LunYaoetc.,2011,Photosynthesisdrivenconversionofcarbondioxidetofattyalcoholsandhydrocarbonsincyanobacteria,MetabolicEngineering13，169-176)，T4DNAPolymerase补平，回收约5.4kb的片段。将上述获得的Q-Prbc-pdc-adhB的片段与pKW1188SL经EcoRI酶切后得到的片段连接，经筛选得到如图I所示的质粒PXT127。以上步骤中PCR、酶切、补平、连接等分子克隆技术操作按照常规方法进行，其中典型操作包括以下方法。PCR:反应条件为94°C先变性5min;然后94°C变性lmin，62°C退火30s，72°C延伸2min，共25个循环；最后72°C反应lOmin。大肠杆菌细胞的化学转化准备LB固体培养基(含抗生素)，使用前室温下放置2-3小时；-80°C冰柜中取出感受态细胞，冰浴中融化5min;向融化的感受态细胞中加入I-IOul连接产物(或质粒)，轻轻混匀，冰水浴中放置30分钟；同时向另一管中加入等体积灭菌水作为对照；42°C热激90秒，然后立即冰水浴2分钟；加入ImlSOC液体培养基，37°C、250rpm振荡复壮45min_lh；IOOOOrpm离心Imin,沉淀重悬于100_200ulSOC液体培养基；取适量(约IOOul)重悬液涂布于LB固体培养基(含抗生素)上，37°C倒置培养，12-20小时后长出菌落。实施例5蓝藻细胞的转化以野生型集胞藻PCC6803为宿主，将实施例4中获得的带Q-Prbc-pdc-adhB的质粒PXT127转化到集胞藻中。按照以下条件培养野生型集胞藻PCC6803:培养温度30°C;光照强度50UE.m_2.s—1;培养方式500ml三角瓶培养，通5%C02，接种浓度OD730=0.5;培养基配制BG-Il培养基300ml，高压蒸汽灭菌后，温度降低到室温，加入壮观霉素，浓度20ug.mL'然后把质粒pXT127通过以下步骤转化到PCC6803。5000g离心5分钟收集藻细胞；用新鲜BG-Il液体培养基洗涤细胞两次后，按IXIO9Cells.mr1(0D730=2.5)的浓度将细胞重悬于BG-Il培养基中；温育，取0.4mL浓缩后的藻液到新的无菌EP管，加入质粒pXT127(终浓度10ug.mL-1)混匀，30uE.m_2.s-1光照30°C温育45hr;涂膜将藻-DNA混合物涂在含有硝酸纤维素膜的BG-Il平板上，光照条件下，30iiE.HT2.S-1JOt:温育1824hr;转膜将NC膜转移到含有抗生素的BG-Il平板上，于30iiEm_2.培养约一周左右即有转化子长出。挑取转化子在带壮观霉素的BG-Il平板上划线，待藻落富集后再接入液体培养基中进一步分离筛选。得到带有pXT127的集胞藻(Synechocystissp.)，命名为PCC6803_pXT127。其中一个菌株(送保藏名QCC003)保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，北京市朝阳区北辰西路I号院3号，保藏日期为2011年10月14日，保藏号为CGMCCNo.5347。实施例6转基因蓝藻生产乙醇的活性检测和比较在如实施例5中描述的培养基和培养条件下培养实施例5中获得的上述PCC6803-pXT127菌株，以PCC6803为空白对照。每两天取样一次，每次500ul，使用可见光分光光度计测量培养液的OD73tl,以获得蓝藻的生物量数据。使用山东省科学院生物研究所生物传感分析仪SBA-40D测定蓝藻培养液中的乙醇浓度。SBA-40D型生物传感分析仪利用酶促反应来进行定量分析，测定的关键传感器是固定化酶和H202电极复合传感器，分析过程基于以下生化反应底物+O2+H2O-固赵七_莫——^产物+H2Q2谷氨酸谷氨酸氧化酶a-酮戊二酸十NH4+葡萄糖葡萄糖氧化酶葡萄糖酸乳酸乳酸氧化酶丙酮酸乙醇乙醇氧化酶乙酸把转基因蓝藻培养液12000rpm离心2min，取上清液测量乙醇浓度。按生物传感分析仪操作指南清洗仪器、定标后，使用生物传感分析仪配套的取样针取上清液25ul，注入进样孔，仪器给出乙醇浓度读数。实施例5中获得的上述PCC6803-pXT127菌株的生长和生产乙醇与时间的关系如图2所示。实施例7对基因工稈蓝藻讲行适应咸水的定向诱导讲化实施例5中获得的上述PCC6803-pXT127菌株用淡水培养2_3天后，以200目网筛筛选个体较大的健康个体，转移至盐浓度逐渐增加的培养液中，依次培养2-5天后选择较大的健康个体。培养液盐浓度从I%重量开始，按0.5%重量的浓度差逐步增加到5%重量，盐组分与海水盐组分相同，即氯化钠、硫酸镁、氯化镁、氯化钾、氯化钙分别占总盐分的78.4%、9.5%、6.6%、2.I%、3.4%。筛选出的所述菌株在3-3.5%重量保持乙醇连续生产，基本与淡水产量相当。本发明以蓝藻为宿主，将外源乙醇代谢途径基因导入染色体，形成具有稳定遗传性状和较高乙醇产率的基因工程菌株。本发明的基因工程菌株能够利用阳光、二氧化碳生产乙醇这种替代能源产品。本发明为解决传统生物能源技术的规模、产量和成本瓶颈提供了新的方法，有助于达到节能减排目标。本申请中提到的论文或专利申请的全文或部分通过引用到本申请中而公开，但不形成对本发明的现有技术。对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化涵括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。此夕卜，显然“包括”一词不排除其他单元或步骤，单数不排除复数。权利要求1.一种利用光合作用生产乙醇的基因工程蓝藻，其含有整合到染色体上的外源基因，所述外源基因为丙酮酸脱羧酶基因和乙醇脱氢酶基因，其中所述丙酮酸脱羧酶基因编码的丙酮酸脱羧酶具有对应于SEQIDNO.I的氨基酸序列，以及所述乙醇脱氢酶基因编码的乙醇脱氢酶具有对应于SEQIDNO.3的氨基酸序列。2.权利要求I的基因工程蓝藻，其中所述丙酮酸脱羧酶基因选自来源于运动发酵单胞菌，以及乙醇脱氢酶来源于念珠藻属。3.权利要求1-2中任一项的基因工程蓝藻，其中所述丙酮酸脱羧酶基因具有SEQIDNO.2的核酸序列，其中所述乙醇脱氢酶基因具有SEQIDNO.4的核酸序列。4.权利要求中1-3任一项的基因工程蓝藻，其选自集胞藻属、隐球藻属、鱼腥藻属、念珠藻属、颤藻属、聚球藻属、球藻属、阿格藻属、双歧藻属和鞭枝藻属，优选为集胞藻属，最优选为集胞藻PCC6803。5.权利要求1-4任一项的所述的基因工程蓝藻，其生产的乙醇由细胞中扩散到培养液中，溶液中乙醇浓度达到0.5g/L，优选的，达到I.5到5g/L。6.权利要求1-5任一项的基因工程蓝藻，其在淡水或盐浓度为1%，优选3%，最优选5%重量或以下的咸水水体进行培养。7.权利要求1-6任一项的基因工程蓝藻，其保藏号为CGMCCNo.5347。8.制备权利要求1-7中任一项的基因工程蓝藻的方法，其包括将外源丙酮酸脱羧酶基因和乙醇脱氢酶基因，以及表达丙酮酸脱羧酶和乙醇脱氢酶基因所需启动子导入蓝藻，并整合到蓝藻染色体上。9.用权利要求1-7中任一项的基因工程蓝藻制备乙醇的方法。10.一种载体，其包括(a)核酸，其包含丙酮酸脱羧酶基因和乙醇脱氢酶基因，其中所述丙酮酸脱羧酶基因编码的丙酮酸脱羧酶具有对应于SEQIDNO.I的氨基酸序列，以及，其中所述乙醇脱氢酶基因编码的乙醇脱氢酶具有对应于SEQIDNO.3的氨基酸序列；和(b)启动子，所述启动子与所述丙酮酸脱羧酶和乙醇脱氢酶基因可操作地连接，优选的，其中所述丙酮酸脱羧酶基因具有SEQIDNO.2的核酸序列，其中所述乙醇脱氢酶基因具有SEQIDNO.4的核酸序列。全文摘要本发明提供了一种利用光合作用生产乙醇的基因工程蓝藻，其含有整合到染色体上的外源丙酮酸脱羧酶基因和外源乙醇脱氢酶。本发明还提供了制备所述基因工程蓝藻的载体和制备方法，以及使用所述基因工程蓝藻生产乙醇的方法。文档编号C12N15/53GK102732426SQ201110443658公开日2012年10月17日申请日期2011年12月27日优先权日2011年1月19日发明者范文俊,郑晓光申请人:浙江齐成碳能科技有限公司