在玉米3号和4号染色体上的与镰孢属穗霉菌抗性相关联的基因座的制作方法

专利名称：在玉米3号和4号染色体上的与镰孢属穗霉菌抗性相关联的基因座的制作方法
技术领域：
本公开涉及用于增强玉米植株中镰孢属(Fusarium)穗霉菌抗性的组合物和方法。
背景技术：
镰孢属穗霉菌(也称为镰孢属穗腐病)是藤仓赤霉菌(Gibberella fuijkuroi)复合种，即轮枝镰孢菌(F. verticillioides)、层出镰孢菌(F. proliferatum)、和/或胶孢镰孢菌(F. subglutinans)引起的玉米破坏性病害。它主要存在于美国东南部、欧洲南部、墨西哥、巴西、阿根廷和南非，并影响籽粒产量和质量两者。镰孢属穗霉菌也可导致多个霉菌毒素的污染，包括伏马毒素(FUM)、串珠镰刀菌素(MON)、和/或白僵菌素,它们似乎会引起许多人类和动物的疾病。例如伏马毒素与多种动物中毒症相关，所述动物中毒症包括脑白质软化(Marasas等人(1988)Onderstepoort J. Vet. Res. 55 197-204 ;Wilson等人(1990)美国兽医实验室诊断专家协会第33届年会文摘,Denver,Colo. ,Madison,ffis. ,USA)和猪肺水肿(Colvin 等人(1992)Mycopathologia 117 :79_82)中介绍的由 Oliver 和 Pharr 所描述的方法，对每次刻压的加载/卸载曲线进行分析。伏马菌素也是可疑致癌物(Geary等人(1971) Coord. Chem. Rev. 7 81 ;Gelderblom 等人(1991) Carcinogenesisl2 1247-1251 ；Gelderblom等人(1992)Carcinogenesis 13 :433-437)并已与人类出生缺陷相关(Missmer等人(2006)Environ Health perspect 114:237-41)。使用表型选择将镰孢属穗霉菌抗性种质渗入易感系中是既耗时又困难，并且由于镰孢属穗霉菌对环境条件敏感，年复一年地仅基于表型来选择抗性已被证明是不可靠的。此外，专门的病害筛查场所的运作高昂，并且植物必须生长成熟才能对抗性或易感性水平进行分类。然而，通过使用与镰孢属穗霉菌抗性相关联的分子标记进行的选择具有使得至少一些选择仅基于子代的遗传组成的优点。此外，镰孢属穗霉菌抗性在植物生命周期非常早的阶段甚至早至种子期就可确定。使用与镰孢属穗霉菌抗性性状相关联的分子标记可获得 更高的选择率，这就意味着镰孢属穗霉菌抗性的植物育种可更迅速地开展，从而在相对较短的时间内生成商业上可接受的抗性植物。因此，希望提供用于鉴定和选择具有增强的镰孢属穗霉菌抗性的玉米植株的组合物和方法。镰孢属穗霉菌遗传抗性的一些实例已被报道(Perez-Brito等人(2001)Agrociencia 35 :181-196 ;Ali 等人(2005)Genome 48 :521-533 ；Robertson-Hoyt等人(2006) Crop Sci. 46 :1734-1743 ;Zhang 等人(2005) JAppl Genet 47:9-15;Robertson-Hoyt等人(2007)Phytopathology 97 :311-317 ;Ding等人(2008)Mol Breeding22 :395-403)。发明概述本发明提供用于鉴定和选择具有增强的镰孢属穗霉菌抗性的玉米植株的组合物和方法。在一个实施方案中，提供了选择具有增强的镰孢属穗霉菌抗性的玉米植株的方法。在这些方法中，在玉米植株中检测到至少一个标记等位基·因的存在。标记等位基因可包括与以下标记等位基因中的任一种连锁并关联的任何标记等位基因位于PHM12209. 11的 “C”、位于 PHM12209. 20 的 “T”、位于 PHMl2209. 21 的 “C”、位于 PHM12209. 22 的 “G”、位于 PHM12209. 23 的“C”、位于 PHM9905. 11 的“A”、位于 PHM9905. 13 的“T”、位于 PHM9905. 35的 “G”、位于 PHM2204. 88 的 “T”、“位于 PHM2204. 105 的 A”、位于 PHM13926. 25 的 “C”、位于PHM13926. 27 的 “G”、位于 PHM13926. 28 的 “G”、位于 PHM13926. 32 的 “G”、位于 PHM10892. 3的“C”、位于PHM939. 47的“G”和位于PHM939. 48的“A”。然后选出具有与上述标记等位基因中的任一种连锁并关联的标记等位基因的玉米植株。在其它实施方案中，标记等位基因可与以下标记等位基因中的任一种连锁位于PHM12209. 11 的“C”、位于 PHM12209. 20 的“T”、位于 PHM12209. 21 的“C”、位于 PHM12209. 22的 “G”、位于 PHM12209. 23 的 “C”、位于 PHM9905. 11 的 “A”、位于 PHM9905. 13 的 “T”、位于PHM9905. 35 的 “G”、位于 PHM2204. 88 的 “T”、位于 PHM2204. 105 的 “A”、位于 PHM13926. 25的“C”、位于 PHM13926. 27 的“G”、位于 PHM13926. 28 的“G”、位于 PHM13926. 32 的“G”、位于PHM10892. 3的“C”、位于PHM939. 47的“G”和位于PHM939. 48的“A”，基于单次减数分裂图谱，距离为 30cM、25cM、20cM、15cM、10cM、9cM、8cM、7cM、6cM、5cM、4cM、3cM、2cM、lcM、0. 9cM、0. 8cM、0. 7cM、0. 6cM、0. 5cM、0. 4cM、0. 3cM、0. 2cM、或 0. lcM。在另一个实施方案中，提供了选择具有增强的镰孢属穗霉菌抗性的玉米植株的方法。在这些方法中，在玉米植株中检测到至少一个标记等位基因的存在。所述标记等位基因可为以下标记等位基因中的任一种位于PHM12209. 11的“C”、位于PHM12209. 20的 “T”、位于 PHMl2209. 21 的 “C”、位于 PHM12209. 22 的 “G”、位于 PHM12209. 23 的 “C”、位于 PHM9905. 11 的 “A”、位于 PHM9905. 13 的 “T”、位于 PHM9905. 35 的 “G”、位于 PHM2204. 88的 “T”、位于 PHM2204. 105 的 “A”、位于 PHM13926. 25 的 “C”、位于 PHM13926. 27 的 G”、位于PHM13926. 28 的“G”、位于 PHM13926. 32 的“G”、位于 PHM10892. 3 的“C”、位于 PHM939. 47 的“G”和位于PHM939.48的“A”。然后选出具有上述所列标记等位基因中的至少一种的玉米植株。在另一个实施方案中，提供了用于鉴定具有增强的镰孢属穗霉菌抗性的玉米植株的方法，即使用标记基因座序列、或标记基因座序列的一部分、或标记基因座的互补序列或其一部分作为探针来检测在玉米植株中的标记基因座。在这些方法中，所述标记探针在严格条件下与介于以下序列之间并包括以下序列的连续DNA杂交SEQ ID N0:1、或基于Clustal V比对方法与SEQ ID NO :1具有95%同一性的核苷酸序列，和SEQ ID NO :7、或基于Clustal V比对方法与SEQ ID NO 7具有95%同一性的核苷酸序列，并且所述标记基因座包含与增强的镰孢属穗霉菌抗性相关联的至少一个等位基因。然后选出具有与增强的镰孢属穗霉菌抗性相关联的至少一个等位基因的玉米植株。在另一个实施方案中，提供了用于选择具有增强的镰孢属穗霉菌抗性玉米植株的方法，即检测在第一玉米植株中的至少一个标记基因座，将所述第一玉米植株与第二玉米植株杂交，对子代植株进行在至少一个标记基因座评价，以及选择具有与第一玉米植株相同的在所述至少一个标记基因座的等位基因的子代植株。可使用标记基因座的序列、所述标记基因座序列的一部分、或所述标记基因座的互补序列或其一部分来检测所述标记基因座。标记探针在严格条件下与介于以下序列之间并包括以下序列的连续DNA杂交SEQ IDNO :1、或基于Clustal V比对方法与SEQ ID NO : I具有95%同一性的核苷酸序列，和SEQID NO :7、或基于Clustal V比对方法与SEQ ID NO :7具有95%同一性的核苷酸序列，并且所述标记基因座包含与增强的镰孢属穗霉菌抗性相关联的至少一个等位基因。
在另一个实施方案中，提供了用于鉴定具有增强的镰孢属穗霉菌抗性的玉米植株的方法，即使用标记基因座的序列、标记基因座序列的一部分、或标记基因座的互补序列或其一部分作为探针来检测在玉米植株中的标记基因座。在这些方法中，标记探针在严格条件下与介于以下序列之间并包括以下序列的连续DNA杂交SEQ ID NO :10、或基于ClustalV比对方法与SEQ ID NO :10具有95%同一性的核苷酸序列，和SEQ ID N0:22、或基于Clustal V比对方法与SEQ ID NO :22具有95%同一性的核苷酸序列，并且所述标记基因座包含与增强的镰孢属穗霉菌抗性相关联的至少一个等位基因。然后选出具有与增强的镰孢属穗霉菌抗性相关联的至少一个等位基因的玉米植株。在另一个实施方案中，提供了用于选择具有增强的镰孢属穗霉菌抗性玉米植株的方法，即检测在第一玉米植株中的至少一个标记基因座，将所述第一玉米植株与第二玉米植株杂交，对子代植株进行在至少一个标记基因座评价，以及选择具有与第一玉米植株相同的在至少一个标记基因座的等位基因的子代植株。可使用标记基因座的序列、标记基因座序列的一部分、或标记基因座的互补序列或其一部分作为探针来来检测所述标记基因座。标记探针在严格条件下与介于以下序列之间并包括以下序列的连续DNA杂交SEQ IDNO :10、或基于Clustal V比对方法与SEQ ID NO : 10具有95%同一性的核苷酸序列，和SEQID NO :22、或基于Clustal V比对方法与SEQ IDNO :22具有95%同一性的核苷酸序列，并且所述标记基因座包含与增强的镰孢属穗霉菌抗性相关联的至少一个等位基因。在另一个实施方案中，提供了通过检测玉米植株中与增强的抗性相关联的至少一个标记基因座来鉴定具有增强的镰孢属穗霉菌抗性玉米植株的方法。所述标记基因座可选自以下标记基因座中的任一个PHM12969、PHM1695、PHM12209、PHM2204、PHM9905、PHM13926、PHM10091和PHM18211、以及与这些标记连锁的任何其它标记，并且标记基因座可位于3号染色体上的区间内，其包含并侧接PHM12969和PHM18211。标记基因座包含与增强的镰孢属穗霉菌抗性相关联的至少一个等位基因。在另一个实施方案中，提供了选择具有增强的镰孢属穗霉菌抗性的玉米植株的方法。在一个方面，获得了具有标记基因座的至少一个等位基因的第一玉米植株，其中所述等位基因与增强的镰孢属穗霉菌抗性相关联。标记基因座可位于在3号染色体上的区间内，其包含并侧接PHM12969和PHM18211。然后可将第一玉米植株与第二玉米植株杂交，并且可对杂交所得子代植株进行第一玉米植株的等位基因评价。可选择具有第一玉米植株的等位基因的子代植株作为具有增强的镰孢属穗霉菌抗性的植株。在另一个实施方案中，提供了通过检测玉米植株中与增强的抗性相关联的至少一个标记基因座来鉴定具有增强的镰孢属穗霉菌抗性的玉米植株的方法。所述标记基因座可选自以下标记基因座中的任一个PHM2015、PHM10326、PHM497、PHM4483、PHM5273、PHM939、PHM10892、PHM9363、PHM18162、PHM9942、PHM5247、PHM3985、PHM6226 和 PHM10262，以及与这些标记连锁的任何其它标记，并且标记基因座可位于4号染色体上的区间内，其包含并侧接PHM10892和PHM10262。标记基因座包含与增强的镰孢属穗霉菌抗性相关联的至少一个
等位基因。在另一个实施方案中，提供了选择具有增强的镰孢属穗霉菌抗性的玉米植株的方法。在一个方面，获得了具有标记基因座的至少一个等位基因的第一玉米植株，其中所述等位基因与增强的镰孢属穗霉菌抗性相关联。标记基因座可存在于染色体区间内，其包含并侧接PHM10892和PHM10262。可将第一玉米植株与第二玉米植株杂交，并且可对杂交所得子代植株进行第一玉米植株的等位基因评价。可选择具有第一玉米植株的等位基因的子代植 株作为具有增强的镰孢属穗霉菌抗性的植株。在另一个实施方案中，提供了通过检测两个分离的标记基因座的等位基因来鉴定具有增强的镰孢属穗霉菌抗性的玉米植株的方法。第一标记基因座在3号染色体上的区间内，其包含并侧接PHM12969和PHM18211 ;第二标记基因座在4号染色体上的区间内，其包含并侧接PHM10892和HM10262。每个标记基因座包含与增强的镰孢属穗霉菌抗性相关联的至少一个等位基因。在另一个实施方案中，提供了选择具有增强的镰孢属穗霉菌抗性的玉米植株的方法。在一个方面，获得了第一玉米植株，其具有第一标记基因座的至少一个等位基因和第二标记基因座的至少一个等位基因。第一标记基因座在3号染色体上的区间内，其包含并侧接PHM12969和PHM18211 ;第二标记基因座在4号染色体上的区间内，其包含并侧接PHM10892和PHM10262。第一标记基因座的至少一个等位基因和第二标记基因座的至少一个等位基因与增强的镰孢属穗霉菌抗性相关联。可将第一玉米植株与第二玉米植株杂交，并且可对杂交所得子代植株进行第一玉米植株的等位基因评价。可选择具有第一玉米植株的等位基因的子代植株作为具有增强的镰孢属穗霉菌抗性的植株。本文所述的鉴定和/或选择玉米植株的方法也是受关注的。所述植株可在“坚杆”杂种优势群中。附图
简述和序列表根据以下发明详述和附图以及序列表可更全面地理解本发明，以下发明详述和附图以及序列表形成本申请的一部分。该序列表包含以单个字母表示核苷酸序列特征，而三字母表不氛基酸，如 Nucleic Acids Researchl3 :3021-3030 (1985)和 BiochemicalJournal 219 (No. 2) :345-373(1984)中所描述的IUPAC-IUBMB标准中所规定，它们以引用方式全文并入本文。用于核苷酸和氨基酸序列数据的符号和格式遵循在37C.F.R. §1.822中所列出的规定。图I显示了在3号染色体上已测序的BAC(内源的)在物理图谱上的排列，通过并包含PHM12969(SEQ ID NO 1)和PHM18211 (SEQ ID NO 7)限定了这个区域。指示了本文所述的PHM标记。图2显示了在4号染色体上已测序的BAC(内源的)在物理图谱上的排列，通过并包含 PHM10892(SEQ ID NO :10)和 PHM10262 (SEQ ID NO 22)限定了这个区域。指示了本文所述的PHM标记的位点。
图3显示了坚杆亚种群的关联分析，其中3号染色体标记用于与镰孢属穗霉菌抗性显著关联的测试。X轴以染色体上的CM表示距离。3. Y轴概率值。在3号染色体上与坚杆亚种群中穗霉抗性共分离的标记，P-水平为彡0. 001 (区域限定并包含PHM12969和PHM18211)显示在盒区。图4显示了坚杆亚种群的关联分析，其中4号染色体标记用于与镰孢属穗霉菌抗性显著关联的测试。X轴在4号染色体上以CM 表示的距离。4. Y轴概率值。在4号染色体上与坚杆亚群中穗霉抗性共分离的标记，p为彡0. 001的水平(区域限定并包含PHM10892和PHM10262)示于加框区域中。图5显示了出用作镰孢属穗霉菌感染评分指南的FUSERS标度。SEQ ID NO 1 是 PHM12969 的参考序列。SEQ ID NO :2 是 PHM2204 的参考序列。SEQ ID NO :3 是 PHM9905 的参考序列。SEQ ID NO :4 是 PHM12209 的参考序列。SEQ ID NO :5 是 PHM13926 的参考序列。SEQ ID NO :6 是 PHM10091 的参考序列。SEQ ID NO :7 是 PHM18211 的参考序列。SEQ ID NO :8 是 PHM1695 的参考序列。SEQ ID NO :9 是 PHM939 的参考序列。SEQ ID NO :10 是 PHM10892 的参考序列。SEQ ID NO 11 是 PHM5273 的参考序列。SEQ ID NO :12 是 PHM497 的参考序列。SEQ ID NO :13 是 PHM4483 的参考序列。SEQ ID NO :14 是 PHM2015 的参考序列。SEQ ID NO :15 是 PHM10326 的参考序列。SEQ ID NO :16 是 PHM9363 的参考序列。SEQ ID NO :17 是 PHM18162 的参考序列。SEQ ID NO :18 是 PHM9942 的参考序列。SEQ ID NO :19 是 PHM5247 的参考序列。SEQ ID NO :20 是 PHM3985 的参考序列。SEQ ID NO 21 是 PHM6226 的参考序列。SEQ ID NO :22 是 PHM10262 的参考序列。SEQ ID NO :23 是 PHM12969 的外部正向引物。SEQ ID NO :24 是 PHM12969 的内部正向引物。SEQ ID NO :25 是 PHM12969 的内部反向引物。SEQ ID NO :26 是 PHM12969 的外部反向引物。SEQ ID NO :27是PHM2204的外部正向引物。SEQ ID NO :28是PHM2204的内部正向引物。SEQ ID NO :29是PHM2204的内部反向引物。SEQ ID NO :30是PHM2204的外部反向引物。
SEQIDNO :31是PHM9905的外部正向引物。SEQIDNO :32是PHM9905的内部正向引物。
SEQIDNO :33是PHM9905的内部反向引物。SEQIDNO :34是PHM9905的外部反向引物。SEQIDNO :35 是 PHM12209 的外部正向引物。SEQIDNO :36 是 PHM12209 的内部正向引物。SEQIDNO :37 是 PHM12209 的内部反向引物。SEQIDNO :38 是 PHM12209 的外部反向引物。SEQIDNO :39 是 PHM13926 的外部正向引物。SEQIDNO :40 是 PHMl3926 的内部正向引物。SEQIDNO :41 是 PHM13926 的内部反向引物。SEQIDNO :42 是 PHM13926 的外部反向引物。SEQIDNO :43 是 PHM10091 的外部正向引物。SEQIDNO :44 是 PHM10091 的内部正向引物。SEQIDNO :45 是 PHM10091 的内部反向引物。SEQIDNO :46 是 PHM10091 的外部反向引物。SEQIDNO :47 是 PHM18211 的外部正向引物。SEQIDNO :48 是 PHM18211 的内部正向引物。SEQIDNO :49 是 PHM18211 的内部反向引物。SEQIDNO :50 是 PHM18211 的外部反向引物。SEQIDNO 51是PHM1695的外部正向引物。SEQIDNO :52是PHM1695的内部正向引物。SEQIDNO :53是PHM1695的内部反向引物。SEQIDNO :54是PHM1695的外部反向引物。SEQIDNO :55是PHM939的外部正向引物。SEQIDNO :56是PHM939的内部正向引物。SEQIDNO :57是PHM939的内部反向引物。SEQIDNO :58是PHM939的外部反向引物。SEQIDNO :59 是 PHM10892 的外部正向引物。SEQIDNO :60 是 PHM10892 的内部正向引物。SEQIDNO :61 是 PHM10892 的内部反向引物。SEQIDNO :62 是 PHM10892 的外部反向引物。SEQIDNO :63是PHM5273的外部正向引物。SEQIDNO :64是PHM5273的内部正向引物。SEQIDNO :65是PHM5273的内部反向引物。SEQIDNO :66是PHM5273的外部反向引物。SEQIDNO 67 是 for PHM497 的外部正向引物。SEQIDNO :68是PHM497的内部正向引物。SEQIDNO :69是PHM497的内部反向引物。
SEQ ID NO :70是PHM497的外部反向引物。SEQ ID NO 71是PHM4483的外部正向引物。SEQ ID NO :72是PHM4483的内部正向引物。SEQ ID NO :73是PHM4483的内部反向引物。SEQ ID NO :74是PHM4483的外部反向引物。SEQ ID NO :75是PHM2015的外部正向引物。
SEQ ID NO :76是PHM2015的内部正向引物。SEQ ID NO :77是PHM2015的内部反向引物。SEQ ID NO :78是PHM2015的外部反向引物。SEQ ID NO :79 是 PHM10326 的外部正向引物。SEQ ID NO :80 是 PHM10326 的内部正向引物。SEQ ID NO :81 是 PHM10326 的内部反向引物。SEQ ID NO :82 是 PHM10326 的外部反向引物。SEQ ID NO :83是PHM9363的外部正向引物。SEQ ID NO :84是PHM9363的内部正向引物。SEQ ID NO :85是PHM9363的内部反向引物。SEQ ID NO :86是PHM9363的外部反向引物。SEQ ID NO :87 是 PHM18162 的外部正向引物。SEQ ID NO :88 是 PHM18162 的内部正向引物。SEQ ID NO :89 是 PHM18162 的内部反向引物。SEQ ID NO :90 是 PHM18162 的外部反向引物。SEQ ID NO 91是PHM9942的外部正向引物。SEQ ID NO :92是PHM9942的内部正向引物。SEQ ID NO :93是PHM9942的内部反向引物。SEQ ID NO :94是PHM9942的外部反向引物。SEQ ID NO :95是PHM5247的外部正向引物。SEQ ID NO :96是PHM5247的内部正向引物。SEQ ID NO :97是PHM5247的内部反向引物。SEQ ID NO :98是PHM5247的外部反向引物。SEQ ID NO :99是PHM3985的外部正向引物。SEQ ID NO :100 是 PHM3985 的内部正向引物。SEQ ID NO :101 是 PHM3985 的内部反向引物。SEQ ID NO :102 是 PHM3985 的外部反向引物。SEQ ID NO :103 是 PHM6226 的外部正向引物。SEQ ID NO :104 是 PHM6226 的内部正向引物。SEQ ID NO :105 是 PHM6226 的内部反向引物。SEQ ID NO :106 是 PHM6226 的外部反向引物。SEQ ID NO :107 是 PHM10262 的外部正向引物。SEQ ID NO :108 是 PHM10262 的内部正向引物。
SEQ ID NO :109 是 PHM10262 的内部反向引物。SEQ ID NO :110 是 PHM10262 的外部反向引物。SEQ ID NO :111 是标记 PHMl2209-20-U 的引物 I。SEQ ID NO :112 是标记 PHM12209-20-U 的引物 2。SEQ ID NO :113 是标记 PHMl2209-20-U 的引物 I。SEQ ID NO :114 是标记 PHM12209-20-U 的引物 2。SEQ ID NO :115 是标记 PHM12209-21-U 的引物 I。·SEQ ID NO :116 是标记 PHM12209-21-U 的引物 2。SEQ ID NO :117 是标记 PHM12209-21-U 的引物 I。SEQ ID NO :118 是标记 PHM12209-21-U 的引物 2。SEQ ID NO :119 是标记 PHM12209-23-U 的引物 I。SEQ ID NO :120 是标记 PHM12209-23-U 的引物 2。SEQ ID NO :121 是标记 PHMl2209-23-U 的引物 I。SEQ ID NO :122 是标记 PHM12209-23-U 的引物 2。SEQ ID NO :123 是标记 PHM10892-3-U 的引物 I。SEQ ID NO :124 是标记 PHM10892-3-U 的引物 2。SEQ ID NO :125 是标记 PHM10892-3-U 的引物 I。SEQ ID NO :126 是标记 PHM10892-3-U 的引物 2。发明详述本发明提供在玉米中的等位基因组合物以及用于鉴定和选择具有增强的镰孢属穗霉菌抗性的玉米植株的方法。提供了以下定义以利于理解本发明。在详述本发明之前，应当了解本发明不受特定实施方案的限制，它当然能够改变。也应当了解本文所用的术语仅是为了描述特定实施方案，而不旨在进行限制。当在本说明书和所附权利要求中使用时，除非内容清楚地表明，例如术语单数和单数形式“一个(a、an、the)”包括复数指代。因此,例如术语“植株(plant、the plant、a plant) ”包括多种植株；这也取决于上下文，使用的术语“植株”也可包括该植株遗传相似或相同的子代；使用的术语“核酸”实际上任选地包括该核酸分子的多个复制；同样地，术语“探针”任选地(并且通常)包括许多相似或相同的探针分子。除非另外说明，核酸是以5'到3'方向从左往右写。说明书中所述的值范围包括限定范围的端值在内并且包括在限定范围内的各个整数或任何非整数的分数。除非另外指明，本文所用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员一般理解相同的含义。虽然与本文所述的那些方法和材料相似或等同的任何方法和材料可用于本发明的测试实践，但本文描述了优选的材料和方法。在本发明的说明书和权利要求中，将根据下文列陈述的定义使用以下术语。术语“等位基因”是指在特定基因座处出现的两个或更多个不同核苷酸序列的其中一个。“扩增子”是被扩增的核酸，例如使用任何可用的扩增方法(例如PCR、LCR、转录等)通过扩增模板核酸而制备的核酸。在核酸扩增的情况下术语“扩增”是其中产生附加拷贝的选择核酸(或其转录形式)的任何过程。一般的扩增方法包括基于多种聚合酶的复制方法，包括聚合酶链反应(PCR)、连接酶介导的方法如连接酶链反应(LCR)、以及基于RNA聚合酶的扩增(例如通过转录)方法。术语“装配”应用于BAC以及它们聚集以形成邻接DNA片段的倾向。BAC基于序列比对“装配”成重叠群，如果BAC进行测序，或者经由它的BAC指纹与其它BAC指纹的比对“装配”成重叠群。可使用因特网上公开可用的Maize Genome Browser找到所述装配。当一个等位基因是影响性状表达的DNA序列或等位基因的一部分或与之连锁时，这个等位基因与这个性状“相关联”。等位基因的存在是性状表达方式的指示。“BAC”或细菌人工染色体是来源于大肠杆菌(Escherichia coli)天然存在的F因子的克隆载体。BAC能够接受DNA序列的较大插入序列。在玉米中，已经将许多BAC或细菌人工染色体装配成重叠群(重叠的邻接基因片段，或“邻接DNA”)，它们每个包含玉米基因 组DNA的较大插入序列。“回交”是指其中杂交子代反复与其中一个亲本回交的过程。在一个回交方案中，“供体”亲本指具有将被渗入的期望基因或基因座的亲本植物。“受体”亲本(使用一次或多次)或“轮回”亲本(使用两次或多次)指将基因或基因座渗入其中的亲本植物。例如参见Ragot,M.等人(1995)标记辅助的回交一个实际的例子,在Techniques et Utilisationsdes Marqueurs Moleculaires Les Colloques,第 72 卷，第 45-56 页，和 Openshaw 等人的(1994)Marker-assisted Selection in Backcross Breeding, Analysis of MolecularMarker Data，第41-43页中。初始杂交产生Fl代；然后术语“BC1”是指轮回亲本的第二次使用，“BC2”是指轮回亲本的第三次使用等等。厘摩(“CM”)是重组频率的量度单位。一 CM等于经过单代杂交在一个基因座上的标记将与在第二基因座上的标记分离的I%的概率。如本文所用，术语“染色体区间”是指位于植株单个染色体上的基因组DNA的邻接线性区域。位于单染色体区间上的遗传因子或基因是物理上连锁的。不特别限定染色体区间的大小。在一些方面，位于单个染色体区间内的基因单元在遗传上连锁，遗传重组距离通常为例如小于或等于20cM，或者小于或等于10cM。即，位于单个染色体区间内的两个基因单元以小于或等于20%或10%的频率进行重组。“染色体”也可称为“连锁群”。术语“互补序列”是指与给定核苷酸序列互补的核苷酸序列，即所述序列相关于碱基配对规律。术语“邻接DNA”是指重叠的邻接基因片段。术语“杂交的”或“杂交”是指经由授粉产生子代的配子融合(例如细胞、种子或植物)。该术语包括有性杂交(一株植物被另一株植物授粉)和自交(自花授粉，例如当花粉和胚珠来自相同植物时)。术语“杂交”是指经由授粉产生子代的配子融合行为。“二倍体”生物(如植物)具有两组(基因组)染色体。“病害抗性”是植物的一种特征，其中该植物避免了由植物-病原体相互作用造成的病害症状，所述植物-病原体相互作用例如玉米和镰孢属轮枝镰孢菌、层出镰孢菌、和/或胶孢镰孢菌之间的相互作用。即，防止了病原体导致植物病害和相关的病害症状，或者，病原体导致的病害症状被最小化或减弱了。本领域的技术人员将会知道，本文所公开的组合物和方法可与本领域中可用的其它组合物和方法一起被用于保护植物免受病原体攻击。“加倍单倍体”是通过单倍体染色体组加倍得到的。认为双单倍体植物是纯合植物。“优良品系”是源自育种并选择优异农学性能的任何品系。“增强的抗性”是指对特定病原体、广谱病原体、或病原体引起的感染具有增强的抗性水平。对真菌病原体轮枝镰孢菌(Fv)、层出镰孢菌(Fp)、和胶孢镰孢菌(Fs)的抗性水平增加，例如造成了“增强”的或提高的真菌抗性。本发明的实施方案将增强或提高植物病原真菌抗性，使得植物对一种或多种真菌病原体的抗性增加，继而增加了对真菌病原体引起的病害的抗性。术语“增强”是指提高、增加、扩大、倍增、提升、上升等。在本文中，本发明的植物描述为由于在本发明基因座存在特异性等位基因而具有对镰孢属轮枝镰孢菌、层出镰孢菌、和胶孢镰孢菌和/或由这些病原体引起的穗霉菌的“增强的抗性”。轮枝镰孢菌、层出镰孢菌、和胶孢镰孢菌是玉米中引起镰孢属穗霉菌(或穗腐病)的真菌病原体。真菌病原体本文还总称为镰孢属。“有利等位基因”是在特定基因座上赋予或有助于农学上所期望的表型，例如增强的镰孢属穗霉菌抗性的等位基因。标记的有利等位基因是与有利表型共分离的标记等位基因。“片段”旨在表示核苷酸序列的一部分。使用本文所公开的方法，片段可用作杂交探针或PCR引物。如本文所用，“真菌抗性”是指与野生型植物的对应性质相比，对真菌病原体增强的抗性或耐受性。效果可以从对病原真菌的影响的耐受性的略微增加(例如部分抑制)，直至使得植物不受病原真菌存在的影响这样的完全抗性。
“镰孢属穗霉菌”有时称为镰孢属穗腐病，是由藤仓赤霉菌复合种，即轮枝镰孢菌、层出镰孢菌、和/或胶孢镰孢菌引起的病害。“基因图谱”是对给定物种中一个或多个染色体(或连锁群)上的基因座间的基因连锁关系的描述，一般以图表或表格形式描述。对于每个基因图谱，基因座之间的距离通过它们的等位基因在种群中共同出现的频率来测量(即它们的重组频率)。可使用DNA或蛋白质标记、或可观察的表型检测到等位基因。基因图谱是对种群、所用标记的类型、以及不同种群间各个标记的多态性潜力作图的产物。基因座之间的遗传距离可因不同的基因图谱而不同。然而，使用共同的标记的不同基因图谱可提供相关联的信息。本领域的普通技术人员可使用共同标记的位点，在每个单独的基因图谱中鉴定标记的位点和其它基因座的位点。基因图谱间的基因座顺序不应改变，虽然很多情况下标记顺序由于例如在不同种群中的检测替代重复基因座的标记、用于标记排序的统计方法间的差异、新的突变或实验室误差而存在小变化。术语“遗传标记”应指基于标记的任何类型的核酸，包括但不限于限制性片段长度多态性(RFLP)、简单重复序列(SSR)、随机扩增多态性DNA(RAPD)、酶切扩增多态性序列(CAPS) (Rafalski 和 Tingey, 1993, Trends in Genetics 9 :275-280)、扩增长度多态性(AFLP) (Vos 等人 1995，cleic Acids Res. 23 :4407-4414)、单核苷酸多态性(SNP)(Brookes, 1999, Gene 234 :177-186)、序列特异性扩增区域(SCAR) (Paran 和 Michelmore,1993，Theor. Appl. Genet. 85 :985-993)、序列标签位点(STS) (Onozaki 等人，2004,Euphytica 138 :255-262)、单链构象多态性(SSCP) (Orita等人，1989，Proc Natl Acad SciUSA 86 :2766-2770)、简单重复序列区间(ISSR) (Blair 等人，1999，Theor. Appl. Genet. 98 780-792)、反转录转座子位点间扩增多态性(IRAP)、反转录转座子微卫星扩增多态性(REMAP) (Kalendar 等人，1999，Theor. Appl. Genet. 98 :704-711)、RNA 裂解产物(如 Lynx 标记)等。“遗传重组频率”是两个基因座之间的交换事件(重组)的频率。在标记和/或减数分裂后性状的分离后可观察到重组频率。“基因组”是指总DNA或整套基 因，由染色体或染色体组携带。术语“基因型”是个体(或个体组)在一个或多个基因座上的基因组成，它与可观察到的性状(表型)形成对照。基因型由一个或多个已知基因座的等位基因限定，个体已经从其亲本中继承了所述基因座。术语基因型可被用于指个体在单个基因座上的基因组成，在多个基因座上的基因组成，或者更一般的，术语基因型可被用于指个体在其基因组中的所有基因的基因组成。“种质”是指个体(例如一个植株)、一组个体(例如一个植物品系、品种或家族)、或来源于一个品系、品种、物种、或培养物的克隆的或从其中得到的遗传物质。种质可为生物或细胞的部分，或者可从生物或细胞中分离得到。种质通常提供遗传物质与特异性分子构成，该分子构成提供生物或细胞培养物的一些或全部遗传性状的物理基础。如本文所用，种质包括可从中生长出新植物的细胞、种子或组织，或者植物部分如叶、茎、花粉、或细胞，它们能够被培养成整个植株。称为“单倍体”的植株具有一组染色体(基因组)。“单倍型”是个体在多个基因座上的基因型，即等位基因组合。单倍型描述的基因座通常是物理上和遗传上连锁的，即在相同染色体片段上。术语“单倍型”可指在特定基因座的多态性，如单标记座位，或者在沿染色体片段的多个基因座上的多态性。本文中“有利的单倍型”是与更高镰孢属穗霉菌抗性值相关联的单倍型，这意味着具有单倍型的植株有较少症状。“不利的单倍型”是与减少的镰孢属穗霉菌抗性值相关联的单倍型。利用例如图5中的标度可获得(抗性)数值。“杂种优势群”包括一组基因型，其与来自不同杂种优势群的基因型杂交时表现良好。(Hallauer 等人(1998)Corn breeding,第 463-564 页。在 G. F. Sprague 和J. ff. Dudley (ed.) Corn and corn improvement中)。将近交系归类为杂种优势群,并且将其进一步细分为杂种优势群内的家族，所述分类基于多个标准如家谱、基于分子标记的关联、以及杂交体组合的性能(Smith等人(1990)，Theor. Appl. Gen. 80 :833-840)。美国最广泛使用的杂种优势群是被称为“Iowa Stiff Stalk Synthetic”(在本文也被称为“坚杆”)和 “Lancaster” 或 “Lancaster Sure Crop”(有时被称为 NSS,或非坚杆)。术语“杂合子”是指其中不同等位基因位于同源染色体上的对应基因座的基因条件。术语“纯合子”是指其中相同等位基因位于同源染色体上的对应基因座的基因条件。术语“杂交体”是指至少两个基因相异的亲本间杂交获得的子代。“杂交”或“核酸杂交”是指互补RNA和DNA链配对以及互补DNA单链配对。
术语“杂交”是指核酸链的互补区域之间形成碱基对。“IBM基因图谱”可指下列图谱中的任ー个IBM、IBM2、IBM2neighbors、IBM2FPC0507、IBM2 2004 neighbors、IBM2 2005 neighbors、IBM2 2005 neighbors frame、IBM22008 neighbors、IBM2 2008 neighbors frame、或在玉米 GDB 网站上的最新版本。IBM 基因图谱基于B73XMol7种群，其中来自初始杂交的子代在构建重组近交系用于作图前随机交配产生多代。更新的版本反映出遗传和BAC作图的基因座的增加以及图谱精度的増大，这是由于整合了获自其它遗传或物理图谱、清理后的数据、或应用新算法的信息。
术语“近交”是指已进行育种以获得遗传同质性的品系。术语“插入缺失(indel) ”是指插入或缺失，其中可将ー个品系相对于第二品系称为插入，或者可将第二品系相对于第一品系称为具有缺失。术语“渗入(introgression或introgressing) ”是指一个遗传基因座的一个期望的等位基因从ー个遗传背景转移到另ー遗传背景。例如在特定基因座的期望等位基因通过渗入、经由相同物种的两个亲本间的有性杂交可被传递到至少ー个子代，其中至少ー个亲本在其基因组中具有期望的等位基因。作为另外一种选择，例如等位基因的传递能够通过两个供体基因组之间的重组而发生，例如在融合原生质体中，其中至少其中一个供体原生质体在其基因组中具有期望的等位基因。期望的等位基因可为例如标记的选择等位基因、QTL、转基因等。在任何情况下，能够将包含期望等位基因的子代与具有期望遗传背景的品系反复回交并选择期望的等位基因以产生固定在选择遗传背景中的等位基因。例如，本文所述的3号染色体基因座和/或4号染色体基因座可渗入对引起穗霉菌的铼孢属和/或穗霉菌本身无抗性或仅有部分抗性的轮回亲本。所述具有渗入基因(多个基因)或基因座(多个基因座)的轮回亲本品系具有对导致穗霉的铼孢属穗霉菌和/或穗霉本身的增强的抗性。当重复“基因渗入”过程两次或更多次时，该过程常被称为“回交”。如本文所用，术语“连锁”用于描述一个标记基因座与另ー个标记基因座或ー些其它基因座(例如铼孢属穗霉菌抗性基因座)相关联的程度。影响表型的分子标记和基因座之间的连锁关系被称作“概率”或“调整的概率”。连锁可表述为期望的限制或范围。例如，在一些实施方案中，当任何两个标记在单次減数分裂基因图谱(基于经历了一轮减数分裂的群体的遗传图谱(例如F2))中的距离小于50、40、30、25、20、或15图谱单位(或cM)时，这两个标记是连锁的(遗传地和物理地)。在ー些方面，限定加括号的连锁范围是有利的，例如介于10和20cM之间，介于10和30cM之间，或者介于10和40cM之间。标记与第二基因座的连锁越紧密，标记对第二基因座的指示效果越好。因此，“紧密连锁的基因座”如标记基因座和第二基因座显示10%或更低，优选约9%或更低，更优选约8%或更低，更优选约7%或更低，更优选约6 %或更低，更优选约5 %或更低，更优选约4 %或更低，更优选约3 %或更低，更优选约2%或更低的基因座内重组频率。在高度优选的实施方案中，关联基因座显示约1%或更低的重组频率，例如约0. 75%或更低，更优选约0. 5%或更低，更优选约0. 25%或更低的重组频率。位于相同染色体上，并且它们间的距离使得两个基因座间的重组发生频率小于 10% (例如约 9%,8%,7%,6%,5%,4%,3%,2%U%>0. 75%,0. 5%,0. 25%,或更低)的两个基因座也称为彼此“接近”。因为ー CM是显示出I %的重组频率的两个标记之间的距离，任何标记与接近的任何其它标记紧密连锁(遗传上和物理上)，例如等于或小于IOcM的距离。在相同染色体上的两个紧密连锁的标记可被彼此定位于9cM、8cM、7cM、6cM、5cM、4cM、3cM、2cM、lcM、0. 75cM、0. 5cM 或 0. 25cM 或更小。术语“连锁不平衡”是指基因座或性状(或者两者都有)非随机地分离。在任一情况下，连锁不平衡意味着相关的基因座沿着一段染色体在物理上足够接近，以便它们以大于随机(即非随机)的频率一起分离(在共分离性状的情况下，产生该性状的基因座彼此足够接近)。显示连锁不平衡的标记被认为是连锁的。连锁基因座在超过50%的情况下共分离，例如约51%至约100%的情况。换句话说，共分离的两个标记具有小于50% (并且根据定义，在相同染色体上分离距离小于50cM)的重组频率。如本文所用，连锁可存在于两个标记或者标记和表型之间。标记基因座可与性状，例如镰孢属穗霉菌抗性相“关联”(连锁)。测量分子标记与表型性状的连锁程度，例如分子标记与表型共分尚的统计学概率。 连锁不平衡最常见地用量度r2测量，它通过Hill，W.G.和Robertson，A, Theor.Appl. Genet. 38 :226-231(1968)所述的公式计算。当r2 = I时，两个标记基因座间存在完全的LD，意味着标记还未进行重组分离并且具有相同的等位基因频率。r2值大于1/3指示足够强的 LD 将被用于作图(Ardlie 等人，Nature Reviews Genetics 3:299-309(2002))。因此，当成对标记基因座间的r2值大于或等于0. 33、0. 4、0. 5、0. 6、0. 7、0. 8、0. 9、或I. 0时，等位基因处于连锁不平衡。如本文所用，“连锁平衡”描述其中两个标记独立地分离的情况，即，在子代中随机分离。认为显示连锁平衡的标记不连锁(无论它们是否位于相同染色体上)。“基因座”是指在染色体上核苷酸、基因、序列、或标记所在的位置。“优势对数(LOD)值”或“L0D 评分” (Risch, Science 255 :803-804(1992))用于区间作图以描述两个标记基因座之间的连锁程度。两个标记间LOD评分为三指示连锁概率比无连锁的概率高1000倍，而LOD评分为二指示连锁概率比无连锁的概率高100倍。大于或等于二的LOD评分可用于检测连锁。“玉米”是指玉米属(Zea mays L. ssp. mays)植物，也称为“玉蜀黍”。术语“玉米植株”包括整个玉米植株、玉米植株细胞、玉米植株原生质体、可从其中再生玉米植株的玉米植株细胞或玉米组织培养物、玉米植株愈伤组织、玉米植株中的完整玉米植株细胞或玉米植株部分，如玉米种子、玉米芯、玉米花、玉米子叶、玉米叶、玉米茎、玉米芽、玉米根、玉米根尖等。“标记”是用作参考点的核苷酸序列或其编码产物(例如蛋白)。对于用于检测重组的标记，它们需要在被监测的种群内检测差异、或多态性。对于分子标记，这意味着由于多核苷酸序列差异(例如SSR、RFLP、FLP、SNP)而存在DNA水平上的差异。基因组可变性可为任何一种起源，例如插入、缺失、复制、重复元件、点突变、重组事件、或转座因子的存在和序列。标记可来源于基因组核苷酸序列或来自表达的核酸(如EST)并且也可被称为用作探针或引物对能够通过使用基于聚合酶链反应方法扩增序列片段的核酸。很多玉米分子标记是本领域已知的，并且被公布于或得自多个来源，例如Maize⑶B因特网资源和Universityof Arizona 运营的 Arizona Genomics Institute 因特网资源。对应于种群成员之间的遗传多态性的标记能够通过本领域已建立的方法进行检测。这些方法包括例如DNA测序、基于PCR的序列特异性扩增方法、限制性片段长度多态性检测(RFLP)、同功酶标记检测、通过等位基因特异性杂交(ASH)进行的多核苷酸多态性检测、植物基因组的扩增可变序列检测、自主序列复制检测、简单重复序列检测(SSR)、单核苷酸多态性检测(SNP)、或扩增片段长度多态性检测(AFLP)。已经建立的方法也已知用于检测表达序列标签(EST)和来源于EST序列的SSR标记以及随机扩增的多态性DNA(RAPD)。“标记等位基因”或者“标记基因座的等位基因”可以指种群中位于标记基因座的多个多态性核苷酸序列的其中ー个，它就标记基因座而言是多态的。“标记辅助选择”(或MAS)是ー种基于标记基因型进行表型选择的方法。“标记辅助反选择”是ー种通过它将标记基因型用于鉴定植物的方法，所述植物将不被选择，使得它们被从育种程序或种植中去除。“标记单倍型”是指在标记基因座的等位基因的组合。“标记基因座”是物种基因组中的特定染色体位点，其中可存在特定标记。“标记基 因座”可用于追踪存在的第二连接基因座，例如编码或有助于表达表型性状的连接基因座。例如标记基因座能够用于监控等位基因在某一基因座的分离，例如QTL或单基因，它们与标记基因座在遗传上或在物理上连锁。“标记探针”是可用于通过核酸杂交鉴定标记基因座存在与否的核酸序列或分子，例如与标记基因座序列互补的核酸分子探针。包含标记基因座的30个或更多邻接核苷酸(“所有或部分”标记基因座序列)的标记探针可用于核酸杂交。作为另外一种选择，在某些方面分子探针指能够区别(即基因型)存在于标记座位上的特定等位基因的任何类型的探针。“核苷酸序列”、“多核苷酸”、“核酸序列”、和“核酸片段”可互換使用，并且指作为单链或双链的RNA或DNA聚合物，任选含有合成的、非天然的或变异的核苷酸碱基。“核苷酸”是构成DNA或RNA聚合物的单体单元，它由嘌呤或嘧啶碱基、戊糖和磷酸基组成。核苷酸(通常以它们的5'-单磷酸形式存在)以其单个字母命名如下“ A”为腺苷酸或脱氧腺苷酸(分别对应RNA或DNA)，“C”表示胞苷酸或脱氧胞苷酸，“G”表示鸟苷酸或脱氧鸟苷酸，“U”表示尿苷酸，“T”表示脱氧胸苷酸，“R”表示嘌呤(A或G)，“Y”表示嘧啶(C或T)，“K”表示G或T，“H”表示A或C或T，“ I ”表示肌苷，并且“N”表示任意核苷酸。术语“表型”、或“表型性状”或“性状”是指生物的ー个或多个性状。表型可用肉眼或者本领域已知的任何其它评价手段观察到，例如显微镜法、生物化学分析、或电装置检测分析法。在一些情况下，表型由单个基因或基因座，即“单基因性状”直接控制。在其它情况下，表型是多个基因的結果。每个具有“PHM”名称并附带数字的标记(无扩展)代表两组引物(外部和内部)，它们被用于套叠的聚合酶链反应以扩增一段特异性的DNA片段。外来的ー组引物用于第一轮PCR，之后内部序列用于对第一轮PCR的产物进行第二轮PCR。这提高了反应的特异性。PHM标记(由两组引物组成)的退火温度为55°C。基因组的“物理图谱”是显示染色体DNA上可辨认的界标(包括基因、标记等)的线性顺序的图谱。然而与基因图谱相比，界标间的距离是绝对的(例如以碱基对测量的或分离的或重叠的邻接基因片段)并且不基于基因重组。“植物”可为整个植株、其任何部分、或来源于植物的细胞或组织培养物。因此，术语“植物”可指代以下任何ー种材料整个植株、植物部分或器官(例如叶片、茎、根等)、植物组织、种子、植物细胞、和/或子代的相同材料。植物细胞是从植物中获取的细胞或来源于从植物中所获取细胞经培养出的细胞。“多态性”是DNA中的变型，它过于常见而不仅仅由突变产生。多态性在种群中必须具有至少1%的频率。多态性可以是单核苷酸多态性或SNP、或插入/缺失多态性，所述插入/缺失多态性本文也称为“插入缺失”。“概率值”或“p值”是表型的特定组合和特定标记等位基因的存在或不存在是否随机的统计学概率。因此，概率评分越低，表型和特性标记将共分离的可能性越大。在某些方面，认为概率评分是“显著的”或“不显著的”。在一些实施方案中，认为随机分离的概率评分为0.05(p = 0.05，或5%的概率)是共分离 的显著性指示。然而，可接受的概率可为小于50% (p = 0. 5)的任何概率。例如，显著概率可小于0. 25、小于0. 20、小于0. 15、小于0. I、小于0. 05、小于0. 01、或小于0. 001。术语“子代”是指杂交产生的后代。“子代植物”由两种植株间的杂交生成。“生产标记”或“生产SNP标记”是已经为高通量目的而开发的标记。生产SNP标记已被开发用于检测特异的多态性，并被设计为在多种化学应用和平台中使用。这里使用的标记名以PHM前缀作为开头以表示“Pioneer Hybrid Marker”,随后是数字,是被设计成针对序列的，其后是”或然后是针对DNA多态性的后缀。标记版本也可接(A、B、C等)，表示被设计成特异多态性标记的版本。术语“数量性状基因座”或“QTL”是指在至少一种遗传背景下(例如在至少一个育种种群中)，具有与表型性状的差异表达关联的DNA区域。QTL与基因或引起所讨论的性状的基因紧密连锁。“参比序列”是用作序列比对基准的限定序列。参考序列通过基因分型在该基因座的多个品系、在序列比对程序(例如Sequencher)、然后获取比对的共有序列而获得。“顶交测试”是通过将每一亲本与相同测试者(通常是纯合品系)杂交而进行的子代测试。测试亲本可为自由授粉的品种、杂交品系或自交系。短语“在严格条件下”是指在该条件下探针或多核苷酸将与特定核酸序列杂交，杂交通常在核酸混合物中进行，但是基本上无其它序列。严格条件是序列依赖性的并将因不同的环境而异。较长序列具体地讲在较高温度下杂交一般来讲，对特定序列而言严格条件是限定的离子强度和PH值下，选择比热解链温度(Tm)低约5-101^ 是(在限定离子强度、pH和核酸浓度的情况下)50%与靶互补的探针平衡杂交到靶序列上(因为存在的靶序列过多，在Tm 50%的探针被平衡占用)的温度。严格条件将是那些如盐浓度小于I. OM钠离子，通常为约0. 01至I. OM钠离子的浓度(或其它盐)，pH为7. 0至8. 3，并且对于短探针(例如10至50个核苷酸)温度为至少30°C，对于长探针(例如超过50个核苷酸)为至少60°C。严格条件也可以通过加入诸如甲酰胺之类的去稳定剂来实现。就选择性杂交或特异性杂交而言，阳性信号是至少两倍于背景，优选10倍于背景杂交。示例性严格条件通常为50%甲酰胺、5x SSC、和1% SDS、在42°C下培养、或5x SSC、I % SDS、在65°C下培养，洗涤条件为0. 2x SSC、和0. 1% SDS、在65°C下。对于聚合酶链反应，对于低严格性扩增，约36°C的温度是典型的，尽管退火温度可在32°C至48°C之间变化，这取决于引物长度。决定杂交参数的附加准则在多个参考文献中提供。
标记的“不利等位基因”是与不利植物表型共分离的标记等位基因，因此提供鉴定能从育种程序或栽培中移除的植物的有益效果。序列比对和同一性百分比可用设计用于检测同源序列的多种比较方法来測定，这些方法包括但不限于LASERGENE 生物信息计算包(DNASTAR Inc.，Madison, WI)的MEGALlGNlM序。除非另外说明，本文提供的序列的多重比对用Clustal V比对方法(Higgins和Sharp, CABI OS. 5 :151-153(1989))采用默认參数(空位罚分=10，空位长度罚分=10)执行。用Clustal V方法进行逐对比对和蛋白质序列的百分比同一性计算的默认參数为 KTUPLE = 1,GAP PENALTY = 3, WINDOW = 5 以及 DIAGONALS SAVED = 5。对于核酸，这些參数为 KTUPLE = 2，GAPPENALTY = 5，WINDOW = 4 以及 DIAGONALS SAVED = 4。用Clustal V程序比对序列后，可以通过查看同一程序中的 “序列距离”表来获得“百分比同一性”和“趋异”值。除非另外说明，本文提供的和申明的同一性百分比和趋异度是以该方式计算的。本文使用的标准重组DNA和分子克隆技术是本领域所熟知的并且在如下文献中有更全面的描述Sambrook, J. , Fritsch, E. F.和 Maniatis, T. Molecular Cloning A Laboratory Manual ;Cold Spring Harbor Laooratory Press :しold Spring Harbor,1989 (下文称为 “Sambrook” )。在详述本发明之前，应当了解本发明不受特定实施方案的限制。也应当了解本文所用的术语仅是为了描述特定实施方案，而不g在进行限制。当在本文和所附权利要求中使用时，除非内容清楚地表明，単数和単数形式的术语包括复数指代。因此，例如“一种植株(plant、the plant、或a plant) ”包括多种植株；取决于上下文,使用的术语“植株”也可包括该植株遗传相似或相同的子代；使用的术语“核酸”任选地包括该核酸分子的多个拷贝；现在来看实施方案镰孢属穗霉菌抗件铼孢属穗霉菌(也称为铼孢属穗腐病)是藤仓赤霉菌复合种，即轮枝铼孢菌、层出铼孢菌、和/或胶孢铼孢菌引起的玉米破坏性病害。与铼孢属穗霉菌抗性相关联的分子标记和分子标记的等位基因的鉴定允许抗性的正选择仅基于子代的遗传组成。本文提供了通过基因组成评价(如使用分子标记及其等位基因评价)来鉴定和选择具有增强的铼孢属穗霉菌抗性的玉米植株的方法。基因作图在很长一段时间里，人们已经认识到与特定表型例如铼孢属穗霉菌抗性相关联的特定基因座可在生物的基因组中作图。有利的是，植物育种人员可使用分子标记通过检测标记等位基因鉴定期望的个体，所述标记等位基因显示与期望表型共分离的统计意义上显著的概率，表现为连锁不平衡。通过鉴定与受关注的性状共分离的分子标记或分子标记簇，植物育种人员能够对合适的分子标记等位基因进行正选择(该过程称为标记辅助选择或MAS)从而迅速选择期望表型。育种人员也可使用此类标记通过计算机设计基因型并实施全基因组选择。本领域熟知的多种方法可用于检测与受关注的性状例如铼孢属穗霉菌抗性共分离的分子标记或分子标记簇。这些方法的基本原理是检测具有显著不同平均表型的供选择基因型(或等位基因)的标记。因此，比较标记基因座之间的供选择基因型(或等位基因)之间的差异大小或差异显著性水平。推断性状基因位于最靠近一个或多个标记的位置，所述标记与基因型差异具有最大的关联性。两种此类用于检测受关注的性状基因座的方法是1)基于种群的关联分析，和2)传统的连锁分析。在基于种群的关联分析中，从具有多个创始者(例如优良育种品系)的已有种群中获取品系。基于种群的关联分析依靠连锁不平衡(LD)的弱化和以下观点在非结构化的种群中，在如此多代随机交配之后，仅有控制受关注性状的基因和与这些基因紧密连锁的标记之间的关联将保存下来。实际上，大多数已有种群具有种群亚结构。因此，通过把个体分配到种群中，使用得自无规分布于基因组的标记的数据，采用结构关联方法有助于控制种群结构，从而最小化由于单个种群(也称为亚种群)内的种群结构带来的不平衡。表型值与在亚群中每个品系的每个标记基因座上基因型(等位基因)进行比较。显著的标记-性状关联指示标记基因座和涉及该性状表达的一个或多个基因座接近。传统的连锁分析使用相同的原则；然而，LD通过从少量创始者产生种群生成。选 择创始者以最大化结构化种群内的多态性水平，并且评价多态性位点与给定表型的共分离水平。许多统计学方法已经用于鉴定显著的标记-性状关联。一种此类方法是区间作图方法(Lander 和 Botstein，Geneticsl21 :185-199 (1989)，其中测试沿基因图谱(IcM 的区间)的许多位点中的每一个位点处控制受关注性状的基因位于该位点的概率。基因型/表型数据用于计算每个测试位点的LOD评分(概率比率的对数)。当LOD评分大于阈值时，存在控制受关注性状的基因位点位于基因图谱上的该位点上的显著证据(它将位于两个特定标记基因座之间)。本发明提供了玉米标记基因座，通过关联分析测定，其展示了其与镰孢属穗霉菌抗性共离析在统计意义上的显著性。这些基因座或附加连锁基因座的检测可用于标记辅助玉米育种程序，以产生具有增强的镰孢属穗霉菌抗性的植物。标记组合物本文已鉴定与玉米镰孢属穗霉菌抗性相关联的标记，和涉及在玉米植株的种质资源中检测一个或多个与增强抗性相关的基因的存在的方法。玉米植株可为杂交的或近交的，并且可为刚杆杂种优势群。对于3号染色体上鉴定的QTL，所述标记基因座能从表I中提供的任何标记基因座中选择，包括 PHM12969、PHM1695、PHM12209、PHM2204、PHM9905、PHM13926、PHM10091 和PHM18211 ;表5中提供的任何一个单核苷酸多态性标记基因座，包括位于PHM12209. 11的“C”、位于 PHMl2209. 20 的 “T”、位于 PHMl2209. 21 的 “C”、位于 PHM12209. 22 的 “G”、位于PHM12209. 23 的 “C”、位于 PHM9905. 11 的 “A”、位于 PHM9905. 13 的 “T”、位于 PHM9905. 35的 “G”、位于 PHM2204. 88 的 “T”、位于 PHM2204. 105 的 “A”、位于 PHM13926. 25 的 “C”、位于PHM13926. 27 的 “G”、位于 PHM13926. 28 的 “G”，和位于 PHM13926. 32 的 “G”，以及与这些标记连锁的任何其它标记(连锁标记能从Maize⑶B resource中测定)。对于4号染色体上鉴定的QTL，所述标记基因座能从表2中提供的任何标记基因座中选择，包括 PHM2015，PHM10326, PHM497, PHM4483, PHM5273, PHM939, PHM10892,PHM9363, PHM18162, PHM9942, PHM5247, PHM3985, PHM6226，和 PHM10262 ;表6 中提供的任何一个单核苷酸多态性标记基因座，包括位于PHM10892. 3的“C”、位于PHM939. 47的“G”和位于PHM939. 48的“A” ；以及与这些标记连锁的任何其它标记(连锁标记能从Maize⑶Bresource 中测定)。QTL的物理图谱位置基因元件或位于单个染色体上的基因组DNA的邻接线性片段上的基因是物理上连锁的。对于3号染色体上鉴定的QTL，具有最大物理距离、仍与受关注的表型，镰孢属穗霉菌抗性相关联的两个标记为PHM12969和PHM18211。PHM12969位于BAC c0437dl8、c0094gl8 和 b0219jl4 上。PHM18211 位于 BAC c0482dl9 和 c0060e22 上。在玉米物理图谱上，这两处BAC区域划定了镰孢属穗霉菌抗性QTL。(图I)。可与介于以下序列之间并包括以下序列的连续DNA装配的任何多核苷酸可覆盖与镰孢属穗霉PHM12969菌抗性性状相关联的标记基因座SEQ ID NO 1(参考序列)或基于Clustal V比对方法与SEQ ID NO : I具有95%同一性的核苷酸序列，和SEQ ID NO :7(PHM18211的参考序列)，或基于ClustalV比对方法与SEQ ID NO 7具有95%同一性的核苷酸序列。图I显示这些已测序BAC在物 理图谱上的排列，其组成了介于并包含PHM12969和PHM18211的连续拉伸的DNA。对于4号染色体上鉴定的QTL，具有最大物理距离、仍与受关注的表型，镰孢属穗霉菌抗性相关联的两个标记为PHM10892和PHM10262。PHM10892位于BAC b0269h08上，而PHM10262位于BAC c0237f22和c0069i21上。在玉米物理图谱上，这两处BAC区域划定了镰孢属穗霉菌抗性QTL(图2)可与介于以下序列之间并包括以下序列的连续DNA装配的任何多核苷酸可覆盖与镰孢属穗霉菌抗性性状相关联的标记基因座SEQ ID N010(PHM10892的参考序列)或基于Clustal V比对方法与SEQ ID NO : 10具有95%同一性的核苷酸序列，和SEQ ID NO 22 (PHM10262的参考序列)，或基于Clustal V比对方法与SEQ ID NO :22具有95%同一性的核苷酸序列。图2显示已测序的BAC在物理图谱上的排列，其组成了介于并包括PHM10892和PHM10262的连续拉伸的DNA。连锁关系连锁的常见量度是性状共分离的频率。这可以共分离百分比(重组频率)表示，或者以厘摩(CM)表示。CM是基因重组频率的量度单位。一 CM等于由于在一代中的交换导致的在一个基因座上的性状将与在另一个基因座上的性状分离的概率为1% (意味着性状99%的情况下共分离)。因为染色体距离与性状间交换事件的频率大约成比例，有与重组频率关联的近似物理距离。标记座位本身是性状，并且在分离期间能够通过跟踪标记座位、根据标准连锁分析进行评价。因此，一 CM等于经过单代杂交的标记基因座将与在另一个基因座分离的1%的概率。标记距离控制受关注性状的基因越近，则标记作为期望性状的指示越有效和有利。紧密连锁的基因座显示约10%或更低，优选地约9%或更低，更优选地约8%或更低，更优选地约7 %或更低，更优选地约6 %或更低，更优选地约5 %或更低，更优选地约4 %或更低，更优选地约3%或更低，更优选地约2%或更低的基因座间交换频率。在高度优选的实施方案中，相关基因座(例如标记基因座和祀基因座)显不约I %或更低的重组频率，例如约0. 75%或更低，更优选地约0. 5%或更低，或更优选地约0. 25%或更低的重组频率。因此，所述基因座分开距离为约 10cM、9cM、8cM、7cM、6cM、5cM、4cM、3cM、2cM、lcM、0. 75cM、0. 5cM或0. 25cM或更低。换句话说，位于相同染色体上，并且它们间的距离使得两个基因座间的重组发生频率小于10% (例如约9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0· 75%,O. 5%,O. 25%、或更低)的两个基因座称为彼此“接近”。尽管特定标记等位基因可显示与铼孢属穗霉菌抗性表型共分离，但重要的是注意到标记基因座不一定是负责表达铼孢属穗霉菌抗性表型。例如，不要求标记多核苷酸序列是赋予增强的铼孢属穗霉菌抗性的基因的部分(例如是基因开放阅读框的部分)。特定标记等位基因与增强的铼孢属穗霉菌抗性表型的关联，是由于在等位基因从中起源的祖先玉米品系中，标记等位基因和等位基因之间的最初“相引”相连锁。最后通过反复重组，标记和基因座间的交換事件能够改变这种取向。正是因为这个原因，有利标记等位基因可根据存在于耐受性亲本中的相连锁发生改变，所述耐受性亲本用于制备分离种群。这不改变可使用标记监控表型分离的事实。它仅仅改变在给定分离种群中认为哪个标记等位基因是有利的。对于3号染色体上的QTL，表I和5中的鉴定了的标记，以及任何ー个与其距离50cM以内的标记,可用于预测玉米植株的铼孢属穗霉菌抗性。这包括任何一个与其PHM 标记距离 50cM 以内的标记，PHM12969、PHM1695、PHM12209、PHM2204、PHM9905、PHM13926、PHM10091、和PHM18211，并与单核苷酸多态性标记距离在50cM以内，位于PHM12209. 11的“C”、位于 PHMl 2209. 20 的“T”、位于 PHMl 2209. 21 的“ C”、位于 PHM12209. 22 的“G”、位于PHM12209. 23 的“C”、位于 PHM9905. 11 的“A”、位于 PHM9905. 13 的“T”、位于 PHM9905. 35的“G”、位于 PHM2204. 88 的“T”、位于 PHM2204. 105 的“A”、位于 PHM13926. 25 的“C”、位于PHM13926. 27 的 “G”、位于 PHM13926. 28 的 “G” 和位于 PHM13926. 32 “G，，。对于4号染色体上的QTL，表2和6中的鉴定了的标记，以及任何ー个与其距离50cM以内的标记，可用于预测玉米植株的铼孢属穗霉菌抗性。这包括任何一个与其PHM 标记距离 50cM 以内的标记，PHM2015、PHM10326、PHM497、PHM4483、PHM5273、PHM939、PHM10892、PHM9363、PHM18162、PHM9942、PHM5247、PHM3985、PHM6226 和 PHM10262、以及距离在50cM以内的任何标记位于PHM10892. 3的“C”、位于PHM939. 47的“G”和位于PHM939. 48的“ A，，。染色体区间提供与铼孢属穗霉菌抗性相关联的染色体区间。本领域熟知的多种方法可用于鉴定染色体区间。扩展此类染色体区间的边界以包含将与ー个或多个QTL连锁的标记。换句话说，扩展染色体区间使得位于区间内的任何标记(包括限定区间边界的末端标记)可用作铼孢属穗霉菌抗性标记。每个区间包含至少ー个QTL，此外甚至可包含ー个以上的QTL。相同区间中非常接近的多个QTL可搅乱特定标记与特定QTL的关联，因为ー个标记可显示与ー个以上的QTL连锁。相反地，例如如果非常接近的两个标记显示与期望表型性状共分离，有时分不清楚是否那些标记中的每ー个鉴定相同QTL或两个不同的QTL。无论如何，完成或实施本发明不需要了解在特定区间中有多少QTL。如下所述区间示出了与铼孢属穗霉菌抗性共分离的标记簇。所述标记簇位于染色体上一个相对小的区域中，表明在这些染色体区域中存在ー个或多个QTL。绘制QTL的区间包括了与铼孢属穗霉菌抗性共分离的标记。区间由多个标记的末端限定，其中区间包括了在区间内作图的标记以及限定了末端的标记。由限定了区间的端点的末端标记描述的区间，将包括末端标记和任何位于这段染色体区域的标记，这些标记是目前已知的或未知的。
对于3号染色体上的QTL，一段间隔可被和限定并且包括PHM12969和PHM18211。对于4号染色体上的QTL，区间可被和限定并且包括PHM10892和PHM10262。任何一个未予位于这些区间的标记能用作镰孢属穗霉菌抗性标记。染色体区间也可通过与QTL标记连锁(表现出连锁不平衡)的标记限定，r2是关联性研究中连锁不平衡(LD)的常见量度。如果在3号染色体上位于PHM12969和PHM18211的区间中的标记基因座与3号染色体上另一个靠近的标记基因座之间的r2LD值大于1/3 (Ardlie 等人，Nature Reviews Genetics 3 :299-309 (2002)),这个基因座与另一个就是连锁不平衡的。标记等位基因和单倍型组合本发明的标记也可为一个或多个标记基因座上的等位基因的组合。下面描述的等位基因能组合用于鉴定和选择具有增强的镰孢属穗霉菌抗性的玉米植株。 本文中，已经鉴定了位于3号染色体上QTL的有利的单核苷酸多态性等位基因(即与增强的镰孢属穗霉菌抗性相关的)，包括位于PHM12209. 11的“C”、位于PHM12209. 20 的“T”、位于 PHM12209. 21 的“C”、位于 PHM12209. 22 的“G”、位于 PHM12209. 23的 “C”、位于 PHM9905. 11 的 “A”、位于 PHM9905. 13 的 “T”、位于 PHM9905. 35 的 “G”、位于PHM2204. 88 的 “T”、位于 PHM2204. 105 的 “A”、位于 PHM13926. 25 的 “C”、位于 PHM13926. 27的 “G”、位于 PHM13926. 28 的 “G” 和位于 PHM13926. 32 的 “G”。本文中，已经鉴定了位于4号染色体上QTL的有利的单核苷酸多态性等位基因(即与增强的镰孢属穗霉菌抗性相关联)，包括位于PHM10892. 3的“C”、位于PHM939. 47的“G” 和位于 PHM939. 48 “A，，。本文中，技术人员将预期本文鉴定的3号和4号染色体上的标记中和周围可能有额外的多态性位点，其中一个或多个多态性位点与单体型的一个或多个多态性位点的等位基因存在连锁不平衡(LD)。在不同多态性位点上的两个特定等位基因据称处于LD，如果在其中一个位点上存在等位基因，则易于推测在相同染色体上的其它位点上存在等位基因(Stevens, Mol. Diag. 4 :309-17(1999))。标记辅助诜择分子标记可用于许多植物育种应用中(例如参见Staub等人(1996)Hortscience31 :729-741 ；Tanksley (1983)Plant Molecular Biology Reporter. I :3-8)。受关注的主要领域之一是使用标记辅助选择(MAS)增加回交和基因渗入的效率。展示出与影响期望表型性状的基因座连锁的分子标记提供了在植物种群中选择性状的有用工具。当表型难以测定(例如很多病害抗性性状)，或表型发生在植物发育的晚期(例如籽粒特征)时，尤其如此。由于DNA标记测定比田间表型分析更省力并且占用的物理空间更小，可测定更大的种群，增加了发现具有从供体品系移动至受体品系的靶片段的重组体的概率。连锁越紧密，标记越有用，这是因为重组不太可能发生于标记和引起性状的基因之间，所述重组可导致假阳性。由于需要双重组事件，侧接标记减少了假阳性选择发生的概率。理想情况是基因本身具有标记，使得标记和基因之间的重组不能发生。此类标记称为“完美标记”。当基因通过MAS渗入时，不仅引入了基因而且引入了侧接区域(G印ts. (2002).Crop Sci ；42 =1780-1790) 0这被称为“连锁累赘”。在供体植物与受体植物极不相关的情况下，这些侧接区域携带可编码农学上不良性状的附加基因。该“连锁累赘”也可导致产量減少或其它负面农学特性，即便与优良玉米品系回交多个周期后。有时这也被称为“产量累赘”。侧接区域的大小可通过附加的回交而减小，虽然这并不总是成功的，因为育种人员不能控制该区域或重组断点的大小(Young等人(1998) Genetics 120 :579-585)。在经典育种中，通常只是单凭偶然因素选取有助于减小供体片段大小的重组(Tanksley等人(1989).Biotechnology :257-264)。即使在此类回交次数达20次后，可预期找到的仍与所选基因连锁的供体染色体还是具有相当大的片段。然而如果使用标记的话，就可能选取那些在受关注的基因附近经历了重组的稀有个体。在150株回交植物中，至少ー株植物经历交換有95%的概率，所述交换在基于单次減数分裂图距的IcM基因内进行。标记使得能够明确鉴定这些个体。对于300株植物的一次附加回交，在基因另ー侧的IcM单次减数分裂图距内有95%的交换概率，从而产生在基于单次減数分裂图距小于2cM的靶基因附近的片段。用 标记时在两代就可实现，而不用标记时则需要平均100代(參见Tanksley等人，上文)。当基因的确切位置已知时，围绕基因的侧接标记可用于在不同的种群大小中对重组进行正选择。例如，在更小的种群中，预期重组可进一步远离基因，因此需要更远端的侧接标记来检测重组。包含增强密度的公开玉米标记的玉米基因组整合连锁图谱的可用性促进了玉米基因作图和MAS。參见，如IBM2Neighbors图谱，该图谱可在Maize⑶B网站上在线获取。具体实施MAS的关键步骤单元有(i)界定种群，其中将測定标记-性状的关联性，这将界定分离的种群、或无规的或有结构的种群；(ii)监控性状相关多态性标记的分离或关联情况，并用统计学方法决定连锁或关联；(iii)基于统计分析的结果界定ー组所期望的标记；并(iv)使用和/或外推这个信息到当前的育种种质组合中，使得基于标记的选择决定得以实现。本公开中描述的标记，以及其它标记类型例如SSR和FLP，可用于标记辅助选择方案。SSR标记可以被定义为6个bp或更短的长度相对短串联重复的DNA(Tautz (1989)Nucleic Acid Research 17 :6463-6471 ；ffang 等人(1994)Theoretical and AppliedGenetics,88 :1_6)多态性提高由于很可能在DNA复制期间由滑落引起的重复单元数的改变(Levinson 和 Gutman (1987)Mol Biol Evol 4:203-221)。重复长度的变化可通过在保守的非重复侧接区域设计PCR引物来检测(Weber和May (1989)Am J Hum Genet. 44 388-396)。SSR非常适于作图和MAS，因为它们是多等位基因的、共显性的、可再现的，并且适合高通量自动化(Rafalski等人(1996)在植株中生成和使用DNA。In Non-mammaIiangenomic analysis a practical guiae. Academic press,,5.135] ノ。可生成各种类型的SSR标记，并且来自抗性品系的SSR特征图可通过扩增产物的凝胶电泳获取。标记基因型的评分基于扩增片段的大小。由位于Saint-Jean-sur-Richelieu, Quebec, Canada 的 DNA Landmarks 依据合同规定向公众提供玉米的SSR服务。也可生成各种类型的FLP标记。最常见地，扩增引物用于生成片段长度多态性。此类FLP标记在很多方面类似于SSR标记，不同的是由引物扩增的区域通常不是高度重复区域。通常由于插入或缺失，扩增区域或扩增子在种质间还具有足够的可变性，使得由扩增引物产生的片段能够在多态性个体中区分开，并且已知此类插入缺失常常发生于玉米中(Bhattramakki 等人(2002)，Plant Mol Biol48, 539-547 ；Rafalski(2002b)，supra)。
SNP标记检测单碱基对核苷酸取代。在所有分子标记类型当中，SNP是最多的，因此具有提供最高基因图谱分辨率的能力(Bhattramakki等人2002Plant MolecularBiology 48:539-547)。SNP可在甚至比SSR更高的通量水平上进行检测，即以所谓的“超高通量”模式进行检测，因为它们不需要大量DNA，并且可直接进行自动化检测。SNP也具有成为相对低成本体系的前景。这三个因素一起使得SNP对在MAS中的应用具有高度吸引力。多种方法可用于SNP基因分型，包括但不限于杂交、引物延伸、寡核苷酸连接、核酸酶酶解、微测序和编码球。此类方法已经被以下文献叙述Gut(2001)Hum Mutat 17第475-492 页；Shi (2001)Clin Chem 47，第 164-172 页；Kwok(2000)Pharmacogenomics 1，第95-100页；Bhattramakki和Rafalski (2001)植株中开发和应用单核苷酸多态性标记。In :R. J. Henry, Ed, Plant Genotyping The DNA Fingerprinting of Plants, CABIPublishing, Wallingford。多种可商购获得的技术利用这些方法和其它方法检查SNP, 包括 Masscode. TM. (Qiagen), Invader. RTM. (Third Wave Technologies), SnapShot.RTM. (Applied Biosystems), Taqman. RTM. (Applied Biosystems)以及 Beadarrays.TM. (Illumina)。许多一起在单条序列内、或跨越连锁序列的SNP可用于描述任何特定基因型的单倍型(Ching 等人(2002)，BMC Genet. 3 :19 ；Gupta 等人 2001 ；Rafalski (2002b)，PlantScience 162 :329-333)。单倍型可比单个的SNP提供更多信息，并且可描述较多的任何特定基因型。例如，单个的SNP可以是具有镰孢属穗霉菌抗性的特定品系或品种的等位基因“T”，但是等位基因“T”也可发生在用于轮回亲本的玉米育种种群中。在这种情况下，单倍型例如在连锁SNP标记上的等位基因组合可提供较多的信息。一旦已经将唯一的单倍型分配给供体染色体区域，该单倍型可用于种群或其任何亚群以确定是否个体具有特定基因。参见例如W02003054229。使用本领域普通技术人员已知的那些自动化高通量标记检测平台使得这一方法高效和有效。由于插入/缺失多态性的存在，许多PHM标记已经可用作FLP标记用来选择3号和/或4号染色体上的基因座。PHM标记的引物也可用于将这些标记转化为在相同区域内的SNP或其它结构上类似或功能上等同的标记(SSR、CAP、插入缺失等)。Rafalski (2002a)描述了一个非常有成效的 SNP 的转换方法Current opinion in plant biology 5(2) :94-100和也Rafalski (2002b)Plant Science 162:329-333。使用PCR时，引物用于扩增来自个体(优选地自交体)的DNA片段，所述个体代表受关注种群的多样性。将PCR产物在一个或两个方向直接测序。比对所得的序列并且鉴定多态性。多态性不限于单核苷酸多态性(SNP)，还包括插入缺失、CAPS、SSRjP VNTR(可变数目串联重复)。具体地讲，针对本文所述的精细图谱信息，人们可易于使用本文提供的信息来获取在通过本公开列出的引物扩增的区域内的附加多态性SNP (和其它标记)。可将在所述图谱区域内的标记杂交到BAC或其它基因组文库，或与基因组序列电子比对，以便在与所述标记的基本近似的位置处查找新序列。除了如上所述的SSR、FLP和SNP以外，其它类型的分子标记也广泛使用，包括但不限于表达序列标签(EST)、来源于EST序列的SSR标记、随机扩增多态性DNA (RAPD)、和其它基于核酸的标记。在一些情况下，同功酶特征图和连锁的形态学特征也可间接用作标记。尽管它们不直接检测DNA差异，它们通常也受特定的遗传差异影响。然而，检测DNA变异的标记远远多于同功酶或形态学标记并且更具多态性(Tanksley(1983)Plant Molecular BiologyReporter I :3_8)。序列比对或重叠群也可用于查找本文列出的特定标记的上游或下游序列。这些新序列靠近本文所述的标记，然后被用于发现和开发功能等同的标记。例如将不同的物理和/或基因图谱进行比对以定位等同标记，所述标记不在所述公开中描述，但是位于相似区域内。这些图谱可在玉米物种中，或者甚至包括已经与玉米进行了遗传上或物理上的比对的其它物种，如大米、小麦、大麦或高粱。一般来讲，MAS使用多态性标记，这些标记已被鉴定为具有与铼孢属穗霉菌抗性共分离显著的可能性。此类标记被推断在图谱上接近赋予铼孢属穗霉菌抗性的单个或多个基因，并被考虑作为期望性状的指示，故被定义为QTL标记。植株用于测试QTL标记中有利等位基因的存在，并且在ー个或多个基因座包含期待的基因型的植株预期将传递期望的基因型以及表型给它们的子代。这意味着鉴定具有增强的铼孢属穗霉菌抗性的玉米植株，可通过鉴定具有本文描述的任何一个标记基因座的一个特异等位基因，其中包括3号染色体基因座位，PHM12969、PHM1695、PHM12209、PHM2204、PHM9905、PHM13926、PHM10091 和 PHM18211,以及 4 号染色体基因座，PHM2015、PHM10326、PHM497、PHM4483、PHM5273PHM939、PHM10892、PHM9363、PHM18162、PHM9942、PHM5247、PHM3985、PHM6226 和 PHM10262。此外，本文鉴定的有利的等位基因(即与增强的铼孢属穗霉菌抗性相关联的)包括位于 PHMl 2209. 11 的 “C”、位于 PHMl 2209. 20 的 “T”、位于 PHMl 2209. 21 的 “C”、位于PHM12209. 22 的“G”、位于 PHM12209. 23 的“C”、位于 PHM9905. 11 的“A”、位于 PHM9905. 13的 “T”、位于 PHM9905. 35 的 “G”、位于 PHM2204. 88 的 “T”、位于 PHM2204. 105 的 “A”、位于 PHMl3926. 25 的“C”、位于 PHMl3926. 27 的“G”、位于 PHMl3926. 28 的“G”、“G” 位于PHM13926. 32、位于 PHM10892. 3 的 “C”、位于 PHM939. 47 的 “G” 和位于 PHM939. 48 的 “A”。本文所述QTL区间可用于MAS以选择展示增强的铼孢属穗霉菌抗性的植株。相似地，所述QTL区间也可被用于反选择对铼孢属穗霉菌易感的植株。Fusarium任何在QTL区间内作图的标记(包括间隔的末端)均可用于此目的。3号染色体区间被限定和包含PHM12969和PHM18211，而4号染色体区间被下列限定并包含下列PHM10892和PHM10262。可选择在3号和/或4号染色体区间具有期望的标记等位基因的植株。与铼孢属穗霉菌抗性密切相关的QTL标记在标记辅助选择中尤其有用。单倍型也可用于MAS中，以将增强的铼孢属穗霉菌抗性引入敏感玉米品系或品种。与增强的铼孢属穗霉菌抗性相关联的3号染色体单倍型可包含下列中的至少ー个:位于 PHMl 2209. 11 的“ C”、位于 PHM12209. 20 的“T”、位于 PHMl 2209. 21 的“ C”、位于PHM12209. 22 的“G”、位于 PHM12209. 23 的“C”、位于 PHM9905. 11 的“A”、位于 PHM9905. 13的“T”、位于 PHM9905. 35 的“G”、位于 PHM2204. 88 的“T”、位于 PHM2204. 105 的“A”、位于PHM13926. 25 的“C”、位于PHM13926. 27 的“G”、位于PHM13926. 28 的“G”和位于 PHM13926. 32的“G”，或任何其它与本文鉴定的增强的铼孢属穗霉菌抗性相关联的标记等位基因连锁或相关联的标记等位基因。与增强的铼孢属穗霉菌抗性相关联的4号染色体单倍型可包含下列中的至少ー个位于PHM10892. 3，的“C”，位于PHM939. 47的“G”和位于PHM939. 48的“A”，或任何其它与本文鉴定的增强的铼孢属穗霉菌抗性相关联的标记等位基因连锁或相关联的标记等位基因。
任何与单倍型连锁不平衡的等位基因包含下列中的至少一个位于PHM12209. 11的 “C”、位于 PHM12209. 20 的 “T”、位于 PHMl2209. 21 的 “C”、位于 PHM12209. 22 的 “G”、位于 PHM12209. 23 的“C”、位于 PHM9905. 11 的“A”、位于 PHM9905. 13 的“T”、位于 PHM9905. 35的 “G”、位于 PHM2204. 88 的 “T”、位于 PHM2204. 105 的 “A”、位于 PHM13926. 25 的 “C”、位于PHM13926. 27的“G”、位于PHM13926. 28的“G”和位于PHM13926. 32的“G”、或单倍型包含下列中的至少一个位于PHM10892. 3的“C”，位于PHM939. 47的“G”和位于PHM939. 48的“A”也可用于MAS中以选择具有增强的镰孢属穗霉菌抗性的植株。玉米棺株本文中提出的组合物和方法可被用于鉴定和/或从玉米属中选择(更具体地讲，玉米(Zea mays L. ssp. Mays),具有增强的镰孢属穗霉菌抗性的植株。所述植株可为杂交，近交，部分近交，或定义或未定义的种群成员。它们可位于任何杂种优势群中，包括但不限于坚杆群和非坚杆群。
因此，用本文中提出的方法中的任一种鉴定和/或选择的玉米植株也是本发明的特征。
实施例提供以下实施例以示出受权利要求书保护的本发明，但本发明不受以下实施例的限制。应当理解本文所述的实施例和实施方案仅用于例证性的目的，并且本领域的技术人员将认识到在不脱离本发明实质或所附权利要求范围的情况下可改变多种试剂或参数。实施例IQTL检测关联作图分析关联作图策略为进行鉴定玉米中与镰孢属穗霉菌抗性相关联的标记。在该关联分析中，通过对4000-10000个基因(基因座)进行DNA测序来分析475个玉米品系的集合。所述品系包括优良种质、可商购获得的栽培变种、以及其它公开的品种。表型得分使用图5中的FUSERS标度获得。每一种品系的平均得分是基于多个地区和多年积累的数据。使用标准关联作图方法进行基于结构的关联分析，其中使用标记数据控制种群结构。使用基于模型的集分析软件，由Pritchard等人(遗传学155 =945-959(2000))开发的结构，同时使用两百个标记的880个玉米优良近交系的单倍型数据评价混合系数并且将近交系分配成多个亚群。这降低了假阳性的发生概率，假阳性可能由对关联作图统计的群体结构效应引发。使用Kuiper统计测试两个分配是否相同，并且测试给定标记与在给定亚群中的单倍型和表型之间的关联(Press等人，Numerical Recipes in C,第二版，CambridgeUniversity Press, NY(2002))。显著的标记-性状关联度的峰值被确定位于坚杆群中的3号染色体上(图3)。表I提供了与镰孢属穗霉菌抗性表型显著相关联的玉米标记的列表，P值为< 0. 001水平，代表内部产生的遗传图谱上的间隔为 4cM。在内部产生的基因图谱上，此染色体区间由位于224. 43 的 PHM12969(p 值=1.4X10’ 和位于 228. 76 的 PHM1695(p 值=1.28XKT4)划定并包括它们。最相关的标记是位于226. 71的PHM2204，其p值为2. 05X 10_6。cM中给出了位点，零点是染色体起始处的第一(距着丝点最远端)已知标记。表I中的图谱位置不是绝对的，而是提供基于内源基因图谱(PHB)的图谱位置预测。表I :在坚杆亚种群中的3号染色体的标记与槺孢属穗霉菌抗性显著地相关联，P值为<0. 001。
PHB图谱上的相
标记名称对图谱位置(CM) P值参考序列引物序列
PHM12969224.431.40E-04 SEQ ID N O: I SEQ ID NOs:23-26
PHM2204226 712.05E-06 SEQ ID NO:2 SEQ ID N0s:27-30
PHM9905226.831.47E-05 SEQ ID NO:3 SEQ ID NOs:3l-34
PHM12209226.956.26E-05 SEQ ID NO:4 SEQ ID NOs:35-38
PHM13926227.974.94E-06 SEQ ID NO:5 SEQ ID NOs:39-42
PHMI009I227.972.60E-04 SEQ ID NO:6 SEQ ID NOs:43-46
PHM1821 I228.298.20E-04 SEQ ID NO:7 SEQ ID N0s:47-50
PHM1695228.761.28E-04 SEQ ID NO:8 SEQ ID NOs:5I-54显著的标记-性状关联的峰值也被确定位于相同的坚杆群的4号染色体上(图4)。表2提供了与铼孢属穗霉菌抗性表型显著地相关联的玉米标记的列表，P值为< O. 001水平，代表内部产生的遗传图谱上的间隔为 2cM。在内部产生的基因图谱上，此染色体区间由位于 198. 06 的 PHM939(p 值=7. 00X10’ 和位于 201. 25 的 PHM10262(p 值=1.38X10-4)划定和包括它们。最相关的标记是PHM10892，位于198. 06，p值为4. 44 X 10'cM中给出了位点，零点是染色体起始处的第一(距着丝点最远端)已知标记。表2中的图谱位置不是绝对的，而是提供基于内部产生的基因图谱(PHB)的图谱位点预测。表2 :在坚杆亚种群中P ( O. 001的4号染色体的标记与槺孢属穗霉菌抗性显著地相关联。
PHB图谱上的相
标记名称对图谱位置(CM) P值参考序列引物序列
PHM 10892丨 98.064.44E-07 SEQ ID NO: IO SEQ ID NOs:59-62
PHM939丨98.067.00E-05 SEQ ID NO:9 SEQ ID NOs:55-58
PHM5273198.272.06E-04 SEQ ID NO: I I SEQ ID NOs:63-66
PHM497198.541.16E-04 SEQ ID NO: 12 SEQ ID N0s:67-70
PHM4483199.671.00E-03 SEQ ID NO: 13 SEQ ID NOs:71-74
PHM2015199.723.12E-04 SEQ ID NO: 14 SEQ ID NOs:75-78
PHM10326199.788.80E-04 SEQ ID NO: 15 SEQ ID NOs:79-82
PHM9363丨99.785.20E-04 SEQ ID NO: 16 SEQ ID NOs:83-86
PHM18162200.629.20E-04 SEQ ID NO: 17 SEQ ID N0s:87-90
PHM9942200.882.96E-04 SEQ ID NO: 18 SEQ ID NOs:91-94
PHM5247200.932.40E-04 SEQ ID NO: 19 SEQ ID NOs:95-98
PHM3985201.061.78E-04 SEQ ID N0:20 SEQ ID N0s:99-I02
PHM6226201.259.20E-04 SEQ ID NO:21 SEQ ID N0s:103-106
PHM10262201.251.38E-04 SEQ ID NO:2 SEQ ID NOs: 107-1 10
145个品系通过基于模型的集分析软件、坚杆亚种群结构分配，其中对其镰孢属穗霉菌抗性QTL进行了检测。实施例2物理图谱位置每个PHM标记的共有序列与由公开玉米已测序的BAC组成的数据库进行了比对。表3和4显示被确定为包含该标记的每个标记的BAC，从而描绘物理图谱区域，该区域定位有 QTL0表3 :染色体3PHM标记的BAC hits
标记名称BAC hits
PHM 12969c0437dI8, c0094gl8,
b02i9jl4
PHM 1695c0467nl0
PHM 12209c0467nl0, b0l84dl7
PHM2204c0289fl 6, bO! 84d 17
PHM9905 c0289fl 6, bO! 84d 17 PHM 13926 b0444e07
PHMI0091c0146b03, b0444e07
PHM 182 丨丨c0482d 19, c0060e22表4 :染色体4PHM标记的BAC命中
标记名称BAC命中
PHM10892b0269h08
PHM939c0184J24
PHM5273c0184j24
PHM497c0516gl0
PHM4483 c0239c09, c0215i 19 PHM2015b0185p07
PHM10326b0194j21
PHM9363b0408e05
PHM 18162 c0067j 19, b0408e05PHM9942c0197C3
PHM5247 c05 10I<02, cO I 12k06PHM3985 c,0483h 丨 8，b0200m05PHM6226C0237G2
PHM 10262 c()237f22, c0069i21实施例3113个坚杆系的单倍型分析在实施例2的相关分析中，在3号染色体区域中的四个最相关的标记是PHM12209、PHM9905、PHM2204和PHM13926。与有利的或不利的镰孢属穗霉菌抗性相关联的SNP多态性可被鉴定，从而产生可在植株中进行鉴定和选择的单倍型。表5显示出位于标记基因座PHM12209、PHM9905、PHM2204和PHM13926的SNP多态性，这些标记基因座与有利的表型或增强的镰孢属穗霉菌抗性相关联，并可用于单倍型的组合以鉴定具有增强的镰孢属穗霉菌抗性的植株。
表5 :位于标记某闵座PHM12209、PHM9905、PHM2204和PHM13926的单核苷酸多杰性
权利要求
1.选择具有增强的镰孢属穗霉菌抗性的玉米植株的方法，所述方法包括 a.检测在玉米植株中的第一标记等位基因，其与选自以下的第二标记等位基因连锁并关联 1.位于 PHM12209. 11 的 “C”， ii.位于 PHM12209. 20 的 “T”， iii.位于 PHM12209. 21 的 “C”， iv.位于 PHM12209. 22 的 “G”， V.位于 PHM12209. 23 的 “C”， vi.位于 PHM9905. 11 的 “A”， vii.位于 PHM9905. 13 的 “T”， vi ii. 位于 PHM9905. 35 的 “G”， ix. 位于 PHM2204. 88 的 “T”， X.位于 PHM2204. 105 的 “A”， xi.位于 PHM13926. 25 的 “C”， xii.位于 PHM13926. 27 的 “G”， xi ii. 位于 PHM13926. 28 的 “G”， xiv.位于 PHM13926. 32 的 “G”， XV.位于 PHM10892. 3 的 “C”， xvi.位于 PHM939. 47 的 “G”， xvii.和位于PHM939. 48的“A” ；以及 b.选择具有第一标记等位基因的所述玉米植株。
2.权利要求I的方法，其中所述第一标记等位基因与所述第二标记等位基因连锁，基于单次减数分裂图谱，距离为20cM。
3.权利要求I的方法，其中所述第一标记等位基因与所述第二标记等位基因连锁，基于单次减数分裂图谱，距离为lcM。
4.选择具有增强的镰孢属穗霉菌抗性的玉米植株的方法，所述方法包括 a.检测在玉米植株中的至少一个标记等位基因，所述标记等位基因选自 i.位于 PHM12209. 11 的 “C”， ii.位于 PHM12209. 20 的 “T”， iii.位于 PHM12209. 21 的 “C”， iv.位于 PHM12209. 22 的 “G”， V.位于 PHM12209. 23 的 “C”， vi.位于 PHM9905. 11 的 “A”， vii.位于 PHM9905. 13 的 “T”， vi ii. 位于 PHM9905. 35 的 “G”， ix. 位于 PHM2204. 88 的 “T”， X.位于 PHM2204. 105 的 “A”， xi.位于 PHM13926. 25 的 “C”， xii.位于 PHM13926. 27 的 “G”，xiii.位于 PHM13926. 28 的 “G”， xiv.位于 PHM13926. 32 的 “G”， xv.位于 PHM10892. 3 的 “C”， xvi.位于 PHM939. 47 的 “G”， xvii.和位于PHM939. 48的“A” ；以及 b.选择具有至少一个标记等位基因的所述玉米植株。
5.鉴定具有增强的镰孢属穗霉菌抗性的玉米植株的方法，所述方法包括 a.检测在玉米植株中的标记基因座，其中 i.包含全部或部分的标记基因座、或它们的互补序列的标记探针在严格条件下与介于以下序列之间并包括以下序列的连续DNA杂交SEQ ID NO :1、或基于Clustal V比对方法与SEQ ID NO :I具有95%同一性的核苷酸序列，和SEQ ID NO :7、或基于Clustal V比对方法与SEQ ID NO 7具有95%同一性的核苷酸序列；并且 ii所述标记基因座包含与增强的镰孢属穗霉菌抗性相关联的至少一个等位基因；以及 b.鉴定具有与增强的镰孢属穗霉菌抗性相关联的至少一个等位基因的所述玉米植株。
6.选择具有增强的镰孢属穗霉菌抗性的玉米植株的方法，所述方法包括 a.鉴定具有至少一个标记基因座的等位基因的第一玉米植株，其中 i.包含全部或部分的标记基因座、或它们的互补序列的标记探针在严格条件下与介于以下序列之间并包括以下序列的连续DNA杂交SEQ ID NO :1、或基于Clustal V比对方法与SEQ ID NO :1具有95%同一性的核苷酸序列，和SEQ IDNO :7、或基于Clustal V比对方法与SEQ ID NO 7具有95%同一性的核苷酸序列；并且 ii所述标记基因座包含与增强的镰孢属穗霉菌抗性相关联的至少一个等位基因；以及 b.将所述第一玉米植株与第二玉米植株杂交； c.对子代植株进行所述第一玉米植株的至少一个等位基因评价；以及 d.选择具有所述第一玉米植株的至少一个等位基因的子代植株。
7.鉴定具有增强的镰孢属穗霉菌抗性的玉米植株的方法，所述方法包括 a.检测在玉米植株中的标记基因座，其中； i.包含全部或部分的标记基因座、或它们的互补序列的标记探针在严格条件下与介于以下序列之间并包括以下序列的连续DNA杂交SEQ ID NO :10、或基于Clustal V比对方法与SEQ ID NO : 10具有95%同一性的核苷酸序列，和SEQ ID NO :22、或基于Clustal V比对方法与SEQ ID NO 22具有95%同一性的核苷酸序列；并且 ii.所述标记基因座包含与增强的镰孢属穗霉菌抗性相关联的至少一个等位基因；以及 b.鉴定具有与增强的镰孢属穗霉菌抗性相关联的至少一个等位基因的所述玉米植株。
8.选择具有增强的镰孢属穗霉菌抗性的玉米植株的方法，所述方法包括 a.鉴定具有至少一个标记基因座的等位基因的第一玉米植株，其中 i.包含全部或部分的标记基因座、或它们的互补序列的标记探针在严格条件下与介于以下序列之间并包括以下序列的连续DNA杂交SEQ ID NO :10、或基于Clustal V比对方法与SEQ ID NO :10具有95%同一性的核苷酸序列，和SEQ ID NO :22、或基于Clustal V比对方法与SEQ ID NO 22具有95%同一性的核苷酸序列；并且ii.所述标记基因座包含与增强的镰孢属穗霉菌抗性相关联的至少一个等位基因；以及 b.将所述第一玉米植株与第二玉米植株杂交； c.对子代植株进行所述第一玉米植株的至少一个等位基因评价；以及 d.选择具有所述第一玉米植株的至少一个等位基因的子代植株。
9.鉴定具有增强的镰孢属穗霉菌抗性的玉米植株的方法，所述方法包括 a.检测在玉米植株中的标记基因座的至少一个等位基因，其中 i.所述标记基因座位于包含并侧接PHM12969和PHM18211的染色体区间内；并且 ii.所述至少一个等位基因与增强的镰孢属穗霉菌抗性相关联；以及 b.鉴定具有与增强的镰孢属穗霉菌抗性相关联的至少一个等位基因的玉米植株。
10.选择具有增强的镰孢属穗霉菌抗性的玉米植株的方法，所述方法包括 a.鉴定具有标记基因座的至少一个等位基因的第一玉米植株，其中 i.所述标记基因座位于包含并侧接PHM12969和PHM18211的染色体区间内；并且 ii所述至少一个等位基因与增强的镰孢属穗霉菌抗性相关联； b.将所述第一玉米植株与第二玉米植株杂交； c.对子代植株进行所述第一玉米植株的至少一个等位基因评价；以及 d.选择具有所述第一玉米植株的至少一个等位基因的子代植株。
11.鉴定具有增强的镰孢属穗霉菌抗性的玉米植株的方法，所述方法包括 a.检测在玉米植株中的标记基因座的至少一个等位基因，其中 i.所述标记基因座位于包含并侧接PHM10892和PHM10262的染色体区间内；并且 ii.所述至少一个等位基因与增强的镰孢属穗霉菌抗性相关联；以及 b.鉴定具有与增强的镰孢属穗霉菌抗性相关联的至少一个等位基因的玉米植株。
12.选择具有增强的镰孢属穗霉菌抗性的玉米植株的方法，所述方法包括 a.鉴定具有标记基因座的至少一个等位基因的第一玉米植株，其中 i.所述标记基因座位于包含并侧接PHM10892和PHM10262的染色体区间内；并且 ii.所述至少一个等位基因与增强的镰孢属穗霉菌抗性相关联； b.将所述第一玉米植株与第二玉米植株杂交； c.对子代植株进行所述第一玉米植株的至少一个等位基因评价；以及 d.选择具有所述第一玉米植株的至少一个等位基因的子代植株。
13.由权利要求5、7、9、14和11的方法中的任一种鉴定的玉米植株。
14.由权利要求1_4、6、8、10和12的方法中的任一种选择的玉米植株。
全文摘要
本发明涉及用于鉴定和选择具有增强的镰孢属穗霉菌抗性的玉米植株的方法和组合物。通过本发明的方法生成的玉米植株也是本发明的特征。
文档编号C12Q1/68GK102753706SQ201180007300
公开日2012年10月24日 申请日期2011年1月26日 优先权日2010年1月26日
发明者A.托马斯, J.A.莱顿, S.卢克 申请人:纳幕尔杜邦公司