包含啶南平生物合成基因簇和标记基因的核酸构建体的制作方法

专利名称：包含啶南平生物合成基因簇和标记基因的核酸构建体的制作方法
技术领域：
本发明涉及包含唳南平(pyripyropene)生物合成基因簇和标记基因的核酸构建体。
背景技术：
目前已经证明在啶南平中有从啶南平A至啶南平R的18种类型的天然存在的类似物，所述类似物在它们侧链的结构中不同(非专利文献I)。已经公开啶南平具有ACAT抑制活性(专利文献I)。由此期望其用于治疗胆固醇积累等引起的疾病。并且，已经公开卩定南平具有针对棉铃虫(Helicoverlpa armlRera)幼K非专利文献2),小菜蛾(Dlamondback moth)幼虫(专利文献2),黄粉虫(专利文献2)或者蚜虫(aphids)(专利文献3)的杀虫活性，并且由此期望其用作杀虫剂。已知啶南平是丝状真菌作为次级代谢物产生的。例如，已经公开了粪生青霉(Penicillium coprobium)PF1169 菌株(专利文献 4),烟曲霉(Aspergillus fumigatus)IF0-1289 菌株(专利文献 5),网状抱正青霉(Eupenicillium reticulosporum)NRRL-3446菌株(非专利文献2)或者灰黄青霉(Penicillium griseofulvum)F1959菌株(专利文献2)每种产生啶南平。通过培养上文提到的生产细菌并且收集啶南平进行啶南平的工业生产。通常，分离的天然存在的微生物产生的次级代谢产物的量是很少的。为了在工业上使用该产物，需要提高这些期望产物的生产力。为了提高这些期望产物的生产力，已经进行了用于培养生产期望产物的微生物的方法的研究，培养基组分和发酵条件的改变如加入前体的研究，以及通过用紫外线放射或者诱变剂突变对细菌菌株的修饰。此外，除了这些方法，最近已经进行了使用基因重组提高生产力的方法。通过基因重组提高生产力的一般方法是提高生物合成基因的表达。例如，通过这种方法，公开了提高无孢目(aRonomycetales)产生的PF1022物质的生产力的方法(专利文献6)。为了应用这种方法，需要分离期望产物的生物合成基因并且需要建立在期望的产物产生微生物中用于转化的方法。对于啶南平，目前没有关于分离它们的生物合成基因簇的报告。另外，还未建立将产生啶南平的真菌作为宿主的转化方法。因此，目前很难将啶南平的生物合成基因簇引入到产生啶南平的微生物中，并且通过基因重组提高生产力是不能实现的。
现有技术参考文献专利文献专利文献I日本特开公报号184158/1994专利文献2W02004/060065专利文献3W02006/129714专利文献4技术公开杂志号500997/2008专利文献5日本特开公报号360895/1992专利文献6日本专利号3961289 非专利文献非专利文献IJournal of Antibiotics (1996)，49 (3)，292-298非专利文献2Applied and Environmental Microbiology (1995), 61 (12), 4429-4435发明概述本发明人已经发现，通过在宿主中表达包含啶南平生物合成基因簇和标记基因的核酸构建体，显著地提高了啶南平的生产力。基于这种发现已经做出了本发明。相应地，本发明的目的是提供包含啶南平生物合成基因簇和标记基因的核酸构建体。根据本发明的一个实施方案，提供了包含啶南平生物合成基因簇和标记基因的核酸构建体。根据本发明的另一个实施方案，也提供了转化体，其通过将上文提到的核酸构建体引入到宿主中获得。进一步地，根据本发明的另一个实施方案，提供了转化体，其通过将包含上文提到的啶南平生物合成基因簇的核酸构建体和包含上文提到的标记基因的核酸构建体同时或者单独引入到宿主中获得。此外，根据本发明的另一个实施方案，提供生产啶南平的方法，所述方法包括培养上文提到的转化体并且从培养物中收集啶南平。附图简述[图I]图I显示了PCR产物通过琼脂糖凝胶的电泳模式。对于电泳，使用了以下引物扩增的PCR产物M :分子量标记物(IOObp梯)，泳道I SEQ ID NO :1和2的引物，泳道 2:SEQ ID NO :239 和 240 的引物，泳道 3 :SEQ ID NO :237 和 238 的引物，泳道 4 :SEQ IDNO :241 和 242 的引物，泳道 5 :SEQ ID NO :247 和 248 的引物，泳道 6 :SEQ ID NO :251 和 252的引物，泳道7:SEQ ID N0:245 和 246 的引物，泳道8:SEQID NO :243和244的引物，泳道
9SEQ ID NO :249 和 250 的引物，泳道 10 SEQ ID NO :235 和 236 的引物，泳道 11 SEQ IDNO :233 和 234 的引物，泳道 12 SEQ ID NO :227 和 228 的引物，泳道 13 SEQ ID NO :229 和230的引物，泳道14 SEQ ID NO :231和232的引物。[图2]类似于

图1，图2显示了PCR产物通过琼脂糖凝胶的电泳模式。对于电泳，使用了以下引物扩增的PCR产物M :分子量标记物(IOObp梯)，泳道I SEQ ID NO :253和254的引物，泳道2 SEQ ID NO :257和258的引物，泳道3 SEQ ID NO :259和260的引物，泳道4:SEQ ID NO :255和256的引物，泳道5 :SEQ ID NO :261和262的引物。
[图3]类似于图1，图3显示了PCR产物通过琼脂糖凝胶的电泳模式。对于电泳，使用了以下引物扩增的PCR产物泳道I :分子量标记物(IOObp梯)，泳道2 SEQ ID NO 264和265的引物(400bp扩增片段)。[图4]图4显示用于使用的丝状真菌的质粒载体pBI-AnGpD-EGFP的图谱。在该图中，RB指右边界,HYGr指的是潮霉素抗性编码区,PAngpdA指的是抱量血霆_ (Aspergi I Iusnidulans)甘油醛_3_磷酸脱氢酶启动子，EGFP指的是增强的绿色荧光蛋白编码区，TAngpdA指的是构巢曲霉甘油醒-3-磷酸脱氢酶终止子，并且LB指的是左边界。[图5A]在图5A中，左图显示用土壤杆菌(ARrobacterium)感染形成的潮霉素抗性菌落，并且右图显示GFP荧光观察的结果。[图5B]在图5B中，左图显示不用十壤杆菌感染的Il牛青霍菌株PF1169的菌落，在不含潮霉素的培养基中形成菌落，并且右图显示GFP荧光观察的结果。 发明详述微牛物的保藏用质粒pCCl-PPl 转化的大肠杆菌(Escherichia coll)(大肠杆菌 EPI300 -T1K)于2008年10月9日(原始保藏日)保藏在独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心(地址日本茨城县筑波市东I 丁目I番地I中央第6，AIST，305-8566)，保藏号是FERM BP-11133(从国内保藏FERM P-21704移管)(保藏者所用的识别标识大肠杆菌EPI300 -T1e/pCC1-PP1)。在2009年12月14日将用质粒pPYRI02转化的大肠杆菌,以保藏号FERMBP-11203(保藏者所用的识别标识XL1-Blue MRA/pPYRI02)保藏在独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心(地址日本茨城县筑波市东I 丁目I番地I中央第6，AIST,305-8566)。在2010年12月I日将用黏粒pPYRI07转化的大肠杆菌,以保藏号FERMBP-11316(保藏者所用的识别标识XL1-Blue MRA/pPYRI07)保藏在独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心(地址日本茨城县筑波市东I 丁目I番地I中央第6，AIST,305-8566)。啶南平生物合成基因簇将本发明中的啶南平生物合成基因簇排列在核酸构建体中以便能与后文描述的标记基因一起在宿主中表达。只要它是啶南平生物合成中涉及的基因簇，对其没有特别限制。优选地，提供构建体，其含有选自以下的(I)至(IV)的核苷酸序列的至少一种核苷酸序列的全部或者一部分(I)SEQ ID NO:266中的从2911至27797的核苷酸序列；(II)核苷酸序列，其能在严格条件下与SEQ ID NO: 266中的从2911至27797的核苷酸序列的互补序列杂交，并且编码与SEQ ID NO:266中的从2911至27797的核苷酸序列编码的蛋白质基本等同的蛋白质；(III)SEQ ID NO:266中的从2911至27797的核苷酸序列的多核苷酸的核苷酸序列，其中缺失、取代、插入或者添加了一个或者多个核苷酸，并且所述核苷酸序列编码与SEQID NO:266中的从2911至27797的核苷酸序列编码的蛋白质基本等同的蛋白质；和(IV)核苷酸序列，其具有与SEQ ID N0:266中的从2911至27797的核苷酸序列的多核苷酸至少90%的同一性，并且编码与SEQ ID NO:266中的从2911至27797的核苷酸序列编码的蛋白质基本等同的蛋白质。根据本发明进一步优选的啶南平生物合成基因簇的实施方案，所述基因簇是含有目的基因和表达调节区的基因簇。这里，目的基因是具有一个或者多个编码涉及啶南平的生物合成的蛋白质的基因的基因。也不限制表达调节区，只要它具有调节上文提到的宿主中的目的基因必须的核苷酸序列。例如，包括了启动子和终止子，其是调节目的基因在宿主中转录的量的核苷酸序列。此外，在下面的路线I中显示了在啶南平的生物合成中涉及的蛋白质，例如在任一生物合 成途径中涉及的蛋白质。表I
权利要求
1.核酸构建体，其包含啶南平生物合成基因簇和标记基因。
2.根据权利要求I的核酸构建体，其中所述啶南平生物合成基因簇包含选自下面的(I)至(IV)的核苷酸序列的至少一种核苷酸序列的全部或者一部分 (I)SEQID NO:266中的从2911至27797的核苷酸序列； (II)核苷酸序列，其能在严格条件下与SEQID N0:266中的从2911至27797的核苷酸序列的互补序列杂交，并且编码与SEQ ID NO:266中的从2911至27797的核苷酸序列编码的蛋白质基本等同的蛋白质； (III)SEQID NO:266中的从2911至27797的核苷酸序列的多核苷酸的核苷酸序列，其中缺失、取代、插入或者添加了一个或者多个核苷酸，并且所述核苷酸序列编码与SEQ IDNO:266中的从2911至27797的核苷酸序列编码的蛋白质基本等同的蛋白质；和 (IV)核苷酸序列，其具有与SEQID N0:266中的从2911至27797的核苷酸序列的多核苷酸至少90%的同一性，并且编码与SEQ ID NO:266中的从2911至27797的核苷酸序列编码的蛋白质基本等同的蛋白质。
3.根据权利要求I或者2的核酸构建体，其中所述啶南平生物合成基因簇包含目的基因和表达调节区。
4.根据权利要求3的核酸构建体，其中所述基因包含编码选自SEQID NOs:267至275的至少一种氨基酸序列或者与其基本等同的氨基酸序列的核苷酸序列。
5.根据权利要求3的核酸构建体，其中所述基因包含选自下面(I)至(4)中的核苷酸序列的至少一种核苷酸序列 (I)在下面(a)至⑴的核苷酸序列 (a)在SEQID NO:266中显示的核苷酸序列的从3342至5158的核苷酸序列， (b)在SEQID NO:266中显示的核苷酸序列的从5382至12777的核苷酸序列， (c)在SEQID NO:266中显示的核苷酸序列的从13266至15144的核苷酸序列， (d)在SEQID NO:266中显示的核苷酸序列的从16220至18018的核苷酸序列， (e)在SEQID NO:266中显示的核苷酸序列的从18506至19296的核苷酸序列， (f)在SEQID NO:266中显示的核苷酸序列的从19779至21389的核苷酸序列， (g)在SEQID NO:266中显示的核苷酸序列的从21793至22877的核苷酸序列， (h)在SEQID NO:266中显示的核苷酸序列的从23205至24773的核苷酸序列，以及 (i)在SEQID NO:266中显示的核苷酸序列的从25824至27178的核苷酸序列； (2)能在严格条件下与(I)中的核苷酸序列的互补序列杂交的核苷酸序列，并且其编码与每种核苷酸序列编码的蛋白质基本等同的蛋白质； (3)(I)中的核苷酸序列的多核苷酸的核苷酸序列,其中缺失、取代、插入或者添加了一个或者多个核苷酸，并且所述核苷酸序列编码与每种核苷酸序列编码的蛋白质基本等同的蛋白质；和 (4)核苷酸序列，其具有与(I)中的核苷酸序列的多核苷酸至少90%的同一'丨生,并且编码与每种核苷酸序列编码的蛋白质基本等同的蛋白质。
6.根据权利要求3至5任一项的核酸构建体，其中所述表达调节区包含选自下面(I)至(4)中的核苷酸序列的至少一种核苷酸序列 (I)在下面(j)至(s)中的核苷酸序列的全部或者一部分(j)在SEQ ID NO:266中显示的核苷酸序列的从2911至3341的核苷酸序列， (k)在SEQ ID NO:266中显示的核苷酸序列的从5159至5381的核苷酸序列， (1)在SEQID NO:266中显示的核苷酸序列的从12778至13265的核苷酸序列， (m)在SEQ ID NO:266中显示的核苷酸序列的从15145至16219的核苷酸序列， (η)在SEQ ID NO:266中显示的核苷酸序列的从18019至18505的核苷酸序列， (ο)在SEQ ID NO:266中显示的核苷酸序列的从19297至19778的核苷酸序列， (P)在SEQ ID NO:266中显示的核苷酸序列的从21390至21792的核苷酸序列， (q)在SEQ ID NO:266中显示的核苷酸序列的从22878至23204的核苷酸序列， (r)在SEQ ID NO:266中显示的核苷酸序列的从24774至25823的核苷酸序列，和 (s)在SEQ ID NO:266中显示的核苷酸序列的从27179至27797的核苷酸序列； (2)能在严格条件下与(I)中的核苷酸序列的互补序列杂交的核苷酸序列，并且所述核苷酸序列具有与每种核苷酸序列基本等同的功能； (3)(I)中的核苷酸序列的多核苷酸的核苷酸序列,其中缺失、取代、插入或者添加了一个或者多个核苷酸，并且所述核苷酸序列具有与每种核苷酸序列基本等同的功能；和 (4)核苷酸序列，其具有与(I)中的核苷酸序列的多核苷酸至少90%的同一'丨生,并且具有与每种核苷酸序列基本等同的功能。
7.根据权利要求I至6的核酸构建体，其中所述标记基因是药物抗性基因或者营养缺陷基因。
8.根据权利要求I至6的核酸构建体，其中所述标记基因是越霉素抗性基因或者潮霉素抗性基因。
9.转化体,其能通过将根据权利要求I至8任一项的所述核酸构建体引入到宿主中而得到。
10.转化体，其能通过同时地或者单独地将包含啶南平生物合成基因簇的核酸构建体和包含标记基因的核酸构建体引入到宿主中而得到。
11.根据权利要求9的转化体，其能通过将质粒PPYRI02或者粘粒PPYRI07引入到所述宿主中而得到。
12.根据权利要求9-11任一项的转化体，其中所述宿主是产生啶南平的丝状真菌。
13.根据权利要求12的转化体，其中所述产生啶南平的丝状真菌是直霉垦、正直霉麗或者曲霉属。
14.根据权利要求12的转化体，其中所述产生啶南平的丝状真菌是粪生青霉(Penicillium coprobium)、灰黄青霉(Penicillium Rriseofulvum)、网状抱正青霉(Eupenicillium reticulosporum)或者烟曲霉(AsperRillusfumiRatus)。
15.根据权利要求12的转化体，其中所述产生啶南平的丝状真菌是粪生青霉。
16.根据权利要求12的转化体，其中所述产生啶南平的丝状真菌是粪生青霉PFl169菌株或者粪生青霉菌株ATCC58615。
17.生产啶南平的方法，其包括培养根据权利要求9至16任一项的所述转化体，并且从培养基中收集所述啶南平。
全文摘要
提供了包含啶南平生物合成基因簇和标记基因的核酸构建体。所述核酸构建体允许以高生产力廉价地制备啶南平。
文档编号C12N15/09GK102884187SQ20118000718
公开日2013年1月16日 申请日期2011年1月19日 优先权日2010年1月26日
发明者相原智, 隅田奈绪美, 村岛弘一郎, 矢内耕二, 安西弘行, 山本憲太朗 申请人:明治制果药业株式会社