用于通过连续发酵生产化学制品的方法

专利名称：用于通过连续发酵生产化学制品的方法
技术领域：
本发明涉及用于通过连续发酵生产化学制品的方法。
背景技术：
伴随细菌、微生物或培养细胞的培养的发酵方法主要分类成(I)分批发酵和补料分批或半分批发酵；和(2)连续发酵。分批发酵和补料分批或半分批发酵具有的优点在于，它们仅需要简单设备，培养可以在短时间内完成，并且在通过纯微生物培养的化学产物发酵的情况下，不太可能发生除培养所需的培养微生物外的微生物污染。然而，在发酵液中的产物污染随着时间增加，并且这引起产物的抑制，渗透压中的增加等，导致生产力和收率中的降低。因此，难以长时间稳定维持高收率和高生产力。 在连续发酵中，与分批发酵和补料分批或半分批发酵的上述情况相比较，高收率和高生产力可以维持更长时间，因为可以避免在发酵罐中目的物质的累积。常规连续培养是其中新鲜培养基以恒定速率供应给发酵罐的培养方法，而相同量的发酵液排放至发酵罐的外部，通过其发酵罐中的液体量保持恒定。在分批发酵中，培养在最初以特定浓度的底物消耗后终止。然而，理论上，在连续发酵中，培养可以无限继续。即，理论上，发酵可以无限继续。然而，因为在常规连续培养中，微生物连同发酵液一起排放至发酵罐的外部，所以难以维持发酵罐中的微生物浓度。因此，当执行发酵生产时，如果发酵由其执行的微生物的浓度可以保持为高的，那么可以增加发酵生产效率/发酵容积。为了达到这点，微生物需要在发酵te中保留或返流。用于在发酵罐中保留或返流微生物的方法的例子包括其中将排放的发酵液离心用于固液分离，并且将作为沉淀物的微生物返回到发酵罐内的方法，和其中作为固体的微生物通过过滤分离且仅发酵液上清液排放至发酵罐的外部的方法。然而，通过离心的方法是不现实的，因为需要高动力费用。通过过滤的方法的应用已主要局限于实验室研究，因为这种方法需要高压用于上述过滤。作为这种方法的例子，已公开了用于L-谷氨酸和L-赖氨酸的连续发酵方法(非专利文献I)。然而，在这些例子中，尽管连续发酵通过发酵原料连续加入发酵罐执行，但取出含有细菌、微生物或培养细胞的发酵液，从而使得发酵液中的细菌、微生物或培养细胞被同时取出且稀释，导致发酵罐中微生物浓度中的降低，且因此导致生产效率的仅有限改善。因此，在连续发酵中，已提出了一种方法，其中细菌、微生物或培养细胞由分离膜分离/过滤以从滤液中回收化学制品，而分离的细菌、微生物或培养细胞在发酵液中保留或返流，通过其发酵液中微生物或细胞的浓度保持为高的。例如，对于使用陶瓷膜的连续发酵装置，与膜分离连续发酵有关的技术已得到公开(专利文献I、专利文献2和专利文献3)。在这些技术中，显示了膜分离连续发酵超过现有连续发酵的优越性，因为微生物或培养细胞的浓度可以通过膜分离而高保持。然而，在公开的技术中存在问题，例如由于陶瓷膜的堵塞在过滤流速和过滤效率中的降低，从而使得执行反压洗涤等用于预防堵塞。
另一方面，近年来，使用分离膜用于生产琥珀酸的方法也已得到公开(专利文献4)。这种技术不仅使用如上所述的陶瓷膜，还使用有机膜，扩展可应用于连续发酵技术的膜的范围和类型。然而，在公开的技术中，在膜分离中采用高过滤压(约200 kPa)和高膜表面线性速度(2 m/s)。高过滤压和高膜表面线性速度的采用在其中细菌、微生物或培养细胞连续返回到发酵罐内的连续发酵中是不合适的，不仅因为高成本，还因为下述事实细菌、微生物或培养细胞可以在过滤过程中被高压/高速物理损害，并且可能发生压力损失，使得操作条件的维持变得困难。另一方面，除了上述发酵领域外，分离膜已越来越多地应用于其中将河水等净化以产生饮用水和工业用水的自来水领域，和其中将污水(污水二次处理流出物)净化且纯化的污水领域。对于膜在此类领域中的广泛使用，尽可能多地预防由有机物质等污染(堵塞)的处理是必需的。作为用于膜的材料，使用多种材料例如纤维素材料、聚丙烯腈材料和聚烯烃材料。在这些中，聚偏氟乙烯作为用于水性过滤膜的材料是合适和有希望的，因为它具有高强度和高耐热性，并且由于其疏水骨架具有高耐水性。作为用于聚偏氟乙烯膜的生产方法，专利文献5提出了用于生产中空纤维膜的方 法，其中将聚偏氟乙烯、有机液体和无机细粉熔揉(melt knead)且通过冷却实施微相分离，随后为有机液体和无机细粉的萃取。进一步地，专利文献6公开了用于生产由聚偏氟乙烯和溶剂系统组成的中空纤维膜的方法。然而，一般已知在其中高污染原水通过这些膜过滤的情况下，在膜表面上或在膜内保持未过滤的沉积物引起另外的过滤阻力，导致降低的过滤性能。因此，采用其中沉积物由快速水流剥离的冲洗，其中沉积物通过将气泡吹到滤器上剥离的空气擦洗，其中将过滤方向逆转以洗涤滤器的反洗等，在其过程中过滤操作被中断。进一步地，过滤性能还通过用化学制品定期洗涤滤器而高保持。尽管冲洗和空气擦洗的洗涤效果高，但这些步骤对膜强加高负荷，从而使得膜可能破裂。进一步地，因为在常规膜的情况下，即使采用这些方法，随着时间污染物(堵塞)累积对膜的影响仍大，不一定可以获得良好的渗透性，这已是成问题的。另一方面，近来，已提出其中将分离膜应用于发酵方法的方法，其是伴随培养微生物用于生产物质的方法，以执行连续发酵，从而允许细菌、微生物或培养细胞的累积，以增加生产率(专利文献7)。在这种技术中，首先提供发酵罐，并且提供含有扁平膜和中空纤维膜的膜分离槽。使用泵，将发酵液从发酵罐注入膜分离槽，并且使用与膜分离槽中的由膜单元分开提供的液压头差异控制装置控制过滤。然而，在这种方法中，存在设备的放置和维持中的问题，例如提供2个槽和控制单元，并且因此需要大的安装空间，并且需要在从发酵罐阻断膜分离槽以停止槽的操作后，执行分离膜的更换，导致生产率中的降低。进一步地，将分离膜置于发酵罐中的提议意味着发酵罐需要在更换分离膜后停止，从而使得由于起于分离膜的问题，生产可能需要停止。进一步地，在其中使用专利文献7中公开的分离膜执行连续发酵的操作的情况下，稳定连续操作不能长时间完成，这是成问题的。另一方面，近来，已执行在通过对于其应用分离膜的发酵改善生产率的尝试中的研究。非专利文献2暗示生产率可以通过使用副干酪乳杆菌paracasei)执行乳酸发酵且使用由聚偏氟乙烯组成的膜过滤发酵液得到改善。然而，因为执行用次氯酸钠的洗涤以避免由于膜堵塞在跨膜压力差中的增加，所以在长期过滤操作过程中的频繁洗涤可以引起问题，例如由于通过次氯酸的发酵微生物分解或钠累积对发酵的不利效应，和由于中空纤维膜的变质出现渗漏。进一步地，尽管膜过滤操作伴随用化学制品的洗涤的事实，操作可以继续最多仅150小时。对于此类短操作时间，即使考虑到成本，连续发酵也几乎不比分批操作有利，并且该方法因此无法容易地应用于实际发酵和生产。因此，需要技术的革新。现有技术文献
[专利文献]
专利文献I JP 5-95778 A 专利文献 2 JP 62-138184 A 专利文献 3 JP 10-174594 A 专利文献 4 JP 2005-333886 A 专利文献5 US 5022990 B 专利文献6 W091/17204 专利文献 7 JP 2008-237213 A。 [非专利文献]
非专利文献 I :Toshihiko Hirao 等人，Appl. Microbiol. Biotechnol. , 32, 269-273(1989)
非专利文献 2 :Guo_qian Xu 等人，Process Biochemistry, 41, 2458-2463 (2006)。

发明内容
待由本发明解决的问题
本发明旨在提供用于通过连续发酵生产化学制品的方法，其中高生产力可以通过简单操作方法长时间稳定维持。用于解决问题的方法
为了解决上述问题，本发明具有下述组成。(I)用于通过连续发酵生产化学制品的方法，其包括
通过分离膜过滤发酵液，以从滤液中回收化学制品，所述发酵液含有发酵原料，化学制品，以及细菌、微生物或培养细胞；
在发酵液中保留或返流未过滤的液体；和 将发酵原料加入发酵液中；
其中分离膜是由聚偏氟乙烯树脂组成的多孔中空纤维膜，
所述多孔中空纤维膜具有至少O. 001 μ m和至多10. O μ m的平均孔径，在25°C在50kPa至少O. 5 m3/m2/小时和至多15 m3/m2/小时的纯水渗透系数，至少5 MPa和至多20 MPa的断裂强度，至少30%和小于200%的断裂伸长率，至少I. 3和至多2. 5的卷曲度，至少40%的孔隙率，和至少45 mN/m和至多75 mN/m的临界表面张力。(2)根据上述(I)用于通过连续发酵生产化学制品的方法，其中所述多孔中空纤维膜的表面由乙烯-乙烯醇共聚物涂覆。(3)根据上述(I)或(2)用于通过连续发酵生产化学制品的方法，其中所述多孔中空纤维膜通过如下制备用乙烯-乙烯醇共聚物溶液浸溃由聚偏氟乙烯树脂组成的多孔中空纤维膜，所述乙烯-乙烯醇共聚物溶液包含乙烯-乙烯醇共聚物和对于聚偏氟乙烯惰性并且溶解乙烯-乙烯醇共聚物的溶剂；随后为干燥处理。
(4)根据上述(I)- (3)中任何一个用于通过连续发酵生产化学制品的方法，其中所述发酵原料包含糖类。(5)根据上述(I)- (4)中任何一个用于通过连续发酵生产化学制品的方法，其中所述化学制品是有机酸、醇或核酸。发明效果
因为通过本发明，连续发酵可以以高生产力长时间稳定维持，所以作为发酵产物的化学制品可以以发酵工业中一般的低成本稳定生产。


图I是用于解释本发明的膜分离型连续发酵装置的例子的示意图。图2是用于解释本发明的分离膜模块的例子的示意图。 图3是显示本发明的酵母表达载体pTRSll的物理图谱的图解。具体实施方案
本发明是用于通过连续发酵生产化学制品的方法，该方法包括通过分离膜过滤含有发酵原料、化学制品、以及细菌、微生物或培养细胞的发酵液，以从滤液中回收化学制品；在发酵液中保留或返流未过滤的液体；和将发酵原料加入发酵液中；所述方法使用由聚偏氟乙烯树脂组成的多孔中空纤维膜作为分离膜，所述多孔中空纤维膜具有至少O. 001 μ m和至多10. O μ m的平均孔径，在25°C在50 kPa至少O. 5 m3/m2/小时和至多15 m3/m2/小时的纯水渗透系数，至少5 MPa和至多20 MPa的断裂强度，至少30%和小于200%的断裂伸长率，至少I. 3和至多2. 5的卷曲度，至少40%的孔隙率，和至少45 mN/m和至多75 mN/m的临界表面张力。本发明的多孔膜为中空纤维膜的形式。当中空纤维膜制备成其中它们实际上在过滤(模块)中使用的形式时，它们是有利的，因为与扁平膜和片状膜相比较，过滤膜的面积/单位体积可以变得更大，允许更高的过滤性能/单位体积。因为聚偏氟乙烯具有高强度和高耐热性，并且由于其疏水骨架具有高耐水性，所以它适合作为用于本发明的材料。在本发明中使用的聚偏氟乙烯的例子包括偏二氟乙烯均聚物和偏二氟乙烯共聚物。偏二氟乙烯共聚物的例子包括偏二氟乙烯与选自四氟乙烯、六氟丙烯、氯三氟乙烯和乙烯的一种或多种单体的共聚物。在本发明中，优选使用偏二氟乙烯均聚物。这些聚合物可以个别或作为其中2种或更多种的混合物使用。聚偏氟乙烯的重均分子量(Mw)是优选至少100，000和小于1，000, 000。在其中聚偏氟乙烯的Mw小于100,000的情况下，所获得的中空纤维膜是不实用的，因为它显示更少伸长且是脆性的，而在其中Mw至少1，000, 000的情况下，在熔解过程中的流动性低，导致更差的成型性。在本发明中，中空纤维膜优选由混合物生产，所述混合物由3种组分即聚偏氟乙烯、有机溶液和无机细粉组成。无机细粉具有作为载体以保留有机溶液的功能，并且还具有作为核用于微相分离的功能。即，无机细粉预防在混合物的熔揉和塑型过程中有机液体的解离，从而使得塑型容易，并且具有作为核用于微相分离的功能，以允许有机液体的高水平微分散，且预防有机液体的聚集。作为无机细粉，优选使用疏水性二氧化硅。因为疏水性二氧化硅不太可能引起聚集，所以它在熔揉和塑型过程中精细地微分散，以因此形成均匀的三维网状结构。疏水性二氧化硅在本文中意指通过使二氧化硅的表面上的硅烷醇基与有机硅化合物例如二甲基硅烷或二甲基二氯硅烷反应、从而用甲基等替换二氧化硅的表面而疏水化的二氧化硅。在本发明中的有机液体意指具有至少150°C的沸点的液体。有机液体从中空纤维膜中萃取，并且使得所得到的中空纤维膜多孔。优选地，有机液体在低温(常温)与聚偏氟乙烯不相容，但在熔塑(melt-molding)(在高温)过程中与聚偏氟乙烯相容。可以用作本发明的分离膜的中空纤维膜可以通过生产方法进行制备，其中将由聚偏氟乙烯和有机液体组成的混合物，或由聚偏氟乙烯、有机液体和无机细粉组成的混合物熔揉且挤出，以塑型中空纤维膜，随后为萃取有机液体、或有机液体和无机细粉。中空纤维膜的生产过程优选包括其中在萃取完成前的中空纤维膜或在萃取完成后的中空纤维膜以纤维的纵向方向伸展且随后以纤维的纵向方向收缩的步骤。多孔中空纤维膜可以通过如下制备例如用乙烯-乙烯醇共聚物溶液浸溃通过上述方法获得的聚偏氟乙烯树脂中空纤维膜，所述乙烯-乙烯醇共聚物溶液包含乙烯-乙烯醇共聚物和对于聚偏氟乙烯惰性并且溶解乙烯-乙烯醇共聚物的溶剂，随后为干燥处理。 进一步地，在本发明中，中空纤维膜优选在收缩步骤过程中卷曲。通过这一点，可以获得既无坍塌也无损害的高度卷曲的中空纤维膜。一般而言，中空纤维膜具有无弯曲的直管状。因此，当它们成束以制备过滤模块时，在中空纤维之间的间隙不能得到确保是高度可能的，导致具有低孔隙率的纤维束的产生。另一方面，在其中使用具有高卷曲度的中空纤维膜的情况下，由于在个别纤维中的弯曲，在中空纤维膜之间的间隙一致地增加，导致具有高孔隙率的纤维束的产生。进一步地，在由具有低卷曲度的中空纤维膜组成的过滤模块中，在纤维束中的间隙尤其在其中对其应用外部压力的情况下降低，引起流动抵抗中的增加，导致过滤压对于纤维束中央部分的无效传递。进一步地，当执行反洗或冲洗以从中空纤维膜剥离过滤沉积物时，洗涤效应在纤维束内可以是更小的。由具有高卷曲度的中空纤维膜组成的纤维束具有高孔隙率，并且即使在其中在过滤过程中应用外部压力的情况下，在中空纤维膜之间的间隙也得到维持。在本发明中，中空纤维膜的卷曲度优选在I. 3 - 2. 5的范围内。因为上述原因，小于I. 3的卷曲度不是优选的，并且超过2. 5的卷曲度可以降低过滤面积/容积，这不是优选的。一般而言，中空纤维膜具有无弯曲的直管状。因此，当它们成束以制备过滤模块时，在中空纤维之间的间隙不能得到确保是高度可能的，导致具有低孔隙率的纤维束的产生。另一方面，在其中使用具有高卷曲度的中空纤维膜的情况下，由于在个别纤维中的弯曲，在中空纤维膜之间的间隙一致地增加，导致具有高孔隙率的纤维束的产生。进一步地，在由具有低卷曲度的中空纤维膜组成的过滤模块中，在纤维束中的间隙尤其在其中对其应用外部压力的情况下降低，引起流动抵抗中的增加，导致过滤压对于纤维束中央部分的无效传递。进一步地，当执行反洗或冲洗以从中空纤维膜剥离过滤沉积物时，洗涤效应在纤维束内可以是更小的。由具有高卷曲度的中空纤维膜组成的纤维束具有高孔隙率，并且即使在其中在过滤过程中应用外部压力的情况下，在中空纤维膜之间的间隙也得到维持，从而使得不太可能引起不均匀流。卷曲度可以通过下述进行测定使约1000个中空纤维膜成束，并且用具有4 cm宽度的PET条带测量中空纤维膜束的周长，同时应用对条带应用I kg张力，随后为根据下式的计算。卷曲度=(周长[m] / π)2 / ((中空纤维直径[m])2 X中空纤维数目)在本发明中，考虑到在中空纤维管内流动的液体的阻力(管内压力损失)，中空纤维膜的内径至少O. 4 mm,并且考虑到填充膜的面积/单位体积，至多3. O mm。至少O. 5 mm和至多I. 5 mm的内径是更优选的。在其中中空纤维膜的外径/内径比太小的情况下，膜对于张力、裂开和/或压缩仅具有低抵抗力，而在其中比太大的情况下，过滤性能低，因为膜厚度相对于膜面积太大，这是不利的。因此，中空纤维膜的外径/内径比优选至少I. 3和至多2. 3。该比更优选至少
I.5和至多2. I，更加优选至少I. 6和至多2.0。考虑到渗透性，中空纤维膜的孔隙率需要是至少40 %，并且孔隙率优选至少60%。孔隙率更优选至少65%和至多85%，更加优选至少70%和至多80%。孔隙率可以根据下式进行测定。孔隙率[%] = 100 X (湿膜重量[g]-干膜重量[g])/水的比重[g/cm3] /(膜体积[cm3])
湿膜在本文中意指其中孔充满纯水但中空部分不含有纯水的膜。更特别地，将具有10-20 cm长度的样品膜浸入乙醇中，以使孔充满乙醇，并且随后在纯水中的浸入重复4或5次，以使孔的内部由纯水充分代替。中空纤维膜随后在一端握住，充分振荡约5次，在另一端握住，并且随后再次充分振荡约5次，以去除来自中空部分的水。通过这一点，可以获得湿膜。通过在测量湿膜重量后在烘箱中干燥湿膜直至重量达到在60°C的恒定值，可以获得干膜。膜体积可以根据下式进行测定。膜体积[cm3]= Ji X {(外径[cm] / 2)2 -(内径[cm] /2)2} X 膜长度[cm]
在其中单个膜的重量太小且因此当测量其重量时出现大误差的情况下，可以使用多个膜。就中空纤维膜的孔径而言，平均孔径需要是至少O. 001 μ m和至多10.0 μ m。平均孔径优选至少O. 05 μ m和至多I. O μ m,更优选至少O. I μ m和至多O. 5 μ m。在其中平均孔径小于O. 001 μ m的情况下，过滤流速小，这不是优选的。在其中平均孔径超过10. Oμ m的情况下，悬浮固体的分离不能通过过滤有效执行，并且膜可能变得在内部由悬浮固体堵塞，导致随着时间过滤速率中大的降低，这不是优选的。膜的平均孔径可以根据ASTM F316-86中描述的方法(也称为半干法)进行测定。应当指出通过半干法测定的平均孔径是在膜中具有最低孔径的层的平均孔径。在本发明中，通过半干法的平均孔径测量使用乙醇作为待使用的液体，并且测量在251和0.001 MPa/秒的压力增加速率的标准测量条件下执行。平均孔径[μ m]可以根据下式进行计算。平均孔径[μπι] = (2860 X表面张力[mN/m]) /半干气压[Pa]
因为乙醇在 25°C 的表面张力是 2I. 97 mN/m (“Handbook of Chemistry, FundamentalSection,第 3 版，，，II,第 82 页，The Chemical Society of Japan 编辑，MaruzenPublishing, Co. , Ltd. , 1984),所以在本发明中在标准测量条件下的平均孔径[μπι]可以如下计算。平均孔径[μm] = 62834. 2 / (半干气压[Pa])膜的最大孔径可以基于在其下在半干法(泡点法)中气泡首先由膜生成的压力进行测定。在其中使用用于半干法的上述标准测量条件的情况下，在其下气泡首先由中空纤维膜生成的压力可以用于根据下式测定最大孔径[μπι]。最大孔径[μ m] = 62834. 2 / (气泡生成气压[Pa])
在膜的最大孔径和平均孔径之间的比优选小于2. O。在其中比至少2. O的情况下，可能存在渗漏的问题，并且可能减少反洗的效应。三维网状结构意指这样的结构，其中在膜的截面中，大孔(大的孔)基本上不存在，而孔这样存在，从而使得它们以任何方向三维通信。在膜的断面中大孔的存在引起膜强度中的降低，这不是优选的，并且大孔的连续存在可以弓I起渗漏。“大孔”意指基于球面近似具有至多8 μ m的直径的孔。特别地，在其中膜具有均匀三维网状结构的情况下，即使当表面损害时，阻止孔径也基本上不改变，只要不存在损害的穿透，这是有利的。通过使用无机细粉的生产方法获得的中空纤维膜的截面结构是不具有大孔的均匀三维网状结构。然而，由 于伸展，发现网状结构在纤维方向中的伸长。考虑到对张力、裂开和压缩的抵抗力和过滤性能，本发明的多孔中空纤维膜的纯水渗透系数需要是至少O. 5 m3/m2/小时和至多15 m3/m2/小时。纯水渗透系数通常可以通过下述方法进行测量。通过浸入乙醇中随后几次浸入纯水中制备具有约10 cm长度的湿中空纤维膜。将膜的一端密封，并且从另一端将注射针插入中空部分内。在25°C的环境下，将以25°C的纯水从注射针以50 KPa的压力注射到中空部分内，并且测量在作为滤液获得的外表面上透过的纯水的量，以根据下式测定纯水渗透系数。纯水渗透系数[m3/m2/小时]=透过的水的量[m3] /( π X膜直径[m] X膜数目X膜的有效长度[m] X测量时间[小时])
膜直径在本文中意指在其中使用外部压力型中空纤维膜的情况下膜的外径，或在其中使用内部压力型中空纤维膜的情况下膜的内径。膜的有效长度意指在排除其中插入注射针的部分的长度后的净膜长度。本发明的中空纤维膜的一个主要特征是它具有低拉伸弹性模量，尽管它的高拉伸断裂强度、抗压强度和压缩弹性模量。高拉伸断裂强度指示以模块形式的膜对于在过滤操作或冲洗过程中的纤维断裂是高度抵抗的。拉伸断裂强度需要是至少5 MPa和至多20 MPa。在其中拉伸断裂强度小于5 MPa的情况下，纤维断裂更频繁地发生。在其中拉伸断裂强度超过20 MPa的情况下，渗透性更低。拉伸断裂强度优选至少7 MPa。拉伸断裂伸长率需要是至少30%和小于200%，优选至少50%和小于150%。在其中拉伸断裂伸长率小于30%的情况下，当纤维通过冲洗或空气擦洗强制振荡时，膜破裂更可能发生，并且在其中拉伸断裂伸长率超过200%的情况下，对于裂开或压缩的抵抗力可以低，和/或由于低拉伸比，拉伸弹性模量可以高，这不是优选的。在其中包括伸展且随后收缩中空纤维膜的步骤的情况下，在低伸长率时破裂的可能性极低，从而使得拉伸断裂伸长率的分布可以变窄。考虑到预防污染物的吸附，中空纤维膜的临界表面张力需要是至少45 mN/m和至多75 mN/m ο尽管聚偏氟乙烯自身的临界表面张力是约33 mN/m,但它可以通过在碱性水溶液中的处理增加至至少45 mN/m。进一步地，因为乙烯-乙烯醇共聚物的临界表面张力是至少70 mN/m，所以由乙烯-乙烯醇共聚物涂覆的聚偏氟乙烯中空纤维膜可以具有至少70mN/m的临界表面张力。中空纤维膜的临界表面张力的值定义为干燥状态的中空纤维膜可以由其润湿的液体的表面张力的上限。中空纤维膜的临界表面张力的值可以通过例如使用根据JIS K 6768由Wako Pure Chemical Industries, Ltd.制造的用于润湿指数的标准溶液进行测量。更特别地，制备具有一系列不同表面张力的多个标准溶液，并且将标准溶液各自滴到中空纤维膜上。所得到的小滴随后在膜表面上展开。在这些标准溶液中，在其下表面可以保持湿润至少2秒而无滴落标准溶液的液膜破裂的表面张力值的上限可以测定为临界表面张力。 在本发明中，根据需要，由聚偏氟乙烯树脂组成的多孔中空纤维膜的表面可以由乙烯醇共聚物覆盖。其表面由乙烯醇共聚物覆盖的，由聚偏氟乙烯树脂组成的本发明的多孔中空纤维膜优选通过下列步骤进行制备用乙烯-乙烯醇共聚物溶液浸溃由聚偏氟乙烯树脂组成的多孔中空纤维膜，所述乙烯-乙烯醇共聚物溶液包含乙烯-乙烯醇共聚物和对于聚偏氟乙烯惰性并且溶解乙烯-乙烯醇共聚物的溶剂，从而允许乙烯-乙烯醇共聚物溶液渗透到中空纤维膜内的孔内，其随后为通过干燥从具有在中空纤维膜内的厚度的部分中存在的孔中去除溶剂。通过执行此类步骤，可以稳定产生具有高过滤稳定性的中空纤维膜。因为乙烯-乙烯醇共聚物是具有高污染抗性和高耐热性并且在水中不可溶的材料，所以共聚物适合作为用于涂覆膜的材料。在本发明中，“中空纤维膜的表面由乙烯-乙烯醇共聚物涂覆”意指多孔中空纤维膜在其一个或多个特定表面上部分由乙烯-乙烯醇共聚物涂覆，例如内表面、外表面和/或在孔内的表面；或多孔中空纤维膜的所有表面包括内表面、外表面和在孔内的表面由乙烯-乙烯醇共聚物涂覆。通过将乙烯-乙烯醇共聚物涂层应用于一个或多个特定表面或整个表面，可以提供适合于多种发酵液以及细菌、微生物和培养细胞的过滤膜，从而使得可以提供对于其稳定长期过滤是可能的过滤膜。因为本发明的聚偏氟乙烯中空纤维膜具有高强度和高耐压力，所以聚偏氟乙烯中空纤维膜可以通过用乙烯-乙烯醇共聚物进一步涂覆其表面进一步制备，以具有高强度、高耐压和极佳的污染抗性。尽管聚偏氟乙烯自身是疏水性的，但碱处理等增加聚偏氟乙烯中空纤维膜的表面和膜内的孔表面的润湿性，允许膜由乙烯-乙烯醇共聚物的有效涂覆。乙烯-乙烯醇共聚物是通过使乙烯和乙酸乙酯共聚化且使乙酸酯部分皂化(水解)为衍生自乙酸乙酯的侧链、从而将侧链转换为羟基而合成的结晶热塑性树脂。考虑到涂覆效率，在本发明中使用的乙烯-乙烯醇共聚物的乙烯含量优选至少20摩尔％，并且考虑到污染抗性至多60摩尔％。皂化程度优选尽可能高，并且考虑到机械强度，更优选至少80摩尔％。特别优选地，共聚物是基本上完全皂化的，具有至少99摩尔％的皂化程度。根据需要，一种或多种添加剂例如抗氧化剂和/或润滑剂可以加入乙烯-乙烯醇共聚物中，只要它们不损坏本发明的目的。就整个中空纤维膜而言，由乙烯-乙烯醇共聚物涂覆的本发明的聚偏氟乙烯中空纤维膜具有考虑到针对有机物质等的污染抗性优选按重量计至少O. 1%、和考虑到渗透性按重量计至多10%的乙烯-乙烯醇共聚物的涂覆量。涂覆量更优选按重量计至少O. 5%和按重量计至多7%，更加优选按重量计至少1%和按重量计至多5%。涂覆优选在中空纤维膜的内和外表面以及具有在纤维内的厚度的部分中细孔的表面上均匀地执行。
通过使用上述膜，揭示不需要过度动力用于洗涤膜表面的操作可以更简单地执行。在这个操作中，具有三维网状结构的氟碳树脂聚合物分离膜的平均孔径在本发明中是至少O. 001 μπι和至多10.0 μ Hlo在平均表面孔径的这个范围内，孔更不太可能由液体中的污染物堵塞，并且因此渗透性更不太可能降低，从而使得氟碳树脂聚合物分离膜可以连续使用更长时间。进一步地，通过考虑到渗透性将孔隙率设为至少40%并且将临界表面张力设为至少45 mN/m和至多75 mN/m，关于发酵液的过滤性能增加，并且合适的表面张力可以得到维持，从而使得引起堵塞的物质更不太可能附着至膜，从而使得连续发酵可以用小跨膜压力差执行，膜更不易于堵塞，并且即使在其中发生堵塞的情况下，与其中操作由大跨膜压力差执行的情况下相比较，膜也可以通过洗涤更容易地恢复。因此，稳定长期过滤可以更容易地执行。本发明用于生产化学制品的方法使用发酵原料。在本发明中使用的发酵原料不受限制，只要它促进待培养微生物的生长且允许目的发酵产物的有效生产。在本发明中使用的发酵原料优选是正常液体培养基，其包含一个或多个碳源、一 个或多个氮源和/或一种或多种无机盐和/或根据需要的一种或多种有机微量营养素例如一种或多种氨基酸和/或一种或多种维生素。一个或多个碳源的例子包括糖例如葡萄糖、蔗糖、果糖、半乳糖和乳糖；淀粉糖化液体、番薯糖蜜、甜菜糖蜜和含有这些糖的高测试糖蜜；有机酸例如乙酸；醇例如乙醇；和甘油。一个或多个氮源的例子包括氨气；氨水；铵盐；尿素；硝酸盐；及其他补充使用的有机氮源，例如油渣饼、大豆水解液、酪蛋白消化物、其他氨基酸、维生素、玉米浆、酵母或酵母提取物、肉提取物、肽包括胨、和多种发酵微生物的细胞及其水解产物。适当时可以加入的一种或多种无机盐的例子包括磷酸盐、镁盐、钙盐、铁盐和猛盐。在其中在本发明中使用的微生物需要特定营养素用于其生长的情况下，营养素可以作为含有它们的制剂或天然产物加入。根据需要还可以加入止泡剂。在本发明中的发酵液意指由于在发酵原料中细菌、微生物或培养细胞的生长获得的液体。待加入的发酵原料的组成可以在合适时由在培养开始时发酵原料的组成改变，从而使得目的化学制品的生产增加。在本发明中，在发酵液中的糖类浓度优选保持在至多5 g/L。发酵液中的糖类浓度为何优选保持在至多5 g/L的原因是通过其可以使经由发酵液取出的糖类丧失降到最低。微生物或细胞通常在pH 3 - 8和15 - 40°C的温度培养，但在其中使用特别高温的微生物或细胞时，培养可以可替代地在40 - 65°C的温度执行。发酵液的pH通常调整至在3 - 8范围内的预定值，使用无机或有机酸、碱性物质、尿素、碳酸钙、氨气等。当氧补料速率需要增加时，意指可以采用例如其中将氧加入空气中以维持氧浓度在至少21% ；培养在压力下执行；搅拌速率增加；或通气速率增加的那些。在本发明用于生产化学制品的方法中，分批培养或补料分批培养可以在培养的初期执行，以增加微生物浓度，随后起始连续培养(取出)。在本发明用于生产化学制品的方法中，微生物浓度可以首先是增加的，并且其后可以种植以高浓度的微生物细胞，随后从培养开始时执行连续培养。在本发明用于生产化学制品的方法中，可以在一个或多个合适时机起始供应发酵原料液和培养物的取出。发酵原料液供应的起始时机和培养物取出的起始时机不一定是相同的。发酵原料液的供应和培养物的取出可以连续或间歇执行。
微生物细胞生长所需的营养素可以加入发酵原料液中，以允许微生物细胞的连续生长。考虑到达到有效生产，在发酵培养基中细菌、微生物或培养细胞的浓度优选以高速率维持为高的，在不由于对于细菌、微生物或培养细胞的生长不合适的发酵培养基环境引起细菌、微生物或培养细胞高比率死亡的范围内。例如，通过使细菌、微生物或培养细胞的浓度维持在就干重而言至少5 g/L，可以获得良好的生产效率。在本发明用于生产化学制品的方法中，细菌、微生物或培养细胞可以根据需要从发酵罐的内部去除。例如，如果在发酵罐中细菌、微生物或培养细胞的浓度太高，那么很可能发生分离膜的堵塞。堵塞可以通过细胞的去除得到预防。进一步地，化学制品的生产性能可以取决于发酵罐中细菌、微生物或培养细胞的浓度而改变，并且使用生产性能作为指数，生产性能因此可以通过去除细菌、微生物或培养细胞得到维持。在本发明用于生产化学制品的方法中，发酵罐的数目不受限制，只要在具有发酵生产能力的新鲜微生物细胞生长时执行的连续培养的操作是连续培养方法，其中在生长微生物细胞时生产产物。在本发明用于生产化学制品的方法中，考虑到控制培养，连续培养的 操作通常优选在单一发酵罐中执行。因为每个发酵罐的小容量，也可以使用多个发酵罐。在此类情况下，通过用经由管彼此平行或串联连接的多个发酵罐执行连续发酵，可以以高生产力获得发酵产物。可以在本发明的方法中用于生产化学制品的微生物或培养细胞在下文描述。在本发明用于生产化学制品的方法中使用的细菌、微生物或培养细胞不受限制。在本发明中使用的细菌、微生物或培养细胞的例子包括通常用于发酵工业中的酵母，例如面包酵母；细菌例如大肠杆菌(疋coli)和棒状菌；丝状真菌；放线菌；动物细胞和昆虫细胞。待使用的微生物或细胞可以是从天然环境中分离的那些，或可以是其性质通过突变或遗传重组部分修饰的那些。通过本发明用于生产化学制品的方法生产的化学制品不受限制，只要化学制品是通过发酵液中的微生物或细胞生产的物质。通过本发明用于生产化学制品的方法生产的化学制品的例子包括在发酵工业中大量生产的物质，例如醇、有机酸和核酸。醇的例子包括乙醇、1，3-丙二醇、1，4- 丁二醇和甘油；有机酸的例子包括乙酸、乳酸、丙酮酸、琥珀酸、苹果酸、衣康酸和朽1檬酸；核酸的例子包括核苷例如肌苷和鸟苷，和核苷酸例如肌苷酸和鸟苷酸；并且上述物质的例子还包括二胺化合物例如尸胺。本发明还可以应用于生产物质例如酶、抗生素和重组蛋白质。可以在本发明用于生产化学制品的方法中使用的细菌、微生物或培养细胞目前将通过化学制品的具体例子进行描述。当L-乳酸通过本发明用于生产化学制品的方法生产时，可以用于L-乳酸生产的细菌、微生物或培养细胞不受限制，只要这些细胞是可以生产L-乳酸的细菌细胞、微生物或细胞。在本发明用于生产化学制品的方法中，乳酸细菌可以优选用作可以用于生产L-乳酸的细菌、微生物或培养细胞。乳酸细菌在本文中可以定义为以相对于葡萄糖消耗至少50%的收率生产乳酸的原核微生物。乳酸细菌的优选例子包括属于下述属的那些乳杆菌属 iLactobaciIlus )、片球菌属 QPediococcus )、四体球菌属(7 tragenococcus )、肉食杆菌属(Camobac teria )、漫游球菌属(Vagococcus )、明串珠菌属(Xgucoiios toe )、酒球菌属(Oenococcus )、奇异菌属topobia )、链球菌属(51 trep tococcus )、肠球菌属CfeterococciAs)、乳球菌属(ZaciococciAs)和芽抱杆菌属{Bacillus、。在这些中，可以选择相对于葡萄糖消耗具有乳酸高收率的乳酸细菌，以优选用于乳酸的生产。在本发明用于生产化学制品的方法中，可以选择在乳酸中相对于葡萄糖消耗具有L-乳酸高收率的乳酸细菌，以优选用于乳酸的生产。L-乳酸是乳酸的旋光异构体，并且可以与其对映异构体D-乳酸明确区分。相对于葡萄糖消耗具有L-乳酸高收率的乳酸细菌的例子包括山梨乳杆菌{Lactobacillus Tafflafla1S1Aiefl1Si1S)、动物乳杆菌{Lactobacillus
敏捷乳杆菌{LactobaciIlus agi/is)、鸟乳杆菌{LactobaciIlus aviaries')、干酪乳杆菌 iLac tobaciIlus casei )、德氏乳杆菌 iLac tobaciIlus delbruekii )、副干酪乳杆菌 iLac tobaciIlus paracasei )、鼠李糖乳杆菌 iLac tobaciIlusrhamnosus )、瘤胃乳杆菌 iLac tobaciIlus rumini5·)、唾液乳杆菌(Mac tobaciIlus sali vari)、沙氏乳杆菌(Lac tobaciIlus sharpeae )、糊精片球菌 iPediococcus dex trinicus )、凝结芽抱杆菌{BadIlus coagwJaas)和乳酸乳杆菌iLactococcus IacHs),并且这些可以选择用于L-乳酸的生产。当L-乳酸通过本发明用于生产化学制品的方法进行生产时，可以使用对于其人工给予生产乳酸的能力的细菌、微生物或培养细胞。例如，可以使用对于其引入L-乳酸脱氢酶基因(其在下文中可以称为L-LDH)以给予或增强其生产L-乳酸的能力的细菌、微生物或培养细胞。给予或增强生产L-乳酸的能力的方法的例子还包括基于化学诱变的已知方法。微生物的优选例子包括L-LDH引入其内以增强其生产L-乳酸的能力的重组微生物。当L-乳酸通过本发明用于生产化学制品的方法进行生产时，关于重组微生物的宿主优选是原核细胞例如大肠杆菌或乳酸细菌，或真核细胞例如酵母。宿主特别优选酵母。在酵母中，属于酵母属的那些是优选的，并且酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)是更优选的。在本发明中使用的L-LDH不受限制，只要它编码具有将还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)和丙酮酸转换为氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)和L-乳酸的活性的蛋白质。例如，可以使用衍生自相对于葡萄糖消耗具有L-乳酸高收率的乳酸细菌的L-LDH。可以适当地使用衍生自哺乳动物的L-LDHs。在这些中，可以使用衍生自智人sapiensy^衍生自青娃的L-LDHs。优选使用衍生自在青娃中属于负子蟾科(Pipidae)的青娃的L-LDH,并且更优选使用衍生自在属于负子蟾科的青娃中的光滑爪蟾Iaevis、的L-LDH。在本发明中使用的人或青蛙衍生的L-LDH的例子包括具有遗传多态性的基因和通过诱变产生的变体基因。术语“遗传多态性”意指由于基因中的自发突变在基因的碱基序列中的部分变化。术语“诱变”意指突变人工引入基因内。诱变方法的例子包括使用定点诱变试剂盒(Mutan-Κ (由TAKARA BIO INC.制造))的方法和使用随机诱变试剂盒(BDDiversify PCR Random Mutagenesis (CL0NTECH))的方法。在本发明中使用的人或青娃衍生的L-LDH可以具有在其碱基序列中的部分缺失和/或插入，只要基因编码具有将NADH和丙酮酸转换为NAD+和L-乳酸的活性的蛋白质。当L-乳酸通过本发明用于生产化学制品的方法进行生产时，通过用于浓缩、蒸馏、结晶等的已知方法的组合，可以分离且纯化通过经由分离膜过滤获得的滤液中含有的L-乳酸。方法的例子包括其中将滤液的pH调整至至多1，随后用二乙醚、乙酸乙酯等萃取 L-乳酸的方法；其中允许L-乳酸吸附至离子交换树脂，随后为洗涤和L-乳酸的随后洗脱的方法；其中允许L-乳酸在酸催化剂的存在下与醇反应以产生酯，随后对所述酯实施蒸馏的方法；和其中L-乳酸结晶为钙盐或锂盐的方法。优选地，可以蒸发在滤液中的水，以制备浓缩L-乳酸溶液，随后可以对于其实施蒸馏。此处，蒸馏优选在供应水时执行，从而使得起始蒸馏液中的水浓度保持恒定。在L-乳酸水溶液蒸馏后，通过加热蒸发水以浓缩溶液，并且从而可以获得所需浓度的纯化L-乳酸。在其中获得含有一种或多种低沸点组分例如乙醇和/或乙酸的L-乳酸水溶液作为馏出液的情况下，在优选实施方案中在L-乳酸浓缩过程期间去除一种或多种低沸点组分。在蒸馏后，根据需要，使用离子交换树脂和/或活性碳，和/或通过层析分离，可以对馏出液实施杂质的去除，并且通过这一点，可以获得具有更高纯度的L-乳酸。当D-乳酸通过本发明用于生产化学制品的方法进行生产时，可以用于D-乳酸生产的细菌、微生物或培养细胞不受限制，只要这些细胞是可以生产D-乳酸的细菌细胞、微生物或细胞。就野生型菌株而言，可以用于D-乳酸生产的细菌、微生物或培养细胞的例子包括微生物，例如属于乳杆菌属、芽孢杆菌属和片球菌属的那些，其具有合成D-乳酸的能力。当D-乳酸通过本发明用于生产化学制品的方法进行生产时，优选增强野生型菌株中D-乳酸脱氢酶(其在下文中可以称为D-LDH)的酶活性。作为用于增强酶活性的方法，还可以使用通过化学诱变的已知方法。更优选地，将编码D-乳酸脱氢酶的基因引入微生物内，以制备具有增强的D-乳酸脱氢酶活性的重组微生物。当D-乳酸通过本发明用于生产化学制品的方法进行生产时，关于重组微生物的宿主优选是原核细胞例如大肠杆菌或乳酸细菌，或真核细胞例如酵母。宿主特别优选酵母。当L-乳酸通过本发明用于生产化学制品的方法进行生产时，编码D-乳酸脱氢酶的基因优选衍生自植物乳杆菌(Xactobacillus乳酸片球菌QPediococcusacidilactici )或左旋乳酸芽孢杆菌{Bacillus laevolacticus ),更优选衍生自左旋乳酸芽孢杆菌。当D-乳酸通过本发明用于生产化学制品的方法进行生产时，通过用于浓缩、蒸馏、结晶等的已知方法的组合，可以分离且纯化过滤/分离的发酵液中含有的D-乳酸。方法的例子包括其中将过滤/分离的发酵液的PH调整至至多1，随后用二乙醚、乙酸乙酯等萃取D-乳酸的方法；其中允许D-乳酸吸附至离子交换树脂，随后为洗涤和随后洗脱的方法；其中允许D-乳酸在酸催化剂的存在下与醇反应以产生酯，随后对所述酯实施蒸馏的方法；和其中D-乳酸结晶为钙盐或锂盐的方法。当D-乳酸通过本发明用于生产化学制品的方法进行生产时，可以蒸发在过滤/分 离的发酵液中的水，以制备浓缩D-乳酸溶液，随后可以对于其实施蒸馏。此处，蒸馏优选在供应水时执行，从而使得起始蒸馏液中的水浓度保持恒定。在D-乳酸水溶液蒸馏后，通过加热蒸发水以浓缩溶液，并且从而可以获得以所需浓度的纯化D-乳酸。在其中获得含有一种或多种低沸点组分(例如乙醇和/或乙酸)的D-乳酸水溶液作为馏出液的情况下，在优选实施方案中在D-乳酸浓缩过程期间去除一种或多种低沸点组分。在蒸馏后，根据需要，使用离子交换树脂和/或活性碳，和/或通过层析分离，可以对馏出液实施杂质的去除，并且通过这一点，可以获得具有更高纯度的D-乳酸。当乙醇通过本发明用于生产化学制品的方法进行生产时，可以用于乙醇生产的细菌、微生物或培养细胞不受限制，只要这些细胞是可以生产丙酮酸的细菌细胞、微生物或细胞。可以用于乙醇生产的细菌、微生物或培养细胞的例子包括酵母，例如属于酵母属、克鲁维酵母属和裂殖酵母属的那些。在这些中，可以适当地使用酿酒酵母(Saccharomycescere, dsiae)、乳酸克鲁维酵母iKluyveromyceslactis)和粟酒裂殖酵母pombe) 还可以优选使用属于乳杆菌属和发酵单孢菌属(办 OffiOfla1S)的细菌。在这些中，适当地使用短乳杆菌brevi5·)和运动发酵单抱菌iZymomonas mobilis.)。可以在本发明中用于生产乙醇的细菌、微生物或培养细胞可以是其生产乙醇的能力得到人工增强的细菌、微生物或培养细胞。更特别地，可以在本发明中用于乙醇生产的细菌、微生物或培养细胞可以是其性质通过突变或遗传重组部分修饰的那些。其性质被部分修饰的细胞的例子包括通过掺入属于根霉菌属iRhizopus)的真菌的葡糖淀粉酶基因获得利用生淀粉的能力的酵母。通过本发明的生产方法生产的过滤/分离的发酵液中含有的乙醇的分离/纯化方法的优选例子包括通过蒸馏的纯化方法和使用NF、R0膜或沸石分离膜的浓缩/纯化方法。 在其中根据本发明用于生产化学制品的方法执行连续发酵的情况下，与常规分批发酵相比较，可以获得更高的生产率/体积，从而使得非常有效的发酵生产是可能的。此处，在连续培养中的生产率可以根据下式进行计算。发酵生产率(g/L/小时)=在取出液体中产物的浓度(g/L) X发酵液的取出率(L/小时)/仪器的运转液体量(L)
在分批培养中的发酵生产率可以通过将发酵原料中碳源的完全消耗后的产物量(g)除以碳源消耗所需的时间(小时)和在那个时间发酵液的量(L)进行测定。本发明的连续发酵仪器目前在下文描述。本发明的连续发酵仪器可以应用于生产醇例如乙醇、1，3-丙二醇、1，4- 丁二醇和甘油；有机酸例如乙酸、乳酸、丙酮酸、琥珀酸、苹果酸、衣康酸和柠檬酸；氨基酸例如L-苏氨酸、L-赖氨酸、L-谷氨酸、L-色氨酸、L-异亮氨酸、L-谷氨酰胺、L-精氨酸、L-丙氨酸、L-组氨酸、L-脯氨酸、L-苯丙氨酸、L-天冬氨酸、L-酪氨酸、甲硫氨酸、丝氨酸、缬氨酸和赖氨酸；核酸例如肌苷和鸟苷，二胺化合物例如尸胺；酶；抗生素；和重组蛋白质。本发明的连续发酵仪器是用于通过连续发酵生产化学制品的仪器，其中由细菌、微生物或培养细胞获得的发酵液通过分离膜过滤，以从滤液中回收化学制品；未过滤的液体在发酵液中保留或返流；并且将发酵原料加入发酵液中。在本发明用于生产化学制品的方法中使用的连续发酵仪器在下文参考附图详细描述。图I是用于解释在本发明用于生产化学制品的方法中使用的膜分离型连续发酵仪器的例子的示意图。在图I中，膜分离型连续发酵仪器基本上由发酵罐I和膜分离模块
2构成。此处，对于膜分离模块2，使用中空纤维膜。膜分离模块2通过发酵液循环泵10与发酵罐I连接。在图I中，培养基通过培养基供应泵7连续或间歇注入发酵罐I。根据需要，可以对培养基实施热消毒或热灭菌，或在补料前使用滤器的灭菌处理。进一步地，根据需要，必需气体可以通过气体供应装置4供应。可以将供应气体回收且再循环，随后用气体供应装置4将其再次供应。进一步地，根据需要，发酵液的pH可以用pH传感器/控制装置9和pH调整溶液供应泵8进行调整，并且进一步地，根据需要，发酵液的温度可以通过温度控制器3进行调整，以执行高生产的发酵生产。此处，pH和温度显示为待通过探测/控制装置控制的发酵液的物理化学条件的例子，但根据需要，可以控制溶解氧和/或0RP，并且通过分析装置例如联机操作的化学传感器，可以测量发酵液中化学制品的浓度，随后使用发酵液中化学制品的浓度作为指数控制物理化学条件。当执行培养基的连续或间歇补料时，使用发酵液的物理化学环境值作为指数适当地控制培养基补料的量和速率，所述值通过操作装置进行测量。在仪器中的发酵液通过发酵液循环泵10在发酵罐I和分离膜模块2之间循环。含有发酵产物的发酵液通过分离膜模块2过滤/分离成微生物和发酵产物，其随后可以从仪器系统中取出。当需要时，可以测量在管上对于通过循环泵送出的发酵液的压力和在管上对于通过过滤获得的滤液的压力，以测定差压，其随后可以用于控制膜过滤操作。过滤/分离的微生物可以允许保留在仪器系统中，并且仪器系统中的微生物浓度从而可以保持为高的，从而使得高生产力的发酵生产是可能的。 进一步地，根据需要，必需气体可以通过气体供应装置4供应到分离膜模块2内。可以将供应气体回收且再循环，随后用气体供应装置4将其再次供应。根据需要，通过用过滤泵12等的吸滤，或通过增压仪器系统的内部，可以执行用分离膜模块2的过滤/分离。细菌、微生物或培养细胞可以通过连续发酵在培养槽中培养，且根据需要供应到发酵罐内。通过经由连续发酵在培养槽中培养细菌、微生物或培养细胞且根据需要将它们供应到发酵罐内，使用具有生产化学制品的高能力的新鲜细菌、微生物或培养细胞的连续发酵始终是可能的，从而使得可以执行连续发酵，同时长时间维持高生产力。目前将描述图2中所示的分离膜模块。如图2中所示，分离膜模块主要由通过中空纤维膜构成的分离膜束22、以及上层树脂密封层23和下层树脂密封层21构成。分离膜束通过吸附至/固定在上层密封层23和下层树脂密封层21形成束状。中空纤维膜的中空部分通过吸附至/固定在下层树脂密封层进行密封，并且应用此类结构，预防发酵液的渗漏。另一方面，上层密封层23不密封中空纤维膜的内孔，并且应用此类结构，允许过滤液流动到液体收集管24内。通过经由分离膜束22过滤获得的过滤液通过中空纤维膜的中空部分,并且通过液体收集管24去除至发酵培养槽的外部。作为去除过滤液的动力,可以使用使用液压头压力差、泵、液体、气体等的吸滤，通过增压仪器系统的内部的方法等。构成在本发明用于生产化学制品的方法中使用的连续发酵仪器的分离膜模块的成员优选对高压灭菌是有抵抗力的。如果发酵仪器的内部可以灭菌，那么可以避免在连续发酵过程中由不利细菌、微生物或培养细胞污染的危险，并且更稳定的连续发酵因此是可能的。构成分离膜模块的成员优选对于在121°C、20分钟的处理是有抵抗力的，这是高压灭菌的条件。可以优选选择的分离膜模块的成员的例子包括金属例如不锈钢和铝；和树脂例如聚酰胺树脂、氟碳树脂、聚碳酸酯树脂、聚缩醛树脂、聚对苯二甲酸丁二酯树脂、PVDF^性聚苯醚树脂和聚砜树脂。在本发明用于生产化学制品的方法中使用的连续发酵仪器中，膜分离模块优选是可灭菌的。如果膜分离模块是可灭菌的，那么可以容易地避免由微生物的污染。实施例关于本发明的更详细描述，选择L-乳酸、乙醇和琥珀酸作为上述化学制品的例子，并且目前将通过实施例描述使用图I中的示意图中所示的仪器，通过具有生产每种化学制品能力的细菌、微生物或培养 细胞的连续发酵的具体实施方案。通过“具体实施方案”部分中描述的方法测量所获得的中空纤维膜的如通过半干法测定的外径、内径、孔隙率、平均孔径，如通过泡点法测定的最大孔径，纯水渗透系数、临界表面张力、卷曲度、拉伸断裂强度和拉伸断裂伸长率。进一步地，通过下述方法测量所获得的中空纤维膜的拉伸弹性模量、压缩弹性模量和瞬时抗压强度。拉伸弹性模量
使用拉力测试机(TENSILON (注册商标VRTM-IOO)(由Toyo Baldwin制造)，将湿中空纤维膜以50 mm的卡距和200 mm/分钟的拉速牵拉，并且基于在断裂时的负荷和位移，根据下式测定拉伸断裂强度和拉伸断裂伸长率。测量在温度25°C和相对湿度40 - 70%的房间中进行。拉伸断裂强度[Pa]=在断裂时的负荷[N] /膜的截面积[m2]
此处，膜的截面积[m2] = π X {(外径[m] / 2)2 -(内径[m] / 2)2}。拉伸断裂伸长率[%] = 100 X在断裂时的位移[mm] / 50 [mm]
通过在上述拉力测试机中基于在O. 1%位移时的负荷和在5%位移时的负荷测定在100%位移时的负荷，并且将在100%位移时的负荷除以膜的截面积，测定拉伸弹性模量[Pa]。压缩弹性模量
使用压缩测量装置(AGS-H/EZtest,由Shimadzu Corporation制造)，使用具有5 mm宽度的夹具用于压缩，对湿中空纤维膜的5-_段实施相对于纤维的纵向方向压缩位移的测量和垂直方向中的负荷。压缩率是I mm/分钟，并且相对于中空纤维膜的初始直径，基于在O. 1%位移时的负荷和在5%位移时的负荷测定在100%位移时的负荷。用通过将中空纤维的初始外径乘以5 mm (其是中空纤维膜长度)获得的伸出截面积标准化在100%位移时的负荷，以测定压缩弹性模量。测量在温度25°C和相对湿度40 - 70%的房间中进行。以相同方式用干燥样品测量以履带厚度的方向的压缩弹性模量。瞬时抗压强度
将其一端密封的湿中空纤维膜置于填充40°C纯水的抗压容器中。外表面侧由纯水液体紧密充满，并且内表面侧中的中空部分保持对于大气开放。水压用空气增加至O. 05 MPa共15秒，并且获得从中空纤维的外表面侧进入内表面侧的过滤液体(外部压力方法)。测量在15秒中过滤的液体的量，并且随后将压力进一步增加O. 05 MPa共15秒，随后再次测量在15秒中过滤的液体的量。将这个循环继续重复。在通过循环继续的压力增加过程中，膜坍塌，导致秒中过滤液体的量中的降低。在其下过滤液体的量达到最大的压力定义为瞬时抗压强度[Pa]。使用扫描电子显微镜(S-800)(由Hitachi，Ltd.制造)在X 10000的放大率时获得聚合酶分离膜的截面图片，并且用膜截面的这个图片，证实三维网状结构的存在/不存在和具有至少8 μ m直径的大孔的存在/不存在。参考实施例I具有生产L-乳酸能力的酵母菌株的制备
如下所述建立具有生产L-乳酸能力的酵母菌株。将人衍生的LDH基因连接到酵母基因组上roci启动子的下游，以建立具有生产L-乳酸能力的酵母菌株。根据所附的说明书，使用 La-Taq (Takara Shuzo Co.，Ltd.)或 KOD-Plus-聚合酶(Toyobo Co.，Ltd.)执行聚合酶链反应(PCR)。在培养且收集人乳腺癌细胞系(MCF-7)后，使用TRIZOL Reagent(Invitrogen)由其提取总RNA。所获得的总RNA用作模板用于使用Super Script ChoiceSystem (Invitrogen)的逆转录反应,并且从而合成cDNA。根据与每种产品所附的方案中的细节执行这些操作。所得到的cDNA用作扩增模板用于后续PCR。使用通过上述操作获得的cDNA作为扩增模板、SEQ ID NO: I和SEQ ID NO: 2中所示的寡核苷酸作为引物组、和KOD-Plus-聚合酶执行PCR，以执行L-Idh基因的克隆。将每个PCR扩增片段纯化，并且使用T4多核苷酸激酶(由TAKARA BIO INC.制造)磷酸化其末端，随后为片段连接到PUC118载体(通过用消化和切割位点的脱磷酸化制备)内。使用DNA Ligation Kit Ver. 2 (由TAKARA BIO INC.制造)执行连接。将大肠杆菌DH5 α用连接质粒产物转化，并且将质粒DNA回收，以获得其中每个L-Idh基因(SEQ ID Ν0:3)亚克隆 的质粒。将其中插入L-Idh基因的所得到的PUC118质粒用限制性酶通01和AfoiI消化，并且将每个所得到的DNA片段插入酵母表达载体pTRSlI的通οΙ/Λ^ Ι切割位点内(图3)。因此，获得人衍生的L-Idh基因表达质粒pL-ldh5(L-ldh基因)。其为人衍生的L-Idh基因表达载体的上述pL_ldh5已作为质粒自身在登记号FERM AP-20421下保藏于InternationalPatent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Scienceand Technology (AIST Tsukuba Central 6,1-1-1 Higashi, Tsukuba, Ibaraki,日本X使用含有人衍生的LDH基因的质粒pL_ldh5作为扩增模板，以及由SEQ ID NO:4和SEQ ID NO: 5表示的寡核苷酸作为引物组，执行PCR以扩增含有人衍生的LDH基因和衍生自酿酒酵母的TDH3基因的终止子序列的I. 3-kb DNA片段。进一步地，使用质粒pRS424作为扩增模板，以及由SEQ ID N0:6和SEQ ID NO:7表示的寡核苷酸作为引物组，执行PCR以扩增含有衍生自酿酒酵母的TRPl基因的I. 2-kb DNA片段。将每个DNA片段通过I. 5%琼脂糖凝胶电泳分开，并且根据常规方法纯化。将因而获得的I. 3-kb片段和I. 21-kb片段彼此混合。使用所得到的混合物作为扩增模板，以及由SEQ ID N0:4和SEQ ID NO: 7表示的寡核苷酸作为引物组，执行PCR以扩增产物，随后对所述产物实施I. 5%琼脂糖凝胶电泳，以根据常规方法制备其中连接人衍生的LDH基因和TRPl基因的2. 5-kb DNA片段。2. 5_kb DNA片段用于将芽殖酵母NBRC10505菌株转化成色氨酸营养缺陷型。如下证实人衍生的LDH基因连接到所得到的转化细胞的酵母基因组中roCl启动子的下游的事实。根据常规方法制备转化细胞的基因组DNA，并且使用DNA作为扩增模板以及由SEQ ID N0:8和SEQ ID NO:9表示的寡核苷酸作为引物组，执行PCR以察看是否从而获得O. 7-kb扩增DNA片段。进一步地，通过研究在SC培养基(METHODS IN YEASTGENETICS,2000 EDITION, CSHL PRESS)中培养转化细胞后的培养上清液是否含有乳酸证实转化细胞具有生产乳酸的能力，所述研究通过在下述条件下经由HPLC测量乳酸的量执行。柱Shim-PackSPR-H (由 Shimadzu Corporation 制造)
流动相5 mM对甲基苯磺酸(流速0. 8 mL/分钟)反应溶液5 mM对甲基苯磺酸，20 mM Bis-Tris, O. I mM EDTA*2Na (流速0.8 mL/分
钟)
检测方法电导率 温度45°C
在下述条件下通过HPLC执行L-乳酸的光学纯度的测量。柱TSK-gelEnantio LI (由 Tosoh Corporation 制造)
流动相1 mM硫酸铜水溶液
流速:1· O ml/分钟 检测方法=UV 254 nm温度30°C
通过下式计算L-乳酸的光学纯度。光学纯度(％)=100X (L-D)/ (L+D)
(其中L代表L-乳酸的浓度，并且D代表D-乳酸的浓度)。作为HPLC分析的结果，检测到4 g/L L-乳酸，并且D-乳酸的浓度低于检测极限。根据上述研究，证实转化体具有生产L-乳酸的能力。将所得到的转化细胞指名为酵母SW-I菌株且用于后续实施例中。参考实施例2
多孔中空纤维膜I的制备
按重量计以23%的量具有O. 016 μ m平均原始孔径和110 m2/g比表面积的疏水性二氧化硅(由 Nippon Aerosil Co.，Ltd.制造；AER0SIL (注册商标)-R972)与按重量计 30. 8%的邻苯二甲酸二辛酯和按重量计6. 2%的邻苯二甲酸二丁酯在Henschel混合器中混合，并且向其中加入具有280000的重均分子量按重量计40%的聚偏氟乙烯(由Kureha ChemicalIndustry制造KF聚合物#1000 (商标名))，随后再次用Henschel混合器混合所得到的混合物。将所得到的混合物用具有48 _直径的双轴挤压机进一步熔揉，以制成团块。将这些团块连续注入具有30 mm直径的双轴挤压机，并且在空气通过附着至挤压机尖端的圆形喷嘴供应到中空部分内时，在240°C执行熔体挤出。允许挤出物经过约20 cm的距离通过空气且随后以20 m/分钟的旋转速率通过40°C的水浴，以冷却且固化，以获得中空纤维膜。这种中空纤维膜通过以20 m/分钟速率的一对第一个履带型回收器连续回收，并且允许通过其空间温度控制在40°C的第一个加热槽(长度O. 8 m)。随后将中空纤维膜插入一对不规则形状的辊之间，所述辊置于20°C的冷却水浴的水表面上且具有约O. 20 m的周长和4个突起，并且辊以170 rpm的转动速率连续操作，以恒定间隔弯曲模同时冷却膜。其后，通过类似于第一个履带型回收器的40 m/分钟速率的第二个履带型回收器进一步回收膜，以2. O的拉伸比伸展膜。进一步允许膜通过其空间温度控制在80°C的第二个加热槽(长度0.8 m)，并且随后通过30 m/分钟速率的第三个履带型回收器回收，以达到以1.5比的收缩，随后缠绕成具有约3 m周长的绞(skein)。随后，将中空纤维膜形成束且浸入30°C的二氯甲烷中I小时，并且将其重复5次，以萃取邻苯二甲酸二辛酯和邻苯二甲酸二丁酯，随后干燥膜束。其后，将膜浸入按重量计50%乙醇水溶液中30分钟，并且转移到水内且在其中浸泡30分钟，以由水润湿中空纤维膜。将膜进一步浸入40°C按重量计5%的苛性钠水溶液中I小时，并且将其重复2次。这随后为通过将膜浸入40°C的温水中I小时的用水的10次洗涤以萃取疏水性二氧化硅，并且随后将
膜干燥。所得到的中空纤维膜具有如通过半干法测定的O. 29 μ m的平均孔径、如通过泡点法测定的O. 37 μ m的最大孔径、5. 8 m3/m2/小时的纯水渗透系数、8. 5 MPa的拉伸断裂强度、135%的拉伸断裂伸长率、2. 45的卷曲度、73%的孔隙率和54 mN/m的临界表面张力。结果概括于表I中。[表I]
中空纤维膜的测量结果
权利要求
1.ー种用于通过连续发酵生产化学制品的方法，其包括 通过分离膜过滤发酵液，以从所述滤液中回收所述化学制品，所述发酵液含有发酵原料，化学制品，以及细菌、微生物或培养细胞； 在所述发酵液中保留或返流未过滤的液体；和 将所述发酵原料加入所述发酵液中； 其中所述分离膜是由聚偏氟こ烯树脂组成的多孔中空纤维膜， 所述多孔中空纤维膜具有至少O. OOl μ m和至多10. O μ m的平均孔径，在25°C在50kPa至少O. 5 m3/m2/小时和至多15 m3/m2/小时的纯水渗透系数，至少5 MPa和至多20 MPa的断裂强度，至少30%和小于200%的断裂伸长率，至少I. 3和至多2. 5的卷曲度，至少40%的孔隙率，以及至少45 mN/m和至多75 mN/m的临界表面张力。
2.根据权利要求I用于通过连续发酵生产化学制品的方法，其中所述多孔中空纤维膜的表面由こ烯-こ烯醇共聚物涂覆。
3.根据权利要求I或2用于通过连续发酵生产化学制品的方法，其中所述多孔中空纤维膜通过如下制备用こ烯-こ烯醇共聚物溶液浸溃由聚偏氟こ烯树脂组成的多孔中空纤维膜，所述こ烯-こ烯醇共聚物溶液包含こ烯-こ烯醇共聚物和对于聚偏氟こ烯惰性并且溶解所述こ烯-こ烯醇共聚物的溶剂；随后为干燥处理。
4.根据权利要求I- 3中任ー项用于通过连续发酵生产化学制品的方法，其中所述发酵原料包含糖类。
5.根据权利要求I- 4中任ー项用于通过连续发酵生产化学制品的方法，其中所述 化学制品是有机酸、醇或核酸。
全文摘要
本发明提供了用于通过连续发酵生产化学制品的方法，其包括通过分离膜过滤发酵液，以从滤液中回收化学制品，所述发酵液含有发酵原料，化学制品，以及细菌、微生物或培养细胞；在发酵液中保留或返流未过滤的液体；和将发酵原料加入发酵液中；其中分离膜是由聚偏氟乙烯树脂组成的多孔中空纤维膜，所述多孔空心纤维膜具有至少0.001μm和至多10.0μm的平均孔径，在25℃在50kPa至少0.5m3/m2/小时和至多15m3/m2/小时的纯水渗透系数，至少5MPa和至多20MPa的断裂强度，至少30%和小于200%的断裂伸长率，至少1.3和至多2.5的卷曲度，至少40%的孔隙率，和至少45mN/m和至多75mN/m的临界表面张力，从而维持高物质生产力。
文档编号C12P1/00GK102712936SQ201180006764
公开日2012年10月3日 申请日期2011年1月24日 优先权日2010年1月28日
发明者千智勋, 峰岸进一, 武內纪浩, 西田诚 申请人:东丽株式会社