专利名称：用酶从甜菊苷中制备甜菊醇的方法
用酶从甜菊苷中制备甜菊醇的方法发明概沭本发明涉及一种通过使用含有果胶酶的可商购的酶混合物CYTOLASE PCL5 使糖苷残基从甜菊苷中裂解而生产甜菊醇的方法。在一些优选的方法中，反应在酵母的存在下进行。
背景技术：
Stevia rebaudiana (甜叶菊)含有甜味化合物，即甜菊苷(stevioside)和莱荀迪苷A(rebaudioside A),它们主要被用作无卡路里的甜味剂。甜菊醇(steviol)是这些化合物的苷元衍生物。甜菊醇可用于改善认知功能；参见例如WO 2009/071277 (DSM IP ASSETS,B. V.)。 从甜菊苷中生产甜菊醇很困难。甜菊苷的酸水解很麻烦，因为在酸性条件下，所制的甜菊醇重排变为异甜菊醇。甚至已有多个文献报导不能通过这种方法得到甜菊醇(Kohda等 1976 Phytochemistry 15 :981-983.)。Ogawa等1980 ；Tetrahedron 36 :2641-2648描述了一种使用高碘酸钠使甜菊苷裂解来生产甜菊醇的替代方法。然而，该方法需要高度稀释的体系和大量过量(约> IOmol当量)的昂贵的高碘酸钠来实现有用的产率。因此，对于生产大量甜菊醇来说，该方法不经济。下列文献描述了几种基于酶的方法Bridel 等 1931 Bull. Soc. Chimie Biol. 13 :781-96 指出，甜菊苷不能通过多种“发酵产物”(例如苦杏仁酶、鼠李糖化酶、AspergiIIus niger (黑曲霉)或浸软和风干底层的发酵酵母)来水解。作者利用来自蜗牛(Helix pomatia)的淀粉酶制剂获得了成功。然而，他们从每只动物中得到“仅O. 5cm3的纯的消化液”，因而不适合大规模生产。Mosettig等1955 J. Org. Chem. 20 =884-899也通过利用蜗牛的酶制剂(被称为“酶汁”和“干制剂”)使用葡糖苷的酶促水解来制备少量(小于O. 5克)的甜菊醇。没有给出酶的进一步特征。Khoda等在前述文献中报导了其他作者利用粗制的橘皮苷酶从甜菊苷中产生甜菊醇，但重复该方法时，得到莱苞迪苷B和葡萄糖，而不是期望的甜菊醇。Ruddat 等 1965 Arch.Biochem. Biophys. 110 :496-499 ；Gianfagna 等 1983Phytochemistry 22(2) :427-430 ；以及 Pezzuto 等 1985 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 2475-2482均描述了使用多种可商购的果胶酶(分别为来自Rohm & Haas的"Pectinol59L";来自 Corning Biosystems 的"Pectinol 50L";来自 Rohm & Haas 的"PectinolAC")的过程。Davis 等，1992 Phytopathology 82 :1244-50 报导了，" Pectinol 59L"不再是可商购的，并且不清楚其他果胶酶是否仍有售。需要一种从甜菊苷中生产甜菊醇的有效方法,并且该方法适于商业化大规模生产
发明内容
业已发现，根据本发明的可商购的酶制剂(CYTOLASE PCL5 )能使甜菊苷裂解以产生甜菊醇，并且可以被用在高效的、商业上可行的方法中。因而，本发明的一个方面是一种生产甜菊醇的方法，该方法包括a)使甜菊苷与CYTOLASE PCL5 酶制剂接触，并且b)回收甜菊醇。同样业已发现，在裂解期间释放的糖(葡萄糖)可抑制上述酶促反应。因此，优选地，上述反应在酵母的存在下进行。酵母可以除去所产生的葡萄糖，从而使酶促反应可以不受阻碍地进行。因此，本发明的另一方面是一种生产甜菊醇的方法，该方法包括a)在活酵母培养物的存在下，使甜菊苷与CYTOLASE PCL5 酶制剂接触，并且b)回收甜菊醇。
在整篇说明书中，化合物名称后面出现的数字指的是下列图中所描述的化合物。图I显示了莱苞迪苷A和甜菊苷的水解。图2显示了通过Helix pomatia酶和果胶酶使甜菊苷水解。" CYTOLASE PCL5"是可商购自DSM Food Specialties,Delft,The Netherlands的酶制剂。其为从选定的Aspergillus niger的GRAS株中得到的酶的混合物,包括果胶酶和半纤维素酶。其通常被用于生产具有低含量半乳糖醛酸的果汁和用于使水果汁制品澄清，也有其他用途的报导 其β -D-葡萄糖苷酶活性可用于制造葡萄酒和香槟(参见W01998/38316) 其β -吡喃葡萄糖苷酶和α -鼠李糖苷酶活性可用于水解类固醇糖苷以生产去葡萄糖去鼠李糖假叶树素(desglucodesrhamnoruscin,见 US 6,911,325)。"酵母"指的是 Saccharomyces cerevisceae、Saccharomyces pastorianus、或可以使用已知的技术用于大规模发酵的其他酵母菌种，前提是该酵母能将葡萄糖转化为二氧化碳和乙醇。该反应所用的甜菊苷起始物料不需要以提纯或分离的形式存在。在一个优选的实施方式中，它们以包含甜菊苷的植物提取物的形式存在，例如Stevia sp.提取物，更优选地以Stevia rebaudiana提取物的形式存在。提取物中也可能存在不可裂解的甜菊苷组分。优选的Stevia提取物包含较高浓度的甜菊苷和较低浓度的不可裂解的甜菊苷(例如莱苞迪苷A)，其随反应的时间进程积聚，使得该方法不太高效。提取物中甜菊苷的优选浓度为占所有甜菊苷的至少50%，优选> 90重量％。高含量的甜菊苷可以很容易地购买到。不完全清楚的是哪种酶适合介导使糖从甜菊苷中裂解以生产甜菊醇的反应。例如，一些果胶酶适合，但其他的不适合；类似的，一些β -葡糖苷酸酶适合，而其他的不适合。因此，研究了多种酶和酶混合物以确定其适用性。在多个所测的样品中，一些没有产生反应，甚至在培育4天之后。通过下列酶获得至少部分成功来自Helix pomatia 的 β -葡聚糖酶(FLUKA 49103)；来自Helix pomatia 的 H-3 型 β -葡糖苷酸酶(SIGMA G8885)；来自Helix pomatia 的 H-2 型 β -葡糖苷酸酶(SIGMA G0876)；来自Helix pomatia 的 HP-2 型 β -葡糖苷酸酶(SIGMA 7017)；
来自Aspergillus niger 的果胶酶(SIGMA PS4716)；来自Aspergillus aculeatus 的果胶酶(SIGMA P2611)；来自Helix pomatia 的 H-1 型硫酸酯酶(SIGMA S9626)；CYTOLASE PCL5 (DSM)在多种酶中，发现CYTOLASE PCL5 具有良好的活性并且是可商购的，因而是本发明优选的酶。此外，注意到，该酶是通过裂解的葡萄糖的产生进行反馈抑制的，而不被甜菊醇(其不是可水溶的)抑制。因此，尽管可以在其他反应物不存在的情况下通过用甜菊苷培育CYTOLASE PCL5 小规模生产甜菊醇，但对于大规模生产来说，由于葡萄糖的累积，这不是最优选的方法。
然而，根据本发明业已发现，通过酵母在最高40°C下发酵，直到葡萄糖转化为二氧化碳和乙醇，几乎能使酶活性恢复到最初的活性。该方法可以扩大至适合大规模生产甜菊醇的工业水平，这是迄今为止都不可能的。因此，本发明的另一方面是用于商业规模生产甜菊醇的方法，该方法包括在酵母发酵的条件下，使甜菊苷或莱苞迪苷与CYTOLASE PCL5⑧接触，然后回收所产生的甜菊醇。如果需要，在发酵步骤之后，剩余甜菊苷(例如存在于Stevia提取物中)的任选的进一步酶促水解可用于增大甜菊醇的量。因为该酶制剂在较高的温度下比酵母培养物稳定，所以酶促水解可以在比用于培养酵母的温度更高的温度下进行。例如，该温度可以高于400C，优选为约40-60°C，更优选为约55°C。底物对酶的潜在抑制可以通过连续加入Stevia提取物而避免，因而保持甜菊苷的浓度在较低的水平。因此，本发明的另一方面是—种用于商业规模生产甜菊醇的方法,该方法包括a)在发酵的条件下，为甜菊苷和CYTOLASE PCL5 提供酵母培养物，以产生包含甜菊醇的培养基；并且b)在培养基中、在升高的温度条件下水解至少部分剩余的甜菊苷，以产生富含甜
菊醇的培养基。富含甜菊醇的培养基可以原样使用，或者任选地，可以分离出甜菊醇并提纯(如果需要的话)。Stevia提取物的水解和葡萄糖的发酵可以同时进行，但由于酵母的tmax = 40°C,在40°C下总的水解速率比按顺序的水解和发酵时的速率低。酶的组合根据本发明还发现，CYTOLASE PCL5 (或来自Aspergillus niger的果胶酶(SIGMA PS4716)或来自 Aspergillus aculeatus 的果胶酶(SIGMA P2611))与选自由下列酶组成的组中的第二酶制剂组合来自Helix pomatia 的 H-3 型 β -葡糖苷酸酶(SIGMA G8885)；来自Helix pomatia 的 H-2 型 β -葡糖苷酸酶(SIGMA G0876)；来自Helix pomatia 的 HP-2 型 β -葡糖苷酸酶(SIGMA 7017)；来自Helix pomatia 的 H-1 型硫酸酯酶(SIGMA S9626)；与使用单一的酶制剂相比，该组合可以更有效地使甜菊苷水解。如图2所示，来自Helix pomatia(葡萄园蜗牛)的酶使甜菊苷⑴快速裂解为甜茶苷(5)，然后进一步缓慢裂解为甜菊单苷(6)和甜菊醇葡糖苷酯(7)的混合物，随后缓慢裂解为最终的甜菊醇(3)。不论酶主要包含硫酸酯酶还是葡糖苷酸酶活性，均观察到这种模式。活性的果胶酶和Cytolase使甜菊苷(I)缓慢裂解为甜茶苷(5)，然后较快速地水解为6/7，最终裂解为甜菊醇(3)。CYTOLASE PCL5 和活性的果胶酶通过类似的活性使甜菊苷(I)裂解为甜菊醇。CYTOLASE PCL5 被用于进一步开发，因为这种酶可用于食品生产并且易于从DSM得到。发现，与单独使用一种酶相比，来自Helix pomatia的酶与果胶酶或CYTOLASEPCL5 的混合物使甜菊苷更快地裂解并且需要更少量的酶。Helix pomatia酶使第一水解步骤裂解地更快。果胶酶和CYTOLASE PCL5 使后面的水解步骤更快地进行。因此，本发明的另一方面是一种特别优选的酶组合，其为CYTOLASE PCL5 和来自 Helix pomatia 的葡糖苷酸酶 HP2 Sigma G701 7;以及CYTOLASE PCL5 和来自 Helix pomatia 的 H-2 型葡糖苷酸酶 SIGMA G0876。下面所描述的实施例能更好地说明本发明。评估各种酶和酶制剂(被统称为"酶")使甜菊苷和莱苞迪苷A裂解以生产甜菊醇的能力。50mg Stevia提取物RV140-54(19%莱苞迪苷A，19%甜菊苷[w% ])在5ml pH为4. I的缓冲溶液(O. lmol/1 H3P04+Na0H)中溶解，50 μ I酶溶液或IOmg冻干粉；40°C (remI)。结果显示在下面的表I中。表I酶的评估
酶/来源甜菊醇的形成
纤维素酶OnozukaR-IO4d无反应
Merck 102321
纤维素酶A:spergillus niger4d无反应
FLUKA 22178
β-葡聚糖酶来自Helix pomatia 7d少量形成 FLUKA 49103β-葡萄糖苷酶来自杏仁FLUKA4d无反应 49290
β-葡萄糖昔酶m'ger 4d无反应 FLUKA 49291
οι-葡萄糖苷酶V型来自大米 4d无反应 SIGMA G9259
β-葡糖苷酸酶Η-3型Helix4d完全形成
pomatia SIGMA G888权利要求
1.一种生产甜菊醇的方法，其包括使甜菊苷与CYTOLASE PCL5 酶制剂接触，并且回收甜菊醇。
2.如权利要求I所述的方法，其中，所述甜菊苷存在于植物提取物中。
3.如权利要求I或2所述的方法，其中，所述植物提取物是Steviasp.提取物。
4.如权利要求3所述的方法，其中，所述Stevia提取物包含大量甜菊苷。
5.如权利要求1-4中任意一项所述的方法，其中，所述使甜菊苷与CYTOLASEPCL5⑧酶制剂接触的步骤在培养基中活酵母培养物的存在下、在能在培养基中产生甜菊醇的条件下进行。
6.如权利要求1-5中任意一项所述的方法，其进一步包括在升高的温度条件下在培养基中使至少部分剩余的甜菊苷水解，以产生富含甜菊醇的培养基。
7.如权利要求1-6中任意一项所述的方法，其中，所述CYTOLASEPCL5 酶制剂还包含来自Aspergillus sp.的果胶酶。
8.一种酶制剂，其选自由下列组成的组 a)CYTOLASE PCL5 和来自 Helix pomatia 的葡糖苷酸酶 HP2 Sigma G7017 ； b)CYTOLASE PCL5 和来自 Helix pomatia 的 H_2 型葡糖苷酸酶 SIGMA G0876 ;以及 c)来自Helixpomatia 的酶与果胶酶或 CYTOLASE PCL5 。
全文摘要
本发明涉及一种通过使用含有果胶酶的可商购的酶混合物CYTOLASE PCL5使糖苷残基从甜菊苷中裂解而生产甜菊醇的方法。在一些优选的方法中，反应在酵母培养物的存在下进行。还描述了Helix pomatia酶与CYTOLASE PCL5的组合。
文档编号C12P15/00GK102712940SQ201180006633
公开日2012年10月3日 申请日期2011年1月6日 优先权日2010年1月19日
发明者克利斯托弗·维瑞里 申请人:帝斯曼知识产权资产管理有限公司