一种甜菊苷生物转化制备的甜菊糖衍生物、制备方法及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种甜菊苷生物转化制备的甜菊糖衍生物、制备方法及其应用，属于 食品化工技术领域。
【背景技术】
[0002] 甜菊糖是从菊科草本植物甜叶菊的叶、茎中提取出的一种新型天然甜味剂，是一 种天然、绿色、保健的功能食品，它有着芬芳、清凉的味道，还具有甜度高、热能低的特点，其 甜度是蔗糖的200-300倍，而热值仅为蔗糖额1/300,是一种可替代蔗糖非常理想的甜味 剂。随着人类对健康、绿色的重视，甜菊糖被食品科学家称为是未来世界最具发展前景的甜 味剂。
[0003] 甜菊糖被国际医学界认为是人类良好的营养补充剂和保健药品。经大量科学实验 证明，甜菊糖有利于调节血糖和血压，经常食用可调节血糖水平，预防高血压，改善低血压 症状；甜菊糖还具有抑制某些细菌生长和繁殖及阻止其感染的作用，能够治疗感冒和流感 及预防龋齿等病症；甜菊糖能够降低人对糖和脂肪的需求，调节其日常饮食，降低人们对烟 酒的需求，防止了糖尿病、肥胖症、心脏病等疾病的发生；同时，甜菊糖还具有对皮肤修复和 改良作用，它能治疗皮肤疾病，消除皱纹，去除疤痕等。
[0004] 甜菊糖可广泛应用于食品、饮料、调味料、医药、日用化工、酿酒、化妆品等行业，较 使用蔗糖可节省成本约60%，且营养价值高。甜菊糖的稳定性、代谢途径及其安全性已被 深入研究，它已经我国卫生部、轻工业部批准使用，且亦被美国食品药品监督管理局认可为 "GRAS(-般认为是安全的）"的级别。甜菊糖作为蔗糖的天然替代品，其应用前景广阔。
[0005] 甜菊糖虽有着众多优势，但是其严重的苦涩后味，却阻碍了其的广泛应用。目前， 甜菊糖口感的改善可通过酶法生物转化来实现。已有报道，可以利用环糊精糖基转移酶改 性甜菊糖，以改善其口感和味质，但是该酶转移糖基的位置不专一，产物不纯，且其甜度也 严重降低。
[0006] 甜菊双苷向甜菊苷和莱鲍迪苷B的转化以及甜菊苷转化为莱鲍迪苷A和D的反应 等。这些研究相对于甜菊糖的众多组分而言，仍微乎其微，而且其改性后的口感和味质也是 一项庞大的研究。寻求高效的生物转化酶，转化工艺以及新型甜菊糖衍生物仍是甜菊糖未 来的研究趋势。
【发明内容】
[0007] 本发明解决的技术问题是：提出一种以甜菊苷为原料，通过酶法转化生产甜菊糖 衍生物，从而改善其口感，可以较低的成本和较短的生产周期产出优质的甜菊苷生物转化 制备的甜菊糖衍生物、制备方法及其应用。
[0008] 为了解决上述技术问题，本发明提出的技术方案是：一种甜菊苷生物转化制备的 甜菊糖衍生物，结构式如下：
[0009]
[0010] 本发明提出的另一技术方案是：一种甜菊苷生物转化制备的甜菊糖衍生物的制备 方法：以甜菊苷为底物，使所述底物在葡萄糖基供体存在下，在UDP-葡萄糖基转移酶（尿苷 二磷酸葡萄糖基转移酶）的催化作用下反应生成甜菊糖衍生物。
[0011] 优选的，所述的葡萄糖基供体为UDP-葡萄糖或由蔗糖、蔗糖合成酶和UDP组成的 UDP-葡萄糖再生循环体系。
[0012] 优选的，所述的UDP-葡萄糖基转移酶M301，蔗糖合成酶M302,都由南京诺云生物 科技有限公司发酵生产部提供。
[0013] 优选的，UDP-葡萄糖的用量为0· 0135~5. 41g/L;蔗糖的用量为34. 23~68. 46g/ L;蔗糖合成酶的用量按湿菌体计为18. 92~94. 59g/L，
[0014] 优选的，在微生物宿主中表达UDP-葡萄糖基转移酶，所述微生物宿主选自大肠杆 菌、芽胞杆菌、酵母、曲霉菌或毕赤酵母。
[0015] 优选的，所述反应在MgCl2浓度为0~0· 286g/L，温度为20~37°C，pH5. 0~9. 0 的水相体系中进行，反应时间为〇. 5~72h。
[0016] 优选的，所述反应在pH8. 0的Tris-HCl缓冲液中进行。
[0017] 优选的，所述反应的糖基转移酶的添加量为18. 92~227. 03g/L，底物起始浓度为 0· 676 ~54. 05g/L，辅酶的添加量为 0· 0135 ~5. 41g/L。
[0018] 本发明提出的另一技术方案是：一种甜菊苷生物转化制备的甜菊糖衍生物的应 用：可应用于食品，饮料，烟草产品，调味品，日用化工产品，药物组分，营养保健产品，口腔 卫生产品或化妆品。
[0019] 本发明的有益效果：
[0020] (1)所述的葡萄糖基供体可以为UDP-葡萄糖或由蔗糖、蔗糖合成酶和UDP组成的 UDP-葡萄糖再生循环系统。其中，优选由蔗糖、蔗糖合成酶和UDP组成的UDP-葡萄糖再生 循环系统，UDP-葡萄糖价格昂贵，采用UDP-葡萄糖再生循环系统可以大幅度的降低生产成 本。
[0021] (2)将反应所用的全部原料加入到反应液中，混匀后，置于设定的参数下，摇床震 荡反应，反应结束时其产物转化效率可达90%以上。通过对反应液分离提纯处理即可获取 达到要求的甜菊糖衍生物NY101产品。一个具体的分离提纯方法是先经过树脂分离处理， 再经乙醇反复结晶纯化，按照该提纯方法，可获得纯度高达95%的甜菊糖衍生物NY101产 品。
[0022] (3)蔗糖作为原料之一，提供糖基，由于其物理化学性质与甜菊糖及其衍生物差异 较大，故反应后可以采用树脂分离和结晶等方式去除未反应的蔗糖和反应副产物果糖。
[0023] (4)本发明以甜菊苷、蔗糖为原料，利用生物转化方法在所述参数下反应获取甜菊 糖衍生物NY101产品，生产工艺绿色安全，且生产成本低、周期短，极大的提高产品的竞争 力。由于本发明操作简便，转化效率高，提纯容易，所得产品纯度高，可用于食品与饮料业， 具有重要的应用价值。
【附图说明】
[0024] 下面结合附图对本发明的作进一步说明。
[0025] 图1 NY101的HPLC谱图及其MS谱图
[0026] 图2 NY101的核磁氢谱图
[0027] 图3 NY101的核磁碳谱图
[0028]图 4 NY101 的二维COSY谱图
[0029]图 5 NY101 的二维HMQC谱图
[0030]图 6 NY101 的二维HMBC谱图
【具体实施方式】
[0031] 本发明主要提供两条制备甜菊糖衍生物NY101的路线：
[0032]路线一：
[0033]
[0034]
[0035]
[0036]
[0037] 实施例1:
[0038] 重组大肠杆菌的构建及诱导表达
[0039] 利用分子生物学和基因工程技术等获得含有目的基因的重组大肠杆菌表达菌株， 然后将重组大肠杆菌发酵培养，诱导表达制备含有目的蛋白的重组细胞。其具体步骤如 下：
[0040] 1)合成所需的引物片段，通过PCR扩增获得所需的UDP-葡萄糖基转移酶M301编 码DNA片段，并通过同源重组技术，整合到pNYK表达载体的表达框中。
[0041] 2)将重组质粒转化到大肠杆菌中，获得含有目的基因的工程菌J301。
[0042] 3)将1ml工程菌J301置于TB培养基中，250rpm、37°C振荡培养至0D600 = 1. 0， 加入终浓度为0.ImMIPTG于25°C振荡培养16h。诱导结束后以10000g，5min离心收集细 胞，置于-8〇°C储存备用。得到了含有M301蛋白的菌体。
[0043] 同样的，制备出含有蔗糖合成酶M302蛋白的菌体。
[0044] 实施例2 :
[0045] 以甜菊苷（stevioside)为底物酶法直接制备NY101 (路线一）
[0046] 取实施例1中的菌体M301沉淀，湿菌体重为35mg，用无菌水重悬细胞，并于冰浴中 超生波破碎细胞，即为反应所用的粗酶液。精密称取样品，配制成1. 85mL体系，其中甜菊苷 (stevioside)的终浓度 2. 70g/L、UDP-葡萄糖为 2. 70g/L，并加入 0· 286g/L的MgCl2;然后 加入粗酶液，并加入Tris-HCl缓冲液（0. 1M，pH8. 0)至体系为1. 85ml，起始反应。37°C恒温 摇床以150rpm振荡24h，100°C煮沸终止反应。13000g离心lOmin，取上清作为样品。使用 LC-MS方法检测反应体系中NY101的含量。实验结果表明，NY101的转化率约为73%。
[0047] 实施例3:
[0048] 最佳金属离子浓度的确定
[0049] 取实施例1中的菌体M301沉淀35mg，按照实施例2中的方法，转移至5ml离 心管中，加入终浓度为2. 70g/L的甜菊苷，UDP-葡萄糖为2. 70g/L及MgCl2，并加入0. 1M Tris-HCl缓冲液（pH8. 0)。按上述方法，取平行样，加入1%(：12的终浓度分别为0、0.